Штаммы gardnerella vaginalis (варианты), потенциально значимые для диагностики бактериального вагиноза, и включающая их коллекция штаммов для диагностики бактериального вагиноза

Штаммы gardnerella vaginalis (варианты), потенциально значимые для диагностики бактериального вагиноза, и включающая их коллекция штаммов для диагностики бактериального вагиноза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Работа выполнена в рамках соглашения о предоставлении субсидии №14.607.21.0019 от «05» июня 2014 г. по теме «Разработка молекулярно-генетических тест-систем для оценки патогенности и резистентности возбудителей нозокомиальных и оппортунистических инфекций у матери и новорожденного» (шифр заявки «2014-14-579-0001-065»).

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и молекулярной биологии.

Микробиоценоз влагалища женщин – сложная, динамично развивающаяся, гормонально зависимая экосистема, которая претерпевает изменения в течение всей жизни женщины [1]. Каждый отрезок жизни женщины имеет особенности формирования и состава микробиоты влагалища. Отличительной особенностью вагинальной микробиоты репродуктивного периода является многокомпонентность состава, определяемого ее резидентной и транзиторной составляющими. К облигатным резидентным микроорганизмам влагалища здоровой женщины относятся лактобациллы, которые абсолютно доминируют, составляя 95-98% микробного пула. Основными биологическими свойствами представителей рода Lactobacillus, обеспечивающими колонизационную резистентность вагинального биотопа, являются адгезивная и антагонистическая активность, а также устойчивость к повышенной кислотности (рН) среды. Адгезия определяет способность колонизации слизистой влагалища. Антагонистические свойства лактобацилл связаны с продукцией органических кислот (молочной, уксусной), перекиси водорода и антимикробных субстанций белковой природы, подобных антибиотикам (бактериоцинов) [2, 3]. Транзиторная составляющая микробиоты здоровых женщин, представленная условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), в силу конкурентного сдерживания колонизирует влагалище в низких титрах (порядка 41g КОЕ/мл вагинального отделяемого), и ее присутствие рассматривается как вариант нормы. Под влиянием эндогенных и экзогенных воздействий на организм женщины может происходить нарушение состояния гармоничного равновесия между лактобациллами и УПМ, что приводит к дисбалансу микрофлоры и развитию инфекционного процесса. Наиболее значимыми ифекциями влагалища, вызванными УПМ, считают бактериальный вагиноз (БВ), аэробный вагинит, вульвовагинальный кандидоз, а также их сочетание.

Бактериальный вагиноз - одна из наиболее распространенных вагинальных инфекций у женщин репродуктивного возраста. Частота заболевания варьирует от 10 до 50% в зависимости от популяции женщин [4, 5]. БВ характеризуется как клинический полимикробный невоспалительный синдром, возникающий в результате замены нормальной микрофлоры влагалища (перекись-продуцирующие виды Lactobacillus spp.) на повышенную генерацию многочисленных видов строгих анаэробов (Bacleroides/Prevolella spp., Mobiluncus spp., Veillonella spp. и др.) и G. vaginalis [6]. Установлено, что БВ связан с бесплодием [7], неблагоприятным исходом беременности [8], может увеличить риск заражения венерическими заболеваниями [9], неопластическими процессами в шейке матки, хроническим и послеродовым эндометритом. До сих пор остается дискутабельным вопрос о том, является ли появление симптомов заболевания результатом ассоциативного взаимодействия всех членов микробиоты или влиянием одного из ключевых видов в каждом конкретном случае. Gardnerella vaginalis (G. vaginalis) - единственный микроорганизм, который в 95% случаев встречается в вагинальном тракте женщин с диагнозом БВ как в составе ассоциаций микроорганизмов, так и как моновозбудитель заболевания [10, 11]. У пациенток с рецидивирующим БВ G. vaginalis может встречаться в 100% случаев [12], однако в низких титрах G. vaginalis может колонизировать влагалище здоровых женщин [13, 14]. Особое место занимают инфекционные процессы, ассоциированные с G. vaginalis, но топически не связанные с репродуктивной системой женщин. Описаны случаи инфекций мочевыводящих путей, баланита, уретрита, септицемии в сочетании с пиелонефритом, эндокардитом и септической эмболией в почках и сердце у мужчин [15], васкулита сетчатки [16], острого артрита [17], остеомиелита позвоночника [18]. Недавние исследования показали, что G. vaginalis оснащена большим набором факторов патогенности, что породило всплеск активности в изучении ее этиологической роли в развитии БВ [19, 20]. Быстрое накопление знаний об этом микроорганизме, особенно с развитием молекулярной генетики, позволяющей раскрыть потенциальные возможности этого вида, его генетические особенности и патогенные свойства, позволили заметно продвинуться в понимании патогенеза БВ.

В 1950 году Leopold S [21], а затем Gardner HL и Dukes CH. [22] обнаружили мелкие плеоморфные грамвариабельные палочки в вагинальном отделяемом женщин с БВ. Этот микроорганизм сначала называли Haemophilus vaginalis, впоследствии он неоднократно переименовывался и теперь носит название Gardnerella vaginalis и является единственным представителем рода Gardnerella. На основании филогенетического анализа 16S рРНК G. vaginalis отнесена к семейству Bifidobacteriaceae. Для лучшего понимания роли G. vaginalis в патогенезе БВ, а также для изучения эпидемиологических аспектов этого заболевания проводились многочисленные исследования, направленные на выявление общевидовых свойств и штаммовых различий этого микроорганизма. На ранних этапах изучения у G. vaginalis выявили 7 серологических групп, которые определяли с помощью реакции преципитации, но эта система типирования не нашла широкого применения в клинической практике. Позднее Piot Р. и соавт. [23] предложили простую, легко воспроизводимую схему биотипирования G. vaginalis на основе трех тестов: оценке липазной и β-галактозидазной активности и гидролизе гиппурата. Однако в исследованиях по биотипированию изолятов G. vaginalis, выделенных от пациенток с БВ и здоровых женщин, а также от мужчин - половых партнеров женщин с БВ не доказано преобладания каких-либо биотипов в группах обследованных пациентов. Не выявлено корреляции между экспрессируемыми G. vaginalis факторами вирулентности и каким-либо одним биотипом [24] так же, как не выявлено однозначной взаимосвязи между конкретными биотипами G. vaginalis и особенностями течения БВ. Таким образом, характеристика G. vaginalis по биотипам не может быть использована с диагностической целью, а также для прогнозирования течения БВ.

В последние годы с развитием молекулярно-генетических методов исследования G. vaginalis стала объектом активного изучения. В работе С.J. Yeoman и соавт. [25] в рамках проекта по изучению микробиома человека проведено исследование полного генома трех штаммов G. vaginalis: двух штаммов, выделенных от пациенток с клиническими симптомами БВ (594 - АТСС 14018 и 317 - АТСС 14019) и одного (АТСС 409-05) - от пациентки с бессимптомым течением заболевания. Геном штамма 409-05, выделенного от пациентки с бессимптомным течением заболевания, был значительно меньше и отличался от штамма 317 на 63 белковых гена. Все штаммы оснащены значительным потенциалом вирулентности. В то же время БВ-ассоциированные штаммы кодируют многочисленные белки, которых нет в штамме 409-05, что значительно повышает их патогенный потенциал.

G. vaginalis обладает большим потенциалом вирулентности. Цитолитический токсин вагинолизин (vaginolisin) считается основным и наиболее охарактеризованным фактором вирулентности G. vaginalis. Гемолизин G. vaginalis относится к семейству холестеринзависимых цитолизинов, его литическая активность специфична для эритроцитов человека, нейтрофилов и эндотелиальных клеток [26, 27], кроме того, он обеспечивает проницаемость вагинального эпителия, в том числе для вирионов ВИЧ. Patterson JL и соавт. [5] обнаружили, что среди БВ-ассоциированных микроорганизмов только G. vaginalis способна вызывать лизис эпителиальных клеток. В дополнение к вагинолизину авторы нашли доказательства существования второго гемолитического / цитолитического токсина (TlyA-family hemolysin). Исследование генома G. vaginalis [25] показало, что нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вагинолизин, имеет высокое сходство у штаммов 409-05 и 317 (94% идентичности) и практически идентична у штаммов 594 и 317.

Swidsinski А и соавт. [19], Patterson JL и соавт. [5] показали, что G. vaginalis способна формировать адгезивную биопленку на эпителии влагалища у женщин с БВ. Для биопленок описан феномен кворумной сигнализации - сетевой коммуникации бактерий, координирующих экспрессию генов, в зависимости от условий среды. Синтез молекул кворумной сигнализации осуществляет белок LuxS. При наличии биопленок бактерии выживают при концентрациях Н₂О₂ и молочной кислоты в 4-8 раз более высоких, чем выдерживают отдельные бактерии вне пленок [5]. Установлено, что благодаря матриксу в биопленках активируются множественные механизмы резистентности к антимикробным препаратам, запускающие процесс инактивации антибиотиков. В исследовании C.J. Yeoman и соавт. [25] показано, что штаммы G. vaginalis, выделенные от пациенток с симптомами БВ (317 и 594) и от пациентки с бессимптомным течением БВ (409-05), способны формировать биопленки, что связано преимущественно с II, а также I и IV типами гликозилтрансфераз (GTs), принимающими участие в биосинтезе экзополисахарида, ответственного за образование биопленок. Штамм-комменсал кодирует восемь GT_S, а БВ-ассоциированные штаммы - девять GT_S.

Один из основных факторов вирулентности G. vaginalis - способность к адгезии на вагинальных эпителиальных клетках, осуществляемая с помощью пилей [5], которая является первым шагом в формировании биопленки. При исследовании геномов штаммов G. vaginalis, выделенных от пациенток с клиническими признаками БВ и от женщины с бессимптомным БВ, [25] у всех 3-х штаммов выявлены гены, кодирующие пили I и II типа. Присутствие IV типа препилинпептидазы предполагает, что они также могут кодировать IV тип Flp пилина - псевдопилин.

G. vaginalis способна утилизировать железо из окружающей среды для обеспечения синтеза главным образом железосеропротеидов и цитохромов. В условиях дефицита железа микроорганизмы усиленно продуцируют сидерофоры - специальные пептиды, которые предназначены для связывания из окружающей среды ионов железа. В исследовании Jarosik GP и соавт. [28] БВ-ассоциированные штаммы G. vaginalis (594 и 317) продуцировали сидерофоры. C.J. Yeoman и соавт. [25] выявили ген, кодирующий продукцию фермента изохоризматазы (isochorismatase), участвующий в производстве сидерофоров. Установлено, что штамм 409-05 и БВ-ассоциированные штаммы (594 и 317) G. vaginalis кодируют кислород независимую копропорфириноген III оксидазу, участвующую в разрушении порфиринов, таких как гемоглобин и миоглобин.

Важным свойством G. vaginalis является способность вырабатывать специфические антимикробные белки. C.J. Yeoman и соавт. [25] показали, что все три штамма G. vaginalis (409-05, 594 и 317) имели гены, кодирующие устойчивость к блеомицину, однако только у БВ-ассоциированных штаммов 594 и 317 обнаружены гены, ответственные за устойчивость к неизвестному лантибиотику из группы бактериоцинов, метициллину и аминогликозидам (Lantibiotic resistance ABC trasponer, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase).

Репродуктивный тракт женщин богат гликопротеинами - белками, содержащими в качестве простетической группы до 15% углеводов. Один из них - гликопептид, в состав углеводной части которого входит нейраминовая кислота и ее уксуснокислые эфиры (сиаловые кислоты). Занимая в молекулах этих веществ концевое положение, сиаловые кислоты оказывают значительное влияние на их физико-химические свойства и биологическую активность. Определяя отрицательный заряд молекул гликопротеинов, сиаловые кислоты обуславливают вытянутую форму их молекул и, как следствие, высокую вязкость содержащих эти гликопротеины секретов слизистых оболочек полового тракта. Это обеспечивает защиту слизистых оболочек от механических повреждений и бактериального воздействия. Установлено, что многие БВ-ассоциированные микроорганизмы, в том числе G. vaginalis, способны вырабатывать ферменты (сиалидаза, муциназа), разрушающие гликопротеины защитного слизистого слоя. Вероятно, один из клинических симптомов БВ - жидкие гомогенные выделения - результат деструкции слизистого слоя вагинально-шеечного эпителия. Разрушение муцина - необходимый этап в колонизации вагинальных эпителиальных клеток и вытеснении доминирующих в норме лактобацилл [29]. Кроме того, есть свидетельства, что разрушение вагинальных муцинов приводит к снижению продукции специфического иммуноглобулина А [30]. Существенное отличие среди штаммов (409-05, 594 и 317) - наличие у двух БВ-ассоциированных изолятов генов, обеспечивающих катаболическую деградацию N-ацетилглюкозамина и других компонентов слизи с помощью ферментов (Sialidase A precursor, Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidas), - позволяет предположить, что эти штаммы могут иметь большую возможность к внедрению в слизистые оболочки и это может быть важным в причинно-следственной связи симптомного БВ. В противоположность этому, штамм 409-05, изолированный от пациентки с бессимптомным течением БВ, не имеет такого потенциала.

Все три штамма кодируют гликопротеазы (glycoproteases), позволяя использовать гликопротеины в качестве источника азота.

Исследование патогенного потенциала штаммов G. vaginalis, выделенных из вагинального отделяемого пациенток с симтомами БВ и при бессимптомом течении заболевания, показали, что БВ-ассоциированные штаммы, в сравнении со штаммом-комменсалом, обладают более значимым набором факторов патогенности, определяющим степень выраженности агрессивного их воздействия на макроорганизм.

Анализ литературы показал, что, хотя БВ известен с давних времен, пока не удается существенно продвинуться в понимании механизмов симптомного и асимптомного течения заболевания и его рецидивирования, не представляется возможным прогнозировать эффективность этиотропной терапии.

В настоящее время для диагностики БВ используют критерии Amsel R. [31], которыми врач может пользоваться самостоятельно на амбулаторном приеме. В соответствии с критериями Amsel R. БВ сопровождается увеличением рН влагалищного отделяемого до 4,5 и более, характеризуется положительным аминотестом, наличием «ключевых» клеток и жидкими пенистыми выделениями серовато-беловатого цвета. Симптомы БВ могут включать в себя обильные выделения из влагалища с неприятным запахом и легкое раздражение.

Лабораторная диагностика в зарубежной практике основана на микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по Граму, для оценки качественного и количественного состава микрофлоры по морфологическим и тинкториальным свойствам по методике Nugent R.P. [32]. В нашей стране разработаны методические рекомендации по диагностике БВ [33], медицинская технология [34], используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» - «Фемофлор 16» [35]. Однако указанные методики, позволяющие диагностировать БВ, не дают представления о патогенном потенциале основного возбудителя БВ - G. vaginalis. В настоящее время различают три клинические формы БВ: острый, рецидивирующий и бессимптомно протекающий БВ. Молекулярно-генетические исследования последних лет позволили выявить три генотипа G. vaginalis, отличающиеся патогенным потенциалом [36]. Установлено, что более выраженными патогенными потенциями обладают I и III генотипы, которые коррелируют с клинически выраженной симптоматикой БВ. Генотип II, с меньшим патогенным потенциалом, ассоциируется с асимптомно протекающим БВ.

Задачей настоящего изобретения является создание коллекции штаммов Gardnerella vaginalis, отнесенных методом полногеномного секвенирования к I, II и III генотипам штаммов, ассоциированных с бактериальным вагинозом, для подбора сайтспецифичных праймеров при создании диагностической ПЦР-панели, позволяющей выявлять все три генотипа и оценивать патогенный потенциал Gardnerella vaginalis непосредственно в образцах вагинального отделяемого.

Поставленная задача решена тем, что создана коллекция штаммов Gardnerella vaginalis, выделенных из вагинального отделяемого женщин с верифицированным диагнозом бактериального вагиноза, включающая штамм Gardnerella vaginalis 06/14/0010 (выделен у пациентки с БВ, имеющим яркую клиническую симптоматику и рецидивирующее течение), штамм Gardnerella vaginalis 06/14/0012 (выделен у пациентки с БВ, имеющим яркую клиническую симптоматику, но без зарегистрированных случаев рецидива в течение последнего года) и штамм Gardnerella vaginalis 06/14/0011 (выделен у пациентки с БВ, протекающим бессимптомно), отнесенных методом полногеномного секвенирования соответственно к I, III и II генотипам штаммов, ассоциированных с БВ, у которых изучен патогенный потенциал. Полученная информация об индивидуальных штаммовых особенностях Gardnerella vaginalis будет использована для подбора сайтспецифичных праймеров при создании диагностической ПЦР-панели, позволяющей выявлять все три генотипа и оценивать патогенный потенциал Gardnerella vaginalis непосредственно в образцах вагинального отделяемого, что позволит прогнозировать клиническое течение БВ и вероятность его рецидива.

Штаммы Gardnerella vaginalis 06/14/0010, Gardnerella vaginalis 06/14/0012, Gardnerella vaginalis 06/14/0011, выделеные из вагинального отделяемого пациенток репродуктивного возраста с верифицированным диагнозом БВ, идентифицированы методом полногеномного секвенирования, методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI TOF MS) с помощью масс-спектрометра AutoFlex III с программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks, Германия), методом биохимического типирования с помощью автоматического бактериологического анализатора VITEK 2 с использованием карты VITEK ID-NH (, Франция) и депонированы в Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Московская обл., г. Пущино) под следующими регистрационными номерами:

Штамм Gardnerella vaginalis 06/14/0010 имеет регистрационный номер ВКМ B-3001D

Штамм Gardnerella vaginalis 06/14/0011 имеет регистрационный номер ВКМ B-3002D

Штаммы Gardnerella vaginalis 06/14/0012 имеет регистрационный номер ВКМ B-3003D

Штаммы Gardnerella vaginalis ВКМ B-3001D, Gardnerella vaginalis ВКМ B-3002D, Gardnerella vaginalis ВКМ B-3003D характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Для выделения G. vaginalis из вагинального отделяемого использовали стандартные питательные среды и условия культивирования, адаптированные для этого микроорганизма. Вагинальное отделяемое с использованием метода истощающего штриха засевали на агар Columbia с добавлением 5% бараньей крови (Bio Rad, США) в условия СО₂ инкубатора (Jouan, Франция) или в анаэробного бокса (Jouan, Франция) в атмосферу трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10 %; Н₂ - 10%), а также на прередуцированный агар Schaedler (Conda, Испания) с 5% крови человека в атмосферу трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10 %; Н₂ - 10%) с последующим культивированием при 37°С в течение 48 часов. В зависимости от условий культивирования выделенные штаммы имели культурально-морфологические особенности:

Штамм Gardnerella vaginalis ВКМ B-3001D - колонии, выросшие на колумбийском агаре с добавлением 5% бараньей крови, серые, полупрозрачные, выпуклые, округлой формы с четкими краями без гемолиза или слабой зоной α-гемолиза; колонии, выросшие на агаре Schaedler с добавлением человеческой крови, серые, выпуклые, блестящие, округлой формы с четкими краями с β-гемолизом. Культура Gvaginalis оксидазо- и каталазо-отрицательна;

Штамм Gardnerella vaginalis ВКМ B-3002D - колонии, выросшие на колумбийском агаре с добавлением 5% бараньей крови, серые, полупрозрачные, умеренно выпуклые, округлой формы с четкими краями без гемолиза или слабой зоной α-гемолиза; колонии, выросшие на агаре Schaedler с добавлением человеческой крови, умеренно выпуклые, серые, блестящие, округлой формы с четкими краями, с β-гемолизом. Культура G. vaginalis оксидазо- и каталазо-отрицательна;

Штамм Gardnerella vaginalis ВКМ B-3003D - колонии, выросшие на колумбийском агаре с добавлением 5% бараньей крови, серые, полупрозрачные, выпуклые, округлой формы с четкими краями без гемолиза или слабой зоной α-гемолиза; колонии, выросшие на агаре Schaedler с добавлением человеческой крови, серые с кремовым оттенком, блестящие, выпуклые, округлой формы с четкими краями, с β-гемолизом. Культура G. vaginalis оксидазо- и каталазо-отрицательна.

При микроскопии препаратов, приготовленных из культур Gardnerella vaginalis и окрашенных по Граму, визуализируются:

штамм Gardnerella vaginalis ВКМ B-3001D - плеоморфные грамвариабельные мелкие палочки размером 1,5-2,5 мкм (неподвижные, не образуют спор),

штамм Gardnerella vaginalis ВКМ B-3002D - плеоморфные грамвариабельные мелкие палочки размером 1,5-2,5 мкм (неподвижные, не образуют спор),

штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3003D - плеоморфные грамвариабельные мелкие палочки размером 1,5-2,5 мкм (неподвижные, не образуют спор).

Физиолого-биологические признаки

Все штаммы являются микроаэрофилами, для инкубации требуются условия пониженного содержания кислорода (CO₂ инкубатор) или анаэробные условия-атмосфера трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10%; Н₂ - 10%) (анаэробный бокс). Температурный режим - 37±2°С, оптимальное значение рН питательной среды 7,0-7,3; оптимальное время инкубации - 48 часов.

Биохимические свойства

Способность штаммов утилизировать углеводы и их ферментативную активность оценивали с помощью стандартных биохимических методов, используя 30 биохимических тестов в составе диагностической карты VITEK ID-NH автоматического бактериологического анализатора VITEK 2 (bioMérieux, Франция).

Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3003D утилизирует / ферментирует гликоген, мальтотриозу, D-мальтозу, D-рибозу 2, аргинин, лейцин, фенилаланин, пролин, аланин-фенилаланин-пролиин.

Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3002D утилизирует / ферментирует гликоген, мальтотриозу, D-глюкозу, D-рибозу 2, D-мальтозу, аргинин, лейцин, фенилаланин, пролин, L-лизин, аланин-фенилаланин-пролиин.

Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3001D 397 утилизирует / ферментирует гликоген, мальтотриозу, D-рибозу 2, D-глюкозу, D-мальтозу, аргинин, лейцин, фенилаланин, пролин, L-лизин, аланин-фенилаланин-пролиин.

Штаммы Gardnerella vaginalis BKM B-3002D и Gardnerella vaginalis BKM B-3001D имели идентичный биохимический профиль. Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3003D, в отличие от указанных штаммов, не утилизировал D-глюкозу и не ферментировал L-лизин. Степень соответствия (относительная вероятность) для указанных штаммов составила 91-92%.

Чувствительность к антибиотикам

Чувствительность штаммов G. vaginalis к антибиотикам определяли с помощью Е-тестов (Liofilchem, Италия) с оценкой минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Внутренний контроль качества осуществляли параллельным тестированием исследуемых культур и рефферентного штамма Bacteroides fragilis 25285 (BBL). Полученные результаты интерпретировали в соответствии с рекомендациями NCCLS (США) для облигатно-анаэробных микроорганизмов (M11-А6) (CLSI).

Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3001D чувствителен к аугментину (МПК- 0,125 мкг/мл), цефотаксиму (МПК-0,064 мкг/мл), клиндамицину (МПК- 0,032 мкг/мл), ципрофлоксацину (МПК-1,0 мкг/мл) и устойчив к метронидазолу (МПК->256 мкг/мл). Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3002D чувствителен к аугментину (МПК- 0,047 мкг/мл), цефотаксиму (МПК-0,094 мкг/мл), клиндамицину (МПК- 0,016 мкг/мл), ципрофлоксацину (МПК-0,75 мкг/мл) и устойчив к метронидазолу (МПК->256 мкг/мл). Штамм Gardnerella vaginalis BKM B-3003D чувствителен к аугментину (МПК- 0,064 мкг/мл), цефотаксиму (МПК-0,047 мкг/мл), клиндамицину (МПК- 0,016 мкг/мл), ципрофлоксацину (МПК-0,75 мкг/мл) и устойчив к метронидазолу (МПК->256 мкг/мл).

Способ, условия и питательные среды для размножения штаммов коллекции

Для культивирования штаммов Gardnerella vaginalis BKM B-3001D, Gardnerella vaginalis BKM B-3002D, Gardnerella vaginalis BKM B-3003D использовали агар Columbia с добавлением 5% бараньей крови (Bio Rad, США) в условиях CO₂ инкубатора (Jouan, Франция) или в анаэробном боксе (Jouan, Франция) в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10%; Н₂ - 10%), а также прередуцированный агар Schaedler (Conda, Испания) с 5% человеческой крови в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N₂ - 80%; СО₂ - 10%; Н₂ - 10% при температуре 37±2°С в течение 48 часов.

Способ, условия и состав сред для хранения штаммов коллекции

Штаммы Gardnerella vaginalis BKMB-3001D, Gardnerella vaginalis BKM B-3002D и Gardnerella vaginalis BKM B-3003D могут сохранятся методом лиофилизации и криоконсервации. Оба метода обеспечивают штаммовую чистоту и фено-генотипическую стабильность. Краткосрочное хранение Gardnerella vaginalis, относящейся к категории прихотливых микроорганизмов, методом субкультивирования не рекомендуется. При криоконсервации штаммов Gardnerella vaginalis использовали триптиказо-соевый бульон (Trypcase Soy broth, Bio Rad США) с добавлением 20% криопротектора I типа (глицерина), который стерилизовали автоклавированием в течение 15 минут при давлении 10⁴ Па. Длительность хранения в замороженном виде при -70°С 3 месяца.

Молекулярно-генетические методы

Выделение ДНК

Геномная ДНК выделялась из свежевыращенной культуры, содержащей не менее 10 млн клеток, с помощью лизирования лизоцимом и протеиназой К, а также дальнейшей очисткой ДНК фенол-хлороформной экстракцией. Культура ресуспендировалась в буфере для лизирования (20 мМ Трис-HCl, рН 8; 2 мМ ЭДТА; 1.2% Triton Х-100), к которому добавлялся лизоцим до концентрации 20 мг/мл, и инкубировалась при 37°С 30 минут. Затем к смеси добавлялся SDS до концентрации 1%, а также протеиназа К в количестве 5-10 мкг. Смесь инкубировалась 1 час при 55°С. Фенол-хлорофомная экстрация с переосаждением ДНК спиртами проводилась по стандартной методике.

ПЦР-анализ

Для идентификации ДНК G. vaginalis и установления принадлежности изолятов к I, II и III генотипам использовался метод ПЦР в реальном времени. Олигонуклеотидные праймеры и зонд подбирались к нуклеотидной последовательности консервативного спейсерного участка между генами, кодирующими 16S рибосомальную РНК и 23S рибосомальную РНК. Параметры выбранных праймеров и зонда оценивались с помощью программы Oligo Primer Analysis Software (http://www.oligo.net/). Амплификацию специфического фрагмента генома G. vaginalis проводили в 25 мкл смеси следующего состава: 1х ПЦР-буфер производства ООО «НПФ ДНК-Технология» (17 мМ (NH₄)₂SO₄, 6 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2,5 мМ MgCl₂), 7,5 нМ dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, по 10 пкМ каждого из праймеров и 5 пкМ флюоресцентно-меченного зонда (разработка ООО «НПФ ДНК-Технология», Россия, Москва), и 2.5 ед. Taq-ДНК полимеразы (ООО «НПФ ДНК-Технология», Россия, Москва). Температурно-временной профиль реакции был следующим: стартовое плавление при 95°С 3 мин, далее 50 циклов - 94°С 5 сек, 64°С 30 сек и 72°С 30 сек; окончательная элонгация - 3 мин при 72°С в детектирующем амплификаторе ДТ-96 производства ООО «НПФ ДНК-Технология»

Полногеномное секвенирование

Библиотеки ДНК готовились с помощью наборов Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Life Technologies Thermo Fisher), Ion Xpress Barcode adapters 1-16 (Life Technologies Thermo Fisher) согласно протоколу производителя с рядом модификаций, связанных с GC составом ДНК. Проверка качества библиотек производилась на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent) с наборами HighSense DNA kit (Agilent) согласно протоколу производителя. Постановка эПЦР (эмульсионной ПЦР) и обогащение сфер проводились с наборами Ion OneTouch Template Kit согласно протоколу производителя. Секвенирование проводилось на платформе Ion PGM Torrent с наборами Ion Sequencing Kit и чипами 316vl (все Life Technologies Thermo Fisher) по протоколу производителя.

Биоинформационный анализ данных

Сборку коротких прочтений (ридов) в последовательности большей длины (контиги) осуществляли с помощью программного обеспечения Mira3. При сборке использовались следующие параметры: "genome, de novo, accurate". Поиск и аннотация генов проводились с помощью автоматического аннотатора RAST. Поиск генов резистентности проводили в собранных в контиги геномах с помощью инструмента ResFinder 2.1 (https://cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/) с минимально допустимой степенью сходства 90% и минимальной длиной перекрытия последовательностей 60%. Поиск генов патогенности проводился в собранных в контиги геномах с помощью программы Blast (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Минимально допустимой степенью сходства считали 90%, а минимальной длиной перекрытия последовательностей 60%.

В настоящее время опубликован полный сиквенс четырех штаммов G. vaginalis: G. vaginalis АТСС14018, G. vaginalis ATCC14019, G. vaginalis HMP9231, G. vaginalis 409-05 (референс-штаммы).

Нами сделано полногеномное секвенирование трех уникальных штаммов G. vaginalis, входящих в коллекцию: G. vaginalis ВКМ B-3001D, G. vaginalis ВКМ B-3002D и G. vaginalis ВКМ B-3003D. Исследование нуклеотидной последовательности консервативного спейсерного участка между генами, кодирующими 16S рибосомальную РНК и 23S рибосомальную РНК, позволило отнести эти три штамма к трем разным группам - генотипам. Штамм G. vaginalis ВКМ B-3001D относился к I генотипу, штамм G. vaginalis ВКМ B-3002D - ко II генотипу, а штамм G. vaginalis ВКМ B-3002D - к III генотипу.

Сравнительный анализ этих штаммов с четырьмя референс-штаммами позволил выявить ряд отличий.

Два штамма из трех (G. vaginalis ВКМ B-3002D и G. vaginalis ВКМ B-3003D) имеют уникальную комбинацию генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, отличающуюся от комбинаций у референс-штаммов. У третьего штамма, G. vaginalis ВКМ B-3001D, уникальная для других двух штаммов, входящих в коллекцию, комбинация полностью совпадает с одним из референс-штаммов (G. vaginalis АТСС14019). Имеющиеся у нас данные позволяют предполагать, что на степень патогенности штамма G. vaginalis в большей мере оказывают влияние не какие-то отдельные факторы, обуславливающие патогенность и резистентность штаммов по определенным признакам, а именно совокупность, комбинация таких факторов, обуславливающая кумулятивный эффект. При этом ряд генов у штамма в обязательном порядке должен присутствовать, а ряд генов в обязательном порядке отсутствовать в геноме.

Комбинация генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичная для штамма G. vaginalis ВКМ B-3001D:

Vaginolisin, TlyA-family hemolysin, Sialidase A precursor, Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase, O-Sialoglycoprotein endopeptidase, M22-family glycoprotease, MATE-family multidrug efflux permease, Lantibiotic resistance ABC trasporter, Methicillin resistance protein, Multidrug resistance antiporter, Multidrug resistance ABC transporter 532, Multidrug resistance ABC transporter, Bleomycin hydrolase, Aminoglycoside phosphotransferase, DedA-family protein, Family 1 glycosyltransferase 1, Family 2 glycosyltransferase 1, Family 2 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 5, Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7, Family 2 glycosyltransferase 8, Family 4 glycosyltransferase, Glycosyltransferase (unclear family), Rib-family surface protein

Обязательное отсутствие ряда генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичных для штамма G. vaginalis BKM В-3001D:

Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3, Family 2 glycosyltransferase 4.

Штамм G. vaginalis BKM B-3001D проявляет наибольшую патогенность. Мы связываем это с тем, что этот штамм содержит наиболее полный набор генов. В результате сравнения штамма G. vaginalis BKM B-3001D с референс-штаммами показано, что комбинация генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, полностью совпадает с комбинацией генов у референс-штамма G. vaginalis АТСС14019 и сильно отличается от других референс-штаммов. Референс-штамм G. vaginalis АТСС14019 также проявляет высокую патогенность и также содержит практически полный набор генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, поэтому только на основании данного критерия выявить отличия штамма G. vaginalis BKM B-3001D от референс-штамма G. vaginalis АТСС 14019 не представляется возможным.

Комбинация генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичная для штамма G. vaginalis BKM B-3002D: Vaginolisin, TlyA-family hemolysin, O-Sialoglycoprotein endopeptidase, M22-family glycoprotease, MATE-family multidrug efflux permease, Multidrug resistance antiporter, Multidrug resistance ABC transporter 532, Multidrug resistance ABC transporter, Bleomycin hydrolase, DedA-family protein, Family 1 glycosyltransferase 1, Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 1, Family 2 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3, Family 2 glycosyltransferase 4, Family 4 glycosyltransferase, Glycosyltransferase (unclear family)

Обязательное отсутствие ряда генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичных для штамма G. vaginalis BKM B-3002D:

Sialidase A precursor, Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase, Lantibiotic resistance ABC trasponer, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase, Family 2 glycosyltransferase 5, Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7, Family 2 glycosyltransferase 8, Family 4 glycosyltransferase, Rib-family surface protein

При сравнении комбинации генов у штамма G. vaginalis BKM B-3002D с референс-штаммами выявлены следующие отличия:

- Набор генов у этого штамма значительно меньше, чем у референс-штамма G. vaginalis АТСС14019. В отличие от референс-штамма G. vaginalis АТСС14019 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Sialidase A precursor, Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase, Lantibiotic resistance ABC trasporter, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase, Family 2 glycosyltransferase 5, Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7, Family 2 glycosyltransferase 8, Rib-family surface protein, но содержит гены Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3 и Family 2 glycosyltransferase 4.

- В отличие от референс-штамма G. vaginalis 409-05 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Alpha-mannosidase, Lantibiotic resistance ABC trasporter и Rib-family surface protein.

- В отличие от референс-штаммов G. vaginalis АТСС14018 и G. vaginalis HMP9231 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidas, Alpha-mannosidase, Lantibiotic resistance ABC trasporter, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase Family 2 glycosyltransferase 5, Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7 и Family 2 glycosyltransferase 8, но содержит гены Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3 и Family 2 glycosyltransferase 4.

Комбинация генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичная для штамма G. vaginalis BKM B-3003D: Vaginolisin, TlyA-family hemolysin, Sialidase A precursor, O-Sialoglycoprotein endopeptidase, M22-family glycoprotease, MATE-family multidrug efflux permease, Lantibiotic resistance ABC trasporter, Multidrug resistance antiporter, Multidrug resistance ABC transporter 532, Multidrug resistance ABC transporter, Bleomycin hydrolase, DedA-family protein, Family 1 glycosyltransferase 1, Family 2 glycosyltransferase 1, Family 2 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 5, Family 4 glycosyltransferase, Glycosyltransferase (unclear family)

Обязательное отсутствие ряда генов, ассоциированных с факторами патогенности и резистентности, специфичных для штамма G. vaginalis BKM В-3003D: Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase, Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3, Family 2 glycosyltransferase 4, Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7, Family 2 glycosyltransferase 8, Rib-family surface protein

При сравнении комбинации генов у штамма G. vaginalis ВКМ B-3003D с референс-штаммами выявлены следующие отличия:

- В отличие от референс-штамма G. vaginalis АТСС 14019 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase Methicillin resistance protein Aminoglycoside phosphotransferase Family 2 glycosyltransferase 6, Family 2 glycosyltransferase 7, Family 2 glycosyltransferase 8, Rib-family surface protein.

- В отличие от референс-штамма G. vaginalis 409-05 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Alpha-mannosidase, Family 1 glycosyltransferase 2, Family 2 glycosyltransferase 3, Family 2 glycosyltransferase 4, Rib-family surface protein, но содержит гены, кодирующие продукты: Sialidase A precursor и Family 2 glycosyltransferase 5.

- В отличие от референс-штаммов G. vaginalis АТСС14018 и G. vaginalis НМР9231 этот штамм не содержит гены, кодирующие продукты: Alpha-L-phucosidase, Beta-galactosidase, Alpha-mannosidase, Methicillin resistance protein, Aminoglycoside phosphotransferase и Family 2 glycosyltransferase 6, но содержит гены, кодирующий Sialidase A precursor.

Штамм G. vaginalis ВКМ B-3001D, несмотря на то, что имеющаяся у него комбинация основных факторов патогенности и резистентности совпадает с комбинацией факторов у референс-штамма G. vaginalis АТСС14019, тем не менее, имеет четкие различия в нуклеотидной последовательности спейсерного участка между генами, кодирующими 16S рибосомальную РНК и 23 S рибосомальную РНК. Для двух других штаммов, входящих в коллекцию, также выявлены различия в этом сайте ДНК. Исследования нуклеотидной последовательности консервативного спейсерного участка между генами, кодирующими 16S рибосомальную РНК и 23 S рибосомальную РНК, широко распространены и используются для видовой и субвидовой идентификации прокариотических организмов.

При сравнении этих нуклеотидных последовательностей с аналогичными последовательностями у референс-штаммов с помощью программы Blast для попарного выравнивания последовательностей (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) выявлено, что последовательность спейсерного участка, специфичная для G. vaginalis ВКМ B-3001D, имеет степень сходства с аналогичным участком у штаммов G. vaginalis АТСС 14018, G. vaginalis АТСС 14019 и G. vaginalis НМР923 - 99%, G. vaginalis 409-05 - 89%.

Последовательность спейсерного участка, специфичная для G. vaginalis ВКМ В-3002D, имеет степень сходства с аналогичным участком у штаммов G. vaginalis АТСС 14018 и G. vaginalis АТСС 14019 - 89%, G. vaginalis НМР923 - 90%, G. vaginalis 409-05 -99%.

Последовательность спейсерного участка, специфичная для G. vaginalis ВКМ В-3003D, имеет степень сходства с аналогичным участком у штаммов G. vaginalis АТСС 14018 и G. vaginalis АТСС 14019 - 88%, G. vaginalis НМР923 - 89%, G. vaginalis 409-05 -91%.

Сходство в нуклеотидных последовательностях штаммов G. vaginalis, входящих в коллекцию: G. vaginalis ВКМ B-3001D, G. vaginalis ВКМ B-3002D и G. vaginalis ВКМ В-3003D и референс-штаммов, как показано выше, не полное и составляет 88-99%. Таким образом, в последовательности спейсерного участка имеются различия, которые мы предлагаем использовать в качестве основы для подбора сайтспецифичных праймеров при разработке ПЦР-методики для быстрого и корректного выявления всех трех генотипов с целью разработки тактики лечения больных в конкретных случаях.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Результаты определения генотипа Gardnerella vaginalis и гена, ответственного за продукцию сиалидазы (Gvsi) у женщин репродуктивного возраста с верифицированным диагнозом