Пептиды-иммуногены и вакцина "эпивакэбола" против лихорадки эбола с использованием указанных пептидов

Пептиды-иммуногены и вакцина "эпивакэбола" против лихорадки эбола с использованием указанных пептидов

Реферат

Изобретение относится к разработке профилактических препаратов, а именно к получению вакцины против лихорадки Эбола, и может быть использовано в медицине для профилактики этого заболевания у людей.

Общая характеристика лихорадки Эбола и эболавирусов

В соответствии с современной классификацией заболевание лихорадкой Эбола вызывают эболавирусы, относящиеся к роду Ebolavirus, семейства Filoviridae. Род Ebolavirus включает в себя 5 видов, отличающихся по антигенной структуре, вирулентности и ареалу распространения: Бундибуджио эболавирус (Bundibugyo ebolavirus, BDBV), Рестон эболавирус (Reston ebolavirus, RESTV), Судан эболавирус (Sudan ebolavirus, SUDV), Тай Форест эболавирус (TaiForest ebolavirus, TAFV) и Заир эболавирус (Zaire ebolavirus, EBOV) [http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp]. Геном эболавирусов представлен молекулой односпиральной рибонуклеиновой кислоты (РНК) негативной полярности протяженностью около 19000 нуклеотидов, молекулярная масса РНК составляет 4,0 х 10⁶ Да. Вирион формируют 7 функциональных белков: нуклеопротеин (NP), мембрано-ассоциированный белок (VP24), белки нуклеокапсида (VP30; VP35-кофактор полимеразы), матриксный белок (VP40), РНК-зависимая РНК-полимераза (L) и гликопротеин (GP). Каждый из генов кодирует 1 белок, за исключением GP, который кодирует sGPandssGP. Углеводы гликопротеины GP1 и GP2, ферменты РНК-полимераза; транскриптаза. Молекулярная масса вириона составляет 300–600 МДа. Наружный диаметр частиц равен 70-80 нм. Длина вирусных частиц, намного превышая их диаметр, может достигать 14000 нм при среднем значении 650 нм. Снаружи вирион покрыт липопротеидной мембраной толщиной примерно 20 нм, на которой на расстоянии 10 нм друг от друга располагаются спикулы длиной 7-10 нм.

Агент относится к I группе патогенности по классификации Роспотребнадзора и вызывает тяжелое заболевание лихорадку Эбола (англ. Ebola Haemorrhagic Fever, EHF или англ. Ebola virus disease, EVD, лат. Ebola febris haemorrhagica). Заболевание начинается остро с появлением лихорадки, диареи, мышечных болей, головной боли, боли в горле и животе. Позднее появляется сухой кашель и колющие боли в области грудной клетки, развивается обезвоживание организма, рвота, появляется геморрагическая сыпь (примерно у половины заболевших) вместе со снижением функционирования печени и почек. В 40-50 % случаев начинаются кровотечения из желудочно-кишечного тракта, носа, влагалища и десен. Лабораторные тесты выявляют низкие уровни белых кровяных клеток и тромбоцитов наряду с повышенным содержанием ферментов печени. Инкубационный период находится в диапазоне от 2 до 21 дней, но может зависеть от способа заражения: 5-7 дней при попадании вируса через поврежденные кожные покровы и в среднем 9 дней после попадания инфицированных биологических жидкостей на слизистую [Leligdowicz A., Fischer W.A., Uyeki T.M.et al. Ebola virus disease and critical illness// Critical Care (2016) 20:217, DOI 10.1186/s13054-016-1325-2].

Летальность колеблется от 25% до 90%. При инфицировании эболавирусом Заир погибают до 90 % больных, эболавирусом Судан – около 50 %, эболавирусом Бундибуджио – от 25 до 55 %. Смертность среди инфицированных эболавирусом Тай Форестне неизвестна. О летальных исходах заболевания, вызванного эболавирусом Рестон, сообщений нет. Вместе с тем следует отметить, что показатели летальности, вероятно, существенно завышены, что связано с недостаточным выявлением легких и бессимптомных форм заболевания, а также трудностями в проведении дифференциальной диагностики с эндемичными на территории Африканского континента болезнями, имеющими сходные клинические симптомы. О существовании стертых и бессимптомных форм лихорадки Эбола свидетельствует наличие широкой иммунной прослойки у населения, а также выявление следов циркуляции возбудителя среди проживающих на территориях, где случаи заболевания лихорадкой Эбола никогда не регистрировались.

По мере развития заболевания беспрепятственная репликация вируса приводит к апоптозу лимфоцитов и высвобождению в большом количестве медиаторов воспаления («цитокиновый шторм»). Избыточная и неконтролируемая воспалительная реакция обусловливает массивное поражение эндотелия сосудов, усугубляя ДВС-синдром и полиорганную недостаточность.

Эболавирусы, попадая в организм, запускают цепь реакций, приводящих к иммуносупрессии на уровне различных звеньев иммунитета. Например, белки VP35 и VP24 с использованием разных механизмов блокируют продукцию интерферона [Eric C. Dunham E.C., Banadyga L., Groseth A. et al. Assessing the contribution of interferon antagonism to the virulence of West African Ebola viruses//Nature Communications 6, Article number: 8000 (2015), doi:10.1038/ncomms9000]. Выработка вируснейтрализующих антител носит отсроченный характер, у умерших от лихорадки Эбола антитела класса G обнаруживают редко [Broadhurst M.J., Brooks T.J.G., Pollock N.R. Diagnosis of Ebola virus disease: past, present, and future// Clin. Microbiol. Rev. 2016, 29:773–93,doi:10.1128/CMR.00003-16].

Îáîëî÷å÷íûé ãëèêîïðîòåèí GP âèðóñà EBOV, îáåñïå÷èâàþùèé ðåöåïòîð-îáóñëîâëåííóþ ñâÿçü âèðóñà ñ êëåòêîé-ìèøåíüþ, ÿâëÿåòñÿ îñíîâíîé ìèøåíüþ ïðè ñîçäàíèè âàêöèí è èíäóêöèè íåéòðàëèçóþùèõ àíòèòåë. Ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèé óêàçûâàþò íà òî, ÷òî ãóìîðàëüíûé îòâåò ó áîëüøèíñòâà âûæèâøèõ ïðè ëèõîðàäêå Ýáîëà íàèáîëåå âûðàæåí äëÿ ýïèòîïîâ ãëèêîïðîòåèíà GP (Becquart P etal. Identification of continuous human B-cell epitopes in the VP35, VP40, nucleoprotein and glycoprotein of Ebola virus//PLoS One. 2014,10;9(6):e96360). Ýòîò áåëîê îðãàíèçîâàí â ôîðìå òðèìåðà, ñîñòîèò èç äâóõ ñóáúåäèíèö, à èìåííî âíåêëåòî÷íîé ñóáúåäèíèöû GP1, êîòîðàÿ ïðèêðåïëåíà ê îáîëî÷êå âèðèîíà ÷åðåç ÿêîðü ñóáúåäèíèöû GP2. GP1 ÿâëÿåòñÿ îòâåòñòâåííûì çà âçàèìîäåéñòâèå êëåòî÷íûìè ðåöåïòîðàìè, â òî âðåìÿ êàê GP2 òðåáóåòñÿ äëÿ ñëèÿíèÿ îáîëî÷êè âèðèîíà è ìåìáðàíû êëåòêè. Âèðóñíûé áåëîê GP ýêñïðåññèðóåòñÿ íà ïîâåðõíîñòè âèðèîíà è íà ìåìáðàíå èíôèöèðîâàííûõ êëåòîê è ìîæåò, òàêèì îáðàçîì, ÿâëÿòüñÿ èäåàëüíîé ìèøåíüþ äëÿ íåéòðàëèçóþùèõ àíòèòåë.

Известно, что белок GP содержит не менее пяти эпитопов, которые способны индуцировать нейтрализующие антитела. Иммунореактивные пептиды GP распределены в пяти регионах, расположенных на позициях 41-67, 93-127, 201-251, 301-359 и 381-411. Два из этих регионов относятся к домену, расположенному в С-концевой части GP1, который содержит высоко N- и О-гликозилированный муциноподобный домен. Этот домен чрезвычайно велик и составляет более половины молекулярной массы GP белка. Нейтрализующие антитела, реагирующие с муциноподобным доменом, защищают мышей от летальной Эбола инфекции (Wilson J.A., Hevey M., Bakken R. et al.Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus// Science, 2000, 287: 1664–6). Интересно, что две иммуногенные области в положениях 381-411 и 469-483 содержат три линейных эпитопа (ао 401-417, 389-405 и 477-493), с которыми связываются протективные антитела. Кроме того, в работе Becquart P., показана большая IgG специфическая иммунодоминантная область в муциноподобном домене GP, (аминокислотные остатки от 301 до 359). Другие три иммуногенные области в GP расположены в GP1 на «чаше» вирусной поверхности тримера, образованной тремя GP1 субъединицами. Ответ IgG охватывает большую площадь поверхности «чаши» у бессимптомных пациентов, чем у выживших. Две из трех иммуногенных областей расположены в потенциальных сайтах связывания с клетками-хозяевами, в том числе район 54-201 (ManicassamyB., WangJ., JiangH., RongL.ComprehensiveanalysisofebolavirusGP1 inviralentry// J.Virol.2005, 79: 4793–805; Brindley M.A., Hughes L., Ruiz A. et al. Ebola virus glycoprotein 1: identification of residues important for binding and postbinding events// J.Virol. 2007, 81:7702–9).

Ранее было также показано, что сыворотки от лиц с бессимптомным течением заболевания реагируют с тремя иммунодоминантными доменами аминокислотных остатков 189-207, 213-235 и 289-319 белка VP40, в то время как сыворотки выживших реагируют гораздо слабее с этим белком. Большинство иммунодоминантных доменов VP40 находится внутри вириона и не подвергается внешнему воздействию специфических рецепторов или антител, однако результаты, представленные Becquart P., 2014, указывают на тот факт, что гуморальный ответ, направленный против этих трех ключевых эпитопов VP40, может способствовать защите людей против лихорадки Эбола. Защитная эффективность гуморального ответа может быть связана не только с вирусной нейтрализацией, но и с индукцией антителозависимой клеточной цитотоксичности.

При разработке цельновирионных инактивированных или субъединичных рекомбинантных вакцин против лихорадки Эбола исследователи столкнулись с рядом проблем, которые обусловлены патогенезом этого заболевания, индуцируемой белками вируса Эбола иммуносупрессией и антителозависимым усилением инфекции. Недавние исследования позволяют предположить, что гуморальный иммунный ответ не является достаточным для защиты от этой инфекции, поэтому для ее обеспечения необходимо его сочетание с активацией CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Кроме того, показано, что некоторые эпитопы белка GP способны индуцировать антителозависимое усиление экспериментальной инфекции у приматов.

Ðåøèòü ýòè ïðîáëåìû âîçìîæíî ñ ïîìîùüþ ðàçëè÷íûõ ìåòîäîâ: îáðàòíîé ãåíåòèêè, ñîçäàíèåì ÄÍÊ-âàêöèí, ãåíåòè÷åñêèõ âàêöèí, âàêöèí íà îñíîâå ÂÏ×, ïîëèýïèòîïíûõ âàêöèí. Îäíàêî ñîõðàíÿåòñÿ îäíà ïðîáëåìà äëÿ ðàçëè÷íûõ òèïîâ âàêöèí – âåðîÿòíîñòü èíäóöèðîâàòü èììóííûé îòâåò ñ ïàòîëîãè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè, íàïðèìåð àíòèòåëîçàâèñèìîå óñèëåíèå èíôåêöèè, ÷òî õàðàêòåðíî äëÿ íåêîòîðûõ âèðóñíûõ èíôåêöèé, âêëþ÷àÿ âèðóñ Ýáîëà. Àëüòåðíàòèâíûì ïîäõîäîì ê èììóíèçàöèè â ýòîì ñëó÷àå ìîæåò ñëóæèòü èììóíîãåí â âèäå ñèíòåòè÷åñêèõ ïåïòèäíûõ ýïèòîïîâ, êîòîðûå èíäóöèðóþò òðåáóåìûé èììóííûé îòâåò, à íåæåëàòåëüíûå ó÷àñòêè ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ñïîñîáíûå âûçâàòü ïîáî÷íûå ýôôåêòû, èñêëþ÷åíû èç ñîñòàâà ïåïòèäíîãî èììóíîãåíà. Òàêèå âàêöèíû áîëåå áåçîïàñíû, ÷åì äðóãèå âàðèàíòû âàêöèí, ïîñêîëüêó îíè ïîëíîñòüþ ñèíòåòè÷åñêèå. Íèçêîìîëåêóëÿðíûå ñèíòåòè÷åñêèå ïåïòèäû, íåêîíúþãèðîâàííûå ñ íîñèòåëåì, êàê ïðàâèëî, íå ñïîñîáíû âûçûâàòü èììóííûé îòâåò.  êà÷åñòâå íîñèòåëåé èñïîëüçóþòñÿ ïðèðîäíûå è ðåêîìáèíàíòíûå áåëêè, à òàêæå ëèïîñîìû, âèðóñîïîäîáíûå ÷àñòèöû è äð. Îäíèì èç ðàñïðîñòðàíåííûõ ïðèåìîâ ïîâûøåíèÿ èììóíîãåííîñòè ïåïòèäíûõ àíòèãåíîâ è ñòàáèëèçàöèè èõ êîíôîðìàöèè ÿâëÿåòñÿ ïðèåì, îñíîâàííûé íà êîâàëåíòíîì ñâÿçûâàíèè ïåïòèäîâ ñ êðóïíûìè ìîëåêóëàìè, íàïðèìåð, àëüáóìèíîì (ìîë. ìàññà 67 êÄà), èëè ãåìîöèàíèíîì (KLH, ìîë. ìàññà 6 ÌÄà). Ïåïòèäíûå àíòèãåíû ñâÿçûâàþòñÿ ñ íîñèòåëåì êîâàëåíòíî èëè ïóòåì ôîðìèðîâàíèÿ íåêîâàëåíòíûõ êîìïëåêñîâ. Äåíäðèìåðíûå ñòðóêòóðû êîâàëåíòíîñâÿçàííûõ ïåïòèäîâ ïðîÿâëÿþò âûñîêóþ èììóíîãåííîñòü. Îäíèì èç ïðèìåðîâ äåíäðèìåðíûõ ïåïòèäíûõ ñòðóêòóð ÿâëÿþòñÿ ìíîæåñòâåííûå àíòèãåííûå ïåïòèäû (ÌÀÏ). ÌÀÏ ñîñòîèò èç íåáîëüøîãî èììóíîëîãè÷åñêè èíåðòíîãî ÿäðà èç ðàäèàëüíî âåòâÿùèõñÿ àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ ëèçèíà, ê êîòîðûì êîâàëåíòíî êðåïÿòñÿ ïåïòèäíûå àíòèãåíû. Òàêèì îáðàçîì, ÌÀÏ ñîäåðæèò íåñêîëüêî êîïèé îäèíàêîâûõ èëè îòëè÷àþùèõñÿ àíòèãåííûõ ïåïòèäîâ, êîòîðûå ðàñïîçíàþòñÿ ïðè ôîðìèðîâàíèè èììóííîãî îòâåòà. Ñèíòåçèðîâàííûå ïåïòèäû ìîãóò áûòü ïðèñîåäèíåíû ê ëèïèäíûì ìèöåëëàì èëè ëèïîñîìàì, ÷òî îáåñïå÷èâàåò âûñîêóþ èììóíîãåííîñòü è ðàçëè÷íûå ïóòè ïðîöåññèíãà èììóíîãåíà.

Преимуществом пептидных вакцин перед вакцинами, содержащими полноразмерные белки вируса Эбола, является то, что наличие полноразмерного белка в вакцине приводит к тому, что у вакцинируемого организма образуются антитела, не обладающие защитной функцией, что повышает нагрузку на иммунную систему и может повлиять на увеличение реактогенности препарата, включая реактогенность на собственные белки. Другим отрицательным фактором использования полноразмерного GP белка может быть присутствие в нем последовательности, гомологичной последовательности иммуносупрессивного домена ретровирусов [Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses// FEBS Lett. 1992, 305(3):181-4].

Известными аналогами являются рекомбинантные вакцины против лихорадки Эбола на основе вируса везикулярного стоматита (ВВС) и аденовируса (АДВ) со встройкой GP гена Эбола вируса штамм Заир [Martins K.A., Jahrling P.B, Bavari S., Kuhn J.H. Ebola Virus Disease Candidate Vaccines Under Evaluation in Clinical Trials// Expert Review of Vaccines, 2016, DOI: 10.1080/14760584.2016.1187566]. Вакцина против лихорадки Эбола на основе ВВС-rVSV-ZEBOV пр-ва Merck Sharp&Dohme Corp. New Link Genetics, Public Health Agency of Canada [Kennedy S.B., Neaton J.D., Lane H.C. et al. Implementation of an Ebola virus disease vaccine clinical trial during the Ebola epidemic in Liberia: Design, procedures, and challenges // Clin Trials, 2016, 13(1), 49-56; Henao-Restrepo A.M., Longini I.M., Egger M. et al. Efficacy and effectiveness of an rVSVvectored vaccine expressing Ebola surface glycoprotein: interim results from the Guinea ring vaccination cluster-randomised trial // Lancet, 2015, 386(9996), 857-66] и вакцина против лихорадки Эбола на основе АДВ-Ad26.ZEBOV пр-ва Crucell Holland BV, Johnson & Johnson [Zahn R, Gillisen G, Roos A et al. Ad35 and ad26 vaccine vectors induce potent and cross-reactive antibody and T-cell responses to multiple filovirus species // PLoS One, 2012, 7(12), e44115] при однократном применении эффективно защищают от заболевания, формируя у вакцинированных специфический гуморальный и клеточный ответ.

Однако вакцины на основе рекомбинантных векторов предназначены для использования в очаге инфекции лихорадки Эбола методами кольцевой иммунизации, т.к. могут быть использованы только однократно. При повторном введении сформированный после первой вакцинации иммунный ответ к вирусу-вектору блокирует его размножение в организме, и усиления иммунного ответа на целевой антиген - GP белок эболавируса не происходит. По этой причине вакцины на основе рекомбинантных вирусов, содержащих GP ген эболавируса, рекомендованы в прайм-бустерной схеме иммунизации с другими вакцинами: например, первичное введение проводят вакциной на основе ВВС или АДВ, а вторичное введение – вакциной на основе вируса осповакцины MVA-BN-Filo пр-ва BavarianNordicGmbH / CrucellHolland BV, Johnson&Johnson [Tapia M.D., Sow S.O., Lyke K.E. etal.Use of ChAd3-EBO-Z Ebola virus vaccine in Malian and US adults, and boosting of Malian adults with MVA-BN-Filo: a phase 1, singleblind, randomised trial, a phase 1b, open-label and double-blind, dose-escalation trial, and a nested, randomised, double-blind, placebo-controlled trial // Lancet Infect Dis, 2016, 16(1),31-42] или не реплицирующихся аденовирусов человека Ad5-EBOV пр-во Tianjin CanSino Biotechnology and Beijing, Institute of Biotechnology [Zhu F.C., Hou L.H., Li J.X. et al. Safety and immunogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthy adults in China: preliminary report of a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 trial // Lancet, 2015, 385(9984), 2272-79] и шимпанзе ChAd3.EBOZ / ChAd3.EBO пр-во Glaxo Smith Kline, NIAID [Martins K.A., Jahrling P.B, Bavari S., Kuhn J.H. Ebola Virus Disease Candidate Vaccines Under Evaluation in Clinical Trials // Expert Review of Vaccines, 2016, DOI: 10.1080/14760584.2016.1187566;Stanley D.A., Honko A.N., Asiedu C. et al. Chimpanzee adenovirus vaccine generates acute and durable protective immunity against ebolavirus challenge// Nat Med, 2014, 20(10), 1126-29]. Кроме этого есть еще два отрицательных фактора, влияющих на использование этих вакцин. Первый: вакцины на основе реплицирующихся рекомбинантных векторов вызывают серьезные поствакцинальные осложнения, например введение вакцины rVSV-ZEBOV вызывает артриты, количество такого рода осложнений может достигать 25%. Второй: при использовании вакцины Ad26.ZEBOV важно учесть, что заболевание аденовирусной инфекцией регистрируется на всех континентах, поэтому антитела к аденовирусу присутствуют в сыворотке крови жителей многих стран. Сероконверсия по этому показателю, например, у жителей Африки южнее Сахары (именно в этом регионе Африки регистрируются вспышки и эпидемии лихорадки Эбола) может достигать 40-60%, т.е. у половины жителей этого региона эффективность размножения рекомбинантного аденовируса может быть снижена или полностью подавлена, что не позволит сформировать у этих людей протективного иммунитета против Эбола после введения препарата.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является пептид для вакцины против Эбола [Международная заявка WO 2016/059517, A1, "Peptide for Anti-Ebola Vaccine", опубл. 21.04.2016]. Пептид для вакцины против Эбола представляет собой пептид LWQQWDR из 7 аминокислотных остатков, который спроектирован по результатам компьютерного анализа аминокислотных последовательностей белков 45 штаммов вируса Эбола и всех белков человека так, чтобы не иметь общих с белками человека 5-мерных эпитопов, является консервативным элементом белка VP30 среди 45 штаммов вируса Эбола. Предполагается, что вакцина, содержащая синтетический олигопептид LWQQWDR, будет иммуногенна для человека, поскольку не имеет общих эпитопов с белками человека, по этой же причине не будет вызывать побочных кросс-реакций иммунитета при вакцинации и обладать специфичностью к большинству штаммов вируса Эбола.

Однако в прототипе синтетический пептид, несущий семь аминокислотных остатков из белка VP30, не способен индуцировать нейтрализующие антитела, препятствующие связыванию вируса с клеткой-мишенью, которое осуществляется через белки GP. В прототипе пептид может индуцировать только клеточный иммунный ответ, направленный на инфицированные клетки организма. Для прототипа не показана способность индуцировать иммунный ответ, способный оказывать защитное действия против вируса Эбола.

Техническим результатом изобретения является получение таких пептидов-иммуногенов, которые несут минимально необходимые антигенные детерминанты для формирования специфического иммунного ответа и содержат антигенные участки белка GP вируса Эбола, являющиеся иммуногенными для мышей, морских свинок, приматов и человека, индуцирующие протективный иммунитет у морских свинок и приматов против заражения вирусом Эбола.

Указанный технический результат достигается тем, что получен пептид-иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против лихорадки Эбола, характеризующийся аминокислотной последовательностью PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE (SEQ ID NO: 1), содержащей антигенные эпитопы белка GP вируса Эбола, которые обладают способностью индуцировать образование вируснейтрализующих антител для защиты от развития лихорадки Эбола и не вызывают развитие иммунопатологических состояний.

Указанный технический результат достигается также тем, что получен второй пептид-иммуноген, используемый в качестве компонента вакцины против лихорадки Эбола, характеризующийся аминокислотной последовательностью HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG (SEQ ID NO: 2), содержащей антигенные эпитопы белка GP вируса Эбола, которые обладают способностью индуцировать образование вируснейтрализующих антител для защиты от развития лихорадки Эбола и не вызывают развитие иммунопатологических состояний.

Указанный технический результат достигается также тем, что получена вакцина против лихорадки Эбола, включающая пептиды-иммуногены, согласно изобретения, в качестве пептидов-иммуногенов она содержит смесь пептида-иммуногена, имеющего аминокислотную последовательность: PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE (SEQ ID NO: 1), и пептида-иммуногена, имеющего аминокислотную последовательность HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG (SEQ ID NO: 2). Причем вышеуказанные пептиды в смеси конъюгированы с иммуногенным носителем и сорбированы на фармацевтически приемлемый адъювант.

Смесь пептидов-иммуногенов может иметь соотношение 1:1, в качестве иммуногенного носителя она содержит белок гемоцианин, а в качестве фармацевтически приемлемого адъюванта – гидроокись алюминия.

Пример 1. Получение пептидов-иммуногенов и препарата на их основе

Ïðè ðàçðàáîòêå âàêöèíû, èñïîëüçóÿ ëèòåðàòóðíûå äàííûå î Ò- è Â-êëåòî÷íûõ ýïèòîïàõ ãëèêîïðîòåèíà âèðóñà Ýáîëà, áûëè ðàññ÷èòàíû ñòðóêòóðû 19 ïåïòèäîâ – àíàëîãîâ èììóíîãåííûõ ýïèòîïîâ áåëêîâ âèðóñà Ýáîëà, êîòîðûå çàòåì áûëè ñèíòåçèðîâàíû. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ýòèõ ñèíòåòè÷åñêèõ ïåïòèäîâ, ìîäåëèðóþùèõ ôóíêöèîíàëüíî çíà÷èìûå ó÷àñòêè áåëêîâ âèðóñà Ýáîëà, áûëè ñïðîåêòèðîâàíû òàêèì îáðàçîì, ÷òîáû èñêëþ÷èòü ïðèñóòñòâèå ýëåìåíòîâ, îòâåòñòâåííûõ çà ðàçâèòèå èììóíîïàòîëîãè÷åñêîãî ñîñòîÿíèÿ, íî ñîõðàíèòü ñïîñîáíîñòü èíäóöèðîâàòü îáðàçîâàíèå âèðóñíåéòðàëèçóþùèõ àíòèòåë è îáåñïå÷èòü çàùèòó îò ðàçâèòèÿ ëèõîðàäêè Ýáîëà. Ñèíòåòè÷åñêèå ïåïòèäû èìåþò ðàçìåð îò 23 äî 29 àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ è àíàëîãè÷íû ýïèòîïàì áåëêîâ âèðóñà Ýáîëà.

Ïåïòèäû áûëè ñèíòåçèðîâàíû, äëÿ ïîâûøåíèÿ ñòàáèëüíîñòè è ôîðìèðîâàíèÿ âûðàæåííîãî èììóííîãî îòâåòà îíè áûëè êîíúþãèðîâàíû ñ áåëêîì íîñèòåëåì.  êà÷åñòâå áåëêà íîñèòåëÿ â âàêöèíå áûë èñïîëüçîâàí áåëîê ãåìîöèàíèí (ìîë. ìàññà 6 ÌÄà).  êà÷åñòâå àäúþâàíòà â âàêöèíå èñïîëüçîâàí ãèäðîêñèä àëþìèíèÿ.

Синтез последовательностей проводится с использованием стандартного оборудования и методик твердофазного пептидного синтеза и может быть проведен с использованием любых других методик синтеза аминокислотных последовательностей, например, таких как жидкофазный пептидный синтез, синтез с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (технологии получения рекомбинантных белков), фрагментирование нативного белка с последующим выделением соответствующих фрагментов.

Ниже приведены полученные пептиды:

LPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTD

RSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFR

HPKLRPILLPNKSGKKGNSADLTSPEK GVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKP

GIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKE

FSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIR

RYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESR

ETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTT

PKYIGLDPVAPGDLTMVITQDCDTGHS

GEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFT

ETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGR

PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE

DNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRAD

DTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLD

HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG

GRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEG

CGLRQLANETTQALQLFLRATTELRT

RTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPD

CIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPD

Для конъюгирования пептида на белок-носитель готовится навеска Sulfo SMCC 2,5 мг, растворяется в 500 мкл дистиллированной воды. К 350 мкл белка-носителя (10мг/мл) добавляется 350 мкл Sulfo SMCC (5мг/мл), инкубируется при комнатной температуре в течение часа. Активированный белок-носитель разделяется на колонке 10 мл Sepharose CL4B (Pharmacia Fine Chemicals No IB 28549) в ФСБ, контролируется оптическая плотность при длине волны 280 нм, собирается первый пик. С помощью калибровочных образцов строится калибровочная кривая и определяется концентрация активированного белка-носителя после очистки на колонке. 1 мг пептида растворяется в 250 мкл ФСБ, после чего добавляется активированный белок-носитель, исходя из определенной концентрации, таким образом, чтобы на 1 мг пептида приходилось 0,75 мг белка-носителя. Смесь инкубируется при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего проводится диализ. Конъюгаты пептидов диализуются в физиологическом растворе в течение ночи. Полученные конъюгаты пептида и белка-носителя сорбируются на алюминия гидроксиде для получения готовой лекарственной формы в конечной концентрации 200 мкг пептида в 1,0 мл препарата.

Ïðèìåð 2. Ñêðèíèíã ïðîòåêòèâíûõ ïåïòèäîâ-èììóíîãåíîâ

Êàæäûì èç 19 ïåïòèäîâ, êîíúþãèðîâàííûì ñ áåëêîì ãåìîöèàíèíîì è ñîðáèðîâàííûì íà ãèäðîîêèñü àëþìèíèÿ, âíóòðèìûøå÷íî áûëè âàêöèíèðîâàíû 14-16-ãðàììîâûå ìûøè ICR è áåñïîðîäíûå ìîðñêèå ñâèíêè (âåñ 180-200 ã) ïî ñõåìå äâóêðàòíîé èììóíèçàöèè ñ èíòåðâàëîì 21 ñóò.

Òàáëèöà 1

Иммуногенность и протективность пептидов – аналогов иммуногенных эпитопов белков вируса Эбола при 2-кратной внутримышечной иммунизации мышей и морских свинок дозой 50 мкг/животное

Вид животного	Пептид	Ср. геом. титр антипептидных антител в ИФА	Ср.геом. титр антител в РН	Коэффициент защиты (%)
Мыши	LPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTD	<1:30	н.о.*	н.о.
RSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFR	1:83	н.о.	н.о.
HPKLRPILLPNKSGKKGNSADLTSPEK	1:2786	н.о.	н.о.
GVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKP	1:613	н.о.	н.о.
GIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKE	1:140	н.о.	н.о.
FSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIR	1:630	н.о.	н.о.
RYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESR	1:29261	н.о.	н.о.
ETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTT	1:458	н.о.	н.о.
PKYIGLDPVAPGDLTMVITQDCDTGHS	1:3940	н.о.	н.о.
GEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFT	1:476	н.о.	н.о.
ETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGR	<1:30	н.о.	н.о.
PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE	1:528	н.о.	н.о.
DNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRAD	1:1835	н.о.	н.о.
DTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLD	1:146	н.о.	н.о.
HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG	1:1393	н.о.	н.о.
GRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEG	1:42	н.о.	н.о.
CGLRQLANETTQALQLFLRATTELRT	1:540	н.о.	н.о.
RTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPD	<1:30	н.о.	н.о.
CIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPD	<1:30	н.о.	н.о.
Плацебо**	1:45	н.о.	н.о.
Морские свинки	LPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTD	1:276	<1:10	0
RSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFR	1:414	<1:10	0
HPKLRPILLPNKSGKKGNSADLTSPEK	1:19700	20	0
GVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKP	1:3066	<1:10	0
GIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKE	1:800	<1:10	0
FSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIR	1:3184	<1:10	0
RYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESR	1:204804	<1:10	0
ETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTT	1:3212	<1:10	0
PKYIGLDPVAPGDLTMVITQDCDTGHS	1:15222	34	25
GEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFT	1:3264	<1:10	0
ETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGR	1:219	<1:10	0
PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE	1:2263	28	20
DNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRAD	1:12845	<1:10	0
DTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLD	1:824	<1:10	0
HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG	1:9870	48	80
GRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEG	1:212	<1:10	0
CGLRQLANETTQALQLFLRATTELRT	1:3271	<1:10	0
RTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPD	1:234	<1:10	0
CIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPD	1:247	<1:10	0
Плацебо	<1: 30	<1:10	0

Примечание:

*..н.о – не определялось;

**..в качестве плацебо был использован белок гемоцианин, адсорбированный на гидроокиси алюминия.

Äëÿ êàæäîé èììóíèçàöèè áûëà èñïîëüçîâàíû äîçà ïåïòèäà 50 ìêã/æèâîòíîå (ñì. òàáë.1). ×åðåç 21 ñóò ïîñëå âòîðîé èììóíèçàöèè ó æèâîòíûõ áûëè îòîáðàíû îáðàçöû êðîâè äëÿ îïðåäåëåíèÿ òèòðà ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë â ðåàêöèè èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà. Èììóíèçèðîâàííûå ìîðñêèå ñâèíêè áûëè çàðàæåíû âèðóñîì Ýáîëà øòàìì ÌÑ-7 â äîçå 10-30 ËÄ₅₀ äëÿ ìîðñêèõ ñâèíîê. Äàííûå ýêñïåðèìåíòà ñâåäåíû â òàáëèöó 1.

Для дальнейших исследований выбраны четыре пептида, которые индуцируют нейтрализующие антитела и/или обеспечивают защиту модельных животных от заражения вирусом Эбола.

Пример 3. Оценка влияния пептидов на формирование иммунитета при комбинированном применении

Äëÿ îïðåäåëåíèÿ âëèÿíèÿ ïåïòèäîâ íà ôîðìèðîâàíèå èììóíèòåòà ïðè êîìáèíèðîâàííîì ïðèìåíåíèè èçó÷àëè ÷åòûðå îòîáðàííûõ ïåïòèäà èç 19 ñèíòåçèðîâàííûõ:

1Ï (HPKLRPILLPNKSGKKGNSADLTSPEK),

2Ï (PKYIGLDPVAPGDLTMVITQDCDTGHS),

3Ï (PQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISE) è

4Ï (HHQDTGEESASSGKLGLITNTIAG).

Èììóíèçàöèþ ïðîâîäèëè ëèáî ââîäÿ êàæäîìó æèâîòíîìó êàæäûé èç ïåïòèäîâ â 4 ðàçëè÷íûå òî÷êè òåëà æèâîòíîãî, ëèáî êàæäîìó æèâîòíîìó ñìåñü ïåïòèäîâ â 4 ðàçëè÷íûå òî÷êè òåëà æèâîòíîãî. Îïèñàííûì ñïîñîáîì èììóíèçèðîâàëè 14-16-ãðàììîâûõ ìûøåé ICR è áåñïîðîäíûõ ìîðñêèõ ñâèíîê (âåñ 150-200 ã).

Òàáëèöà 2

Влияния пептидов на формирование иммунитета при комбинированном применении

Вид животного	Схема введения препарата	Пептид	Обратный ср. геом. титр антипептидных антител в ИФА (ДИ95)
Мыши ICR	в 4 точки тела животного раздельно каждым из 4 пептидов	1П	919 (336-2517)
2П	3200 (1258-8139)
3П	132 (79-221)
4П	2111 (873-5104)
в 4 точки тела животного раздельно смесью 4 пептидов	1П	8063 (6342-10252)
2П	4222 (2300-7752)
3П	528 (266-1049)
4П	1056 (464-2403)
Морские свинки	в 4 точки тела животного раздельно каждым из 4 пептидов	1П	3805 (1182-12255)
2П	4525 (3501-5850)
3П	673 (260-1743)
4П	436 (207-920)
в 4 точки тела животного раздельно смесью 4 пептидов	1П	6400 (1773-23104)
2П	9051 (5802-14120)
3П	617 (314-1213)
4П	2263 (930-5507)

Совместное применение мышам 4 пептидов путем иммунизации одному животному в четыре различных участка тела вблизи регионарных лимфоузлов по одному пептидному иммуногену указывает на иммунодоминантные свойства пептидов 2П и 4П и угнетение иммунной реакции на пептиды 1П и 3П. Смесь 4 иммуногенов, примененная на мышах, продемонстрировала иммунодоминирование пептидного иммуногена 1П, тогда как ответ на другие пептиды не отличался от такового в случае раздельной иммунизации (см. табл. 1). Для морских свинок применение смеси 4 пептидных иммуногенов демонстрирует иммунодоминирование пептидов 1П и 2П над пептидами 3П и 4П. Учитывая данные результатов экспериментов по определению титра нейтрализующих антител и протективности (см. табл. 1) в состав заявляемой вакцины был включен пептид 4П. Учитывая тот факт, что иммунодоминантные пептиды 1П и 2П, индуцирующие наивысший уровень пептид-специфических антител и угнетающие действие двух других пептидов, не обеспечивают защиты (пептид 1П) или обеспечивают невысокий уровень протективности 25% (пептид 2П), эти пептиды были исключены из состава вакцины. Пептид 3П был включен в состав заявляемой вакцины, поскольку он обладает наивысшим потенциалом нейтрализации, не является иммунодоминантным и не влияет на индукцию иммунного ответа на пептид 4П.

Пример 4. Определение оптимальной дозы и схемы иммунизации

Äëÿ îïðåäåëåíèÿ îïòèìàëüíîé äîçû èììóíèçàöèè èñïîëüçîâàëàñü ñìåñü ïåïòèäîâ 3Ï è 4Ï â ñîîòíîøåíèè 1:1, êîíúþãèðîâàííûõ ñ áåëêîì ãåìîöèàíèíîì è ñîðáèðîâàííûõ íà ãèäðîîêèñè àëþìèíèÿ â êîíå÷íûõ äîçàõ 10, 50, 100 è 200 ìêã ñìåñè ïåïòèäîâ/0,5 ìë ïðåïàðàòà. Êàæäîé èç âûáðàííûõ äîç âíóòðèìûøå÷íî áûëè âàêöèíèðîâàíû áåñïîðîäíûå ìîðñêèå ñâèíêè (âåñ 180-200 ã). Äëÿ èììóíèçàöèè áûëè âûáðàíû 1-, 2- è 3-êðàòíàÿ ñõåìû ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà ñ èíòåðâàëîì 21 ñóò ïîñëå êàæäîé èììóíèçàöèè. ×åðåç 21 ñóò ïîñëå êàæäîé èììóíèçàöèè ó æèâîòíûõ áûëè îòîáðàíû îáðàçöû êðîâè äëÿ îïðåäåëåíèÿ òèòðà ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë â ðåàêöèè íåéòðàëèçàöèè in vitro è èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà. Ãðóïïû ìîðñêèõ ñâèíîê ïîñëå îäíîêðàòíîãî, äâóêðàòíîãî è òðåõêðàòíîãî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà áûëè çàðàæåíû âèðóñîì Ýáîëà øòàìì ÌÑ-7 â äîçå 30-100 ÁÎÅ/æèâîòíîå.

Òàáëèöà 3

Выбор дозы и схемы применения препарата при 1-, 2- и 3-кратной внутримышечной иммунизации морских свинок дозах 10, 50, 100 и 200 мкг/животное

Вид животного	Доза препарата (мкг/животное)	Ср. геом. титр антипептидных антител (Доверительный интервал 95%)	Коэффициент защиты, (%)
1-кратн.	2-кратн.	3-кратн.	1-кр.	2-кр.	3-кр.
Морские свинки	10	5382(2762–10486)	10763(8466-13685)	18102 (9337-35096	0	30	50
50	3200(1622–6312)	20319(15398-26812)	9510(4861-18607	50	80	80
100	9510(7357–12294)	12800 (7918-20692)	10500(5411-20375)	60	100	100
200	3592(1011–12762)	11637(6659-17769)	5382(2908-9961)	50	100	80
	Плацебо*	< 30	0

Примечание:

* в качестве плацебо был использован белок гемоцианин, адсорбированный на гидроокиси алюминия

Как следует из данных таблицы 3 максимальный – 100%-ный уровень защиты достигался при 2-кратном введении препарата в дозе 100 мкг смеси пептидов/0,5 мл препарата/животное. При использовании этой же схемы иммунизации у животных формировался напряженный гуморальный иммунный ответ. Увеличение дозы препарата или кратности введения не приводило к существенному усилению иммунного ответа, поэтому для дальнейших исследований была выбрана следующая схема вакцинации и доза препарата «ЭпиВакЭбола»: 2-кратное введение в дозе 100 мкг/0,5 мл.

Пример 5. Изучение иммуногенных и протективных свойств препарата «ЭпиВакЭбола» на обезьянах

Для определения иммуногенных и протективных свойств препарата «ЭпиВакЭбола» обезьян 3-кратно иммунизировали дозой 100 мкг/0,5 мл/животное. Через 21 сут после 2-й и 3-й иммунизации у животных были отобраны образцы крови для определения титра специфических антител в реакции нейтрализации in vitro и иммуноферментного анализа. Группы обезьян после двукратного и трехкратного введения препарата были заражены вирусом Эбола штамм Заир в дозе 30-100 БОЕ/животное.

Òàáëèöà 4

Изучение иммуногенных и протективных свойств препарата