Линии трансгенной сои, генетическое событие 8264.42.32.1, устойчивое к гербицидам с пакетированными генами на его основе, и их детектирование

Линии трансгенной сои, генетическое событие 8264.42.32.1, устойчивое к гербицидам с пакетированными генами на его основе, и их детектирование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке, в соответствии со ст. 35 Кодекса законов США, §119(е), испрашивается преимущество предварительной заявки рег. № 61/507444, поданной 13 июля 2011, и заявки 61/515634, поданной 5 августа, 2011. Эти заявки во всей своей полноте и во всех целях вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Глифосат (N-фосфонометилглицин), гербицид широкого спектра действия, ингибирует 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазу (EPSPS), то есть фермент пути метаболизма шикимовой кислоты, под действием которого в клетках растений продуцируются незаменимые ароматические аминокислоты. Ингибирование EPSPS является эффективным способом нарушения синтеза белков, и тем самым, уничтожения пораженных клеток растений. Поскольку глифосат не обладает селективностью по отношению к клеткам растений, то он уничтожает как сорняки, так и культурные растения. Таким образом, он может быть использован в сельскохозяйственном производстве только в том случае, если культурные растения будут подвергнуты модификации, сообщающей им резистентность к глифосату, что будет обеспечивать выживание нужных растений после их обработки глифосатом.

Для выделения мутантных EPSP-синтаз, которые являются резистентными к глифосату, была применена технология рекомбинантных ДНК. Такие резистентные к глифосату мутантные EPSP-синтазы могут быть введены в растения и могут сообщать трансформированным растениям резистентность к глифосату. Так, например, ген резистентности к глифосату был выделен из штамма CP4 Agrobacterium, как описано в патенте США No. 5633435. Эта работа и все цитируемые там работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Другие гены устойчивости к глифосату были сконструированы путем внесения мутаций. Такими генами являются ген AroA, выделенный Comai и описанный в патентах США №№ 5094945, 4769061 и 4535060. Был использован мутант с одной мутацией, описанный в патенте США № 5310667 и полученный путем замены глицинового остатка аланиновым остатком в положениях аминокислот 80-120. Двойные мутанты были описаны в патентах США №№ 6225114 и 5866775, где в ген EPSPS дикого типа, помимо вышеуказанной мутации, была введена вторая мутация (замена аланинового остатка треониновым остатком в положениях 170-210).

В других работах, резистентная к глифосату кукуруза была получена путем введения модифицированного гена EPSPS кукурузы, несущего мутации в положении остатка 102 (замену треонина на изолейцин) и остатка 106 (замену пролина на серин) в аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью, имеющейся в GenBank под рег. №. X63374. См., патенты США №№ 6566587 и 6040497.

Примерами генетических событий, сообщающих резистентность к глифосату у сои, являются генетические события сои GTS 40-3-2 (Padgette et al. 1995) и генетические события сои MON89788 (патенты США № 7608761).

За последние годы, широкое применение технологии выращивания резистентных к глифосату сельскохозяйственных культур и почти повсевместное применение глифосата привели к появлению большого количества резистентных к глифосату сорняков, которые плохо поддаются уничтожению. В регионах, в которых фермеры сталкиваются с резистентными к глифосату сорняками или с сорняками других видов, которые еще труднее поддаются уничтожению, такой недостаточный спектр гербицидного действия глифосата может быть компенсирован путем резервуарного смешивания или чередования применения глифосата с другими гербицидами, которые будут уничтожать сорняки, не входящие в спектр действия гербицидов.

Гербицид, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), может быть использован в комбинации с глифосатом для борьбы с более широким рядом широколистных или двудольных сорняков, которые могут приобретать устойчивость или резистентность к глифосату. 2,4-D, которая используется в качестве гербицида уже в течение более 60 лет и обеспечивает послевсходовое уничтожение однолетних, двулетних и многолетних широколистных сорняков широкого ряда. Что касается кукурузы, сои и хлопчатника, то 2,4-D (при норме введения 560-1120 г экв. кислоты/га (г э.к./га)) уничтожает главные сорняки этих культур, включая: Ambrosia artemisiifolia, Ambrosia triflda, Xanthium strumarium, Chenopodium album, Helianthus annuus, Ipomoea sp., Abutilon theophrasti, Conyza Canadensis и Senna obtusifolia. 2,4-D обеспечивает частичное уничтожение некоторых широко распространенных сорняков, включая Polygonum pensylvanicum, Polygonum persicaria, Cirsium arvense, Taraxacum officinale и Amaranthus sp., включая Amaranthus rudis, и Amaranthus palmeri.

Ограничение по дальнейшему применению 2,4-D заключается в том, что ее селективность к двудольным культурам, таким как соя или хлопчатник является очень низкой, а поэтому 2,4-D обычно не применяют к чувствительным двудольным культурам (и даже поблизости от этих культур). Кроме того, применение 2,4-D к пастбищным культурам до некоторой степени ограничено природой возможного повреждения этих культур. 2,4-D в комбинации с глифосатом была использована для обеспечения более тщательного выжигания пастбищной травы перед посевом культур сои и хлопчатника, высаживаемых на непахотные земли; однако, из-за чувствительности этих двудольных растений к 2,4-D, такое выжигание может быть осуществлено, главным образом, по меньшей мере за 14-30 дней до посева (Agriliance, 2005).

Одним микроорганизмом, который был широко исследован на его способность разлагать 2,4-D, является Ralstonia eutropha, содержащий ген, tfdA, который кодирует фермент (TfdA), катализирующий первую стадию пути минерализации. (См., патенты США № 6153401 и GENBANK Acc. No. M16730). TfdA катализирует превращение 2,4-D-кислоты в дихлорфенол (DCP) посредством диоксигеназной реакции, зависящей от α-кетоглутарата (Smejkal et al, 2001). DCP обладает более низкой гербицидной активностью по сравнению с 2,4-D. tfdA был использован в трансгенных растениях для сообщения резистентности к 2,4-D у двудольных растений (например, у хлопчатника и табака), которые, по своей природе, являются восприимчивыми к 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) и в патенте США No. 5608147).

Ряд генов типа tfdA, которые кодируют белки, способные разлагать 2,4-D, были выделены из соответствующей среды и депонированы в базе данных Genbank. Многие гомологи являются аналогичными TfdA (то есть, имеют >85%-ную идентичность аминокислот) и обладают ферментативными свойствами, аналогичными ферментативным свойствам TfdA. Однако, существует ряд гомологов, которые значительно менее идентичны TfdA (25-50%), но при этом, имеют характерные остатки, ассоциированные с остатками α-кетоглутарат-Fe (II)-диоксигеназ. Следовательно, специфичность дивергентных белков TfdA к субстрату пока не обнаруживалась.

Примером 2,4-D-расщепляющего гена с низкой гомологией (<35%) к tfdA является ген aad-12, происходящий от Delftia acidovorans (Schleinitz et al. (2004) and Westendorf et al. (2002). Ген aad-12 кодирует S-энантиомер-специфическую α-кетоглутарат-зависимую диоксигеназу, которая была использована в растениях для сообщения им устойчивости к некоторым феноксиауксиновым гербицидам, включая, но не ограничиваясь ими, феноксиалканоатные гербициды (например, гербициды на основе феноксиуксусной кислоты, такие как 2,4-D и MCPA; и гербициды на основе феноксибутановой кислоты, такие как 2,4-DB и MCPB) и гербициды на основе пиридилоксиалкановой кислоты (например, гербициды на основе пиридилоксиуксусной кислоты, такие как триклопир и флуроксипир), а также кислотные, солевые или сложноэфирные формы активного(ых) ингредиента(ов). (см., например, WO 2007/053482).

Глюфозинат-аммоний («глюфозинат») представляет собой несистемный и неселективный гербицид, принадлежащий к классу фосфинотрицинов. L-фосфинотрицин, то есть, активный ингредиент глюфозината, используется, главным образом, для послевсходового уничтожения широколистных и травянистых сорняков, а именно, посредством необратимого ингибирования глутамин-синтазы, то есть,фермента, необходимого для детоксификации аммиака в растениях. Глюфозинатные гербициды являются коммерчески доступными и имеются в продаже под торговыми знаками IGNITE® и LIBERTY®.

Фермент фосфинотрицин-N-ацетилтрансфераза (PAT), выделенная из почвенных бактерий Streptomyces viridochromogenes, катализирует превращение L-фосфинотрицина в его неактивную форму посредством ацетилирования. Оптимизированная для растения форма гена, экспрессирующего PAT, была использована в растениях сои для сообщения им устойчивости к глюфозинатному гербициду. Одним из таких примеров растений сои, резистентных к глюфозинату, являются трансгенная соя генетического события A5547-127. Совсем недавно, применение глюфозинатного гербицида к растениям с признаками устойчивости к глюфозинату было предложено как неселективный метод эффективной борьбы с сорняками, резистентными к ALS и глифосату.

Экспрессия гетерологичных или чужеродных генов в растениях зависит от того, встраивается ли этот чужеродный ген в хромосому. Это может быть обусловлено, например, хроматиновой структурой (например, гетерохроматином) или непосредственной близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Тот же самый ген в том же самом трансгенном растении (или в другом организме) может обнаруживать широкую вариабельность в уровнях экспрессии у различных генетических событий. Также могут наблюдаться различия в пространственных или временных профилях экспрессии. Так, например, различия в относительных уровнях экспрессии трансгена в различных тканях растений могут не соответствовать профилям, ожидаемым для данных элементов регуляции транскрипции, присутствующих во введенной генной конструкции.

Таким образом, для идентификации генетических событий в линии, которая экспрессирует введенный представляющий интерес ген, часто создают и скринируют большое число мутаций до тех пор, пока не будет достигнут уровень экспрессии, удовлетворяющий определенным требованиям. Для коммерческих целей, обычно создается от ста до тысячи различных модификаций, и эти модификации скринируют для выявления одной модификации, которая будет сообщать желаемые уровни и профили экспрессии трансгенов. Генетическое событие, которое дает нужные уровни и/или профили экспрессии трансгенов может быть использовано для интрогрессии трансгена в другую генетическую среду посредством полового ауткроссинга с использованием стандартных методов скрещивания. В потомстве таких кроссов сохраняется характер экспрессии трансгена, присущие исходному трансформанту. Такая стратегия применяется для обеспечения надежной экспрессии генов у ряда сортов, которые хорошо адаптированы для их культивирования в условиях данной местности.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится, в частности, к эффективным способам борьбы с вырабатыванием резистентности у сорняков, которые обеспечивают возможность эффективного применения технологии сообщения культурным растениям устойчивости к гербицидам. Настоящее изобретение также предлагает фермерам широкий выбор универсальных и адаптивных средств борьбы с сорняками.

Более конкретно, настоящее изобретение, в частности, относится к генетическому событию сои (Glycine max), обозначенному pDAB8264.42.32.1 («pDAB8264.42.32.1-генетическое событие сои»), репрезентативные семена которой и семена ее потомства депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под рег. No. PTA-1 1993. Настоящее изобретение включает растения сои, содержащие генетическое событие pDAB8264.42.32.1 (и включает растения сои, содержащие трансгенную вставку между последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2).

Трансгенная вставка, присутствующая в рассматриваемом генетически модифицированном растении и в его депонированных семенах, включает три гена устойчивости к гербицидам: aad-12, 2mEpsps и pat. Ген aad-12, происходящий от Delftia acidovorans, кодирует белок арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-12), которая сообщает устойчивость, например, к таким гербицидам, как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и пиридилоксиацетат. Ген 2mepsps, модифицированная последовательность EPSPS, выделенная из кукурузы, продуцирует белок, сообщающий устойчивость к гербицидам, таким как глифосат. Ген pat, выделенный из почвенных бактерий Streptomyces viridochromogenes, сообщает устойчивость к гербициду глюфозинату.

В других своих аспектах, настоящее изобретение включает растения потомства, соевые бобы, семена и/или регенерируемые части растений и семян, и потомство, содержащее генетическое событие pDAB8264.42.32.1, а также полученные из них пищевые или кормовые продукты. Настоящее изобретение также включает части генетического события pDAB8264.42.32.1, которыми являются, но не ограничиваются ими, пыльца, овули, цветки, побеги, корни, листья, ядра вегетативных клеток, клетки пыльцы и другие клетки растений, содержащие генетическое событие pDAB8264.42.32.1. Настоящее изобретение также относится к растениям сои, обладающим устойчивостью к множеству гербицидов, включая феноксиауксиновые и/или арилоксиалканоатные гербициды, глифосат и/или глюфозинат. Такие растения сои могут также включать гены, которые сообщают устойчивость к различным другим неселективным и селективным гербицидам, включая, но не ограничиваясь ими, гербициды дикамбу, имидазолинон и HPPD. Настоящее изобретение также включает новые генетические композиции, содержащие генетическое событие pDAB8264.42.32.1, и показатели агрономической продуктивности растений сои, содержащих генетическое событие pDAB8264.42.32.1.

Настоящее изобретение, в частности, относится к скрещиванию растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. Настоящее изобретение включает новое генетическое событие в растениях сои, содержащее описанный здесь полинуклеотид, встроенный в специфический сайт генома клетки сои.

В некоторых вариантах изобретения, указанный трансген/полинуклеотид может быть «сцеплен» с другими признаками, включая, например, агрономические признаки и/или белки, уничтожающие насекомых. Однако настоящее изобретение включает растения, имеющие одну описанную здесь генную модификацию.

Дополнительные признаки могут быть введены в геном растения или в локус, такой как генетическое событие pDAB8264.42.32.1, например, посредством скрещивания растений, повторной трансформации трансгенного растения, содержащего генетическое событие pDAB8264.42.32.1, или добавления новых признаков благодаря направленной интеграции посредством гомологичной рекомбинации.

Другие варианты осуществления изобретения включают вырезание части трансгенной вставки и/или фланкирующих последовательностей генетического события pDAB8264.42.32.1, или всех указанных вставок и/или последовательностей. После вырезания, в специфический хромосомный сайт генетического события pDAB8264.42.32.1 может быть введена другая и/или дополнительная вставка. Таким образом, эта репрезентативная вставка может быть, заменена репрезентативной вставкой рассматриваемого генетически модифицированного растения сои, либо эта репрезентативная вставка может быть сцеплена с другой(ими) вставкой(ами).

В одном из своих вариантов настоящее изобретение охватывает хромосомный сайт-мишень сои, локализованный на хромосоме 15. В некоторых вариантах изобретения, этот сайт-мишень включает гетерологичную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах изобретения, этот хромосомный сайт-мишень сои локализован между фланкирующими последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение охватывает способ возделывания трансгенного растения сои, где указанный способ включает встраивание гетерологичной нуклеиновой кислоты в определенное положение хромосомы 15. В другом варианте изобретения, гетерологичную нуклеиновую кислоту встраивают в хромосому 15 в положение, находящееся поблизости от различных описанных здесь репрезентативных полинуклеотидных сегментов или между этими сегментами.

Кроме того, настоящее изобретение относится к анализам на присутствие рассматриваемом генетическом событии в образце (например, в растении сои). Эти анализы основаны на определении последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, встроенной в геном сои, и геномных последовательностей, фланкирующих инсерционный сайт. Настоящее изобретение также относится к наборам и к условиям проведения этих анализов.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к клонированию и к анализу последовательностей ДНК целой репрезентативной вставки и ее граничных областей (в линиях трансгенной сои). Эти последовательности являются уникальными. На основе этих последовательностей вставок и граничных областей (и областей стыка) могут быть и были созданы праймеры, специфичные к такому генетическому событию. ПЦР-анализ показал, что эти указанные генетические модификации могут быть идентифицированы путем оценки ПЦР-ампликонов, сконструированных с использованием наборов праймеров, специфичных к такой модификации. Таким образом, эти и другие родственные методы могут быть применены для уникальной идентификации линий сои, содержащих генетическое событие согласно изобретению.

Настоящее изобретение также, в частности, относится к РЦР-анализам TAQMAN, конечной целью которых является детектирование генетического события 8264.42.32.1. Некоторые варианты изобретения относятся к анализам, позволяющим определить зиготность. Настоящее изобретение также относится, в частности, к применению эталонного гена GMFL01-25-J19 (GenBank: AK286292.1), используемого для определения зиготности. Эти и другие родственные методы могут быть применены для уникальной идентификации зиготности генетического события pDAB8264.42.32.1 и выведенных линий сои, содержащих данное генетическое событие.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлена карта плазмиды pDAB8264.

На фиг.2 схематически представлена диаграмма, иллюстрирующая определение локализации праймеров для подтверждения 5'- и 3'-граничной последовательности генетического события pDAB8264.42.32.1 в сое.

На фиг.3 схематически представлена диаграмма, иллюстрирующая определение локализации праймеров для подтверждения нетрансформированной и геномной ДНК, где генетическим событием в сое является pDAB8264.42.32.1.

На фиг.4 схематически представлена диаграмма, иллюстрирующая определение локализации праймеров для проведения анализа TAQMAN в целях детектирования присутствия генетического события pDAB8264.42.32.1 в сое.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1 представляет собой 5'-фланкирующую граничную последовательность рассматриваемого генетического события pDAB8264.42.32.1 в сое.

SEQ ID NO:2 представляет собой 3'-фланкирующую граничную последовательность рассматриваемого генетического события pDAB8264.42.32.1 в сое.

SEQ ID NO:3 представляет собой праймер 4232_WF1.

SEQ ID NO:4 представляет собой праймер 4232_WF3.

SEQ ID NO:5 представляет собой праймер 4232_WF4.

SEQ ID NO:6 представляет собой праймер 4232_WR1.

SEQ ID NO:7 представляет собой праймер 4232_WR2.

SEQ ID NO:8 представляет собой праймер 4232_WR3.

SEQ ID NO:9 представляет собой праймер 4232_WR4.

SEQ ID NO:10 представляет собой праймер ED_v1_Cl.

SEQ ID NO:11 представляет собой праймер PAT_11.

SEQ ID NO:12 представляет собой праймер 4232_3'F.

SEQ ID NO:13 представляет собой праймер 4232_3'R.

SEQ ID NO:14 представляет собой зонд 4232_3'P.

SEQ ID NO:15 представляет собой праймер GMS116F.

SEQ ID NO:16 представляет собой праймер GMS116R.

SEQ ID NO:17 представляет собой зонд GMS116Probe.

SEQ ID NO:18 представляет собой вставку T-цепи pDAB8264 и неполные геномные 5'- и 3'-фланкирующие последовательности.

SEQ ID NO:19 представляет собой 5'-геномную последовательность-вставку (включая область стыка) для генетического события pDAB8264.42.32.1.

SEQ ID NO:20 представляет собой последовательность 3'-вставки-стыка для рассматриваемого генетического события pDAB8264.42.32.1.

SEQ ID NO:21 представляет собой последовательность плазмиды pDAB8264.

Подробное описание изобретения

Описанное здесь изобретение включает новые генетические события растения сои (соевые бобы), содержащие кластер для экспрессии множества генов устойчивости к гербицидам, встроенных в специфический локус генома клеток сои. В частности, были выращены новые линии растения сои, содержащие генетическое событие pDAB8264.42.32.1. Такое трансгенное растение обладает устойчивостью к множеству гербицидов, включая феноксиауксиновые и/или арилоксиалканоатные гербициды, глифосат и/или глюфозинат. Устойчивость ко многим гербицидам позволяет фермерам выбрать оптимальную комбинацию гербицидов для более эффективной борьбы с отдельными популяциями сорняков.

Репрезентативной трансгенной вставкой, содержащей генетическое событие pDAB8264.42.32.1, являются генетические элементы, экспрессирующие три различных гена устойчивости к гербицидам: (1) синтетический ген aad-12; (2) модифицированную последовательность EPSPS кукурузы, кодирующую белок, который, по сравнению с полипептидом EPSPS дикого типа, содержит мутации, а именно, мутацию в положении аминокислоты 102 (замену треонина изолейцином) и в положении 106 (замену пролина серином), которая сообщает резистентность или устойчивость к гербициду глифосату; и (3) и ген pat, который сообщает устойчивость или резистентность к гербициду глюфозинату. Ген aad-12, происходящий от Delftia acidovorans, кодирует белок арилоксиалканоат-диоксигеназу (AAD-12), то есть, фермент, способный дезактивировать гербициды, имеющие α-кетоглутаратную группу, включая феноксиалканоатные гербициды (например, гербициды на основе феноксиуксусной кислоты, такие как 2,4-D и MCPA; и гербициды на основе феноксибутановой кислоты, такие как 2,4-DB и MCPB) и гербициды на основе пиридилоксиалкановой кислоты (например, гербициды на основе пиридилоксиуксусной кислоты, такие как триклопир и флуроксипир), включая кислотные, солевые или сложноэфирные формы активного(ых) ингредиента(ов).

Настоящее изобретение также относится к анализам на присутствие рассматриваемого генетического события в образце. Аспекты настоящего изобретения включают способы конструирования и/или продуцирования любых описанных или предлагаемых здесь диагностических молекул нуклеиновой кислоты, а в частности, молекул, которые полностью или частично состоят из рассматриваемых фланкирующих последовательностей.

Настоящее изобретение, в частности, относится к скрещиванию растений и к растениям, устойчивым к гербицидам. В некоторых вариантах изобретения, указанная полинуклеотидная последовательность может быть «сцеплена» с другими признаками (такими как, другой(ие) ген(ы) устойчивости к гербицидам и/или ген(ы), кодирующий(ие) белки, уничтожающие насекомых, или, например, белки, ингибирующие последовательности РНК). Однако настоящее изобретение также включает растения, имеющие одну описанное здесь генетическое событие.

Более конкретно, настоящее изобретение относится, в частности, к генетическому событию сои pDAB8264.42.32.1, к линиям растений, содержащих указанный трансген, и к методам клонирования и анализа ДНК-последовательности этой трансгенной вставки и/или ее граничных областей. Линии растений согласно изобретению могут быть детектированы с использованием описанных и предлагаемых здесь последовательностей.

В некоторых вариантах изобретения, предлагаемый или описанный здесь полинуклеотидный сегмент (такой как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, и/или вставка между ними, как указано, например, на фиг.2) может быть вырезан, а затем снова введен с дополнительной(ыми) полинуклеотидной(ыми) последовательностью(ями).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к клеточным линиям сои, устойчивым к гербицидам, и к их идентификации. Настоящее изобретение, в частности, относится к детектированию наличия рассматриваемого генетического события для того, чтобы определить, содержит ли потомство, полученное путем полового скрещивания, представляющее интерес генетическое событие. Кроме того, настоящее изобретение включает способ детектирования данной модификации, которая будет удовлетворять требованиям, предъявляемым Регуляторными органами для получения разрешения на поступление этого продукта на первичный рынок с указанием на этикетке данного пищевого продукта, например, что этот продукт был получен из рекомбинантных культур. Присутствие рассматриваемого генетического события может быть детектировано любым хорошо известным методом детектирования нуклеиновых кислот, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или ДНК-гибридизация с использованием нуклеиновокислотных зондов. Анализ, проводимый с помощью ПЦР, специфичной к генетическому событию, описан ниже. (Другой пример можно найти в публикации Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999)). Некоторые из этих примеров относятся к использованию серии праймеров, охватывающих последовательность стыка, расположенную между вставкой и фланкирующей ДНК.

В настоящей заявке описаны репрезентативное генетическое событие сои pDAB8264.42.32.1, ее отбор и характеризация на стабильность и экспрессию в целом растении и на молекулярные уровни от поколения к поколению. Обе фланкирующие последовательности генетического события pDA8264.42.32.1 были секвенированы и представлены здесь как SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Были разработаны анализы, специфичные для такой модификации. Было также проведено картирование генома сои (хромосомы 15 сои). Может быть осуществлена интрогрессия генетического события pDAB8264.42.32.1 в элитные сорта, которым была сообщена устойчивость к таким гербицидам, как феноксиауксин, глифосат и глюфозинат, в инбредных и гибридных линиях сои.

Рассматриваемый ген EPSPS кодирует мутантную 5-енолпирувил-3-фосфошикимовая кислота-синтазу (EPSPS). Ген EPSPS дикого типа был впервые выделен из кукурузы Zea mays, и его последовательность была депонирована в GenBank под рег. № X63374. См. также патент США No. 6566587 (а в частности, описанную там последовательность SEQ ID NO:3).

Для достижения высокого уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях может оказаться предпочтительным реконструировать указанные гены так, чтобы они более эффективно экспрессировались в клетках растений. Модификация нуклеотидной последовательности EPSPS в растении дикого типа может сообщать такую резистентность при ее экспрессии в клетках растений. Как описано в патенте '587, в полипептиде EPSPS, модификация с заменой треонина изолейцином в положении остатка 102 и модификация с заменой пролина серином в положении 106 белка, по сравнению с полипептидом дикого типа, приводит к образованию полипептида EPSPS с двойной мутацией (2mEPSPS), используемого в рассматриваемой вставке. При его экспрессии в клетках растений, он сообщает устойчивость к глифосату. Рассматриваемый ген EPSPS, также обозначаемый здесь «ген 2mepsps» или DMMG, может быть альтернативно оптимизирован для повышения уровня экспрессии в двудольных растениях, а также в однодольных растениях, а в частности, в растениях сои. Встречаемость кодонов может быть выбрана исходя из предпочтительной встречаемости кодона семядоли, то есть, белок может быть реконструирован так, чтобы он кодировался кодонами, которые чаще встречаются у однодольных и двудольных растений. Для повышения эффективности транскрипции/трансляции 2mepsps-кодирующей последовательности и для облегчения проведения стадий модификаций ДНК могут быть удалены нежелательные последовательности и избыточные рестрикционные сайты. Оптимизированный по семядоле вариант рассматриваемого гена однодольных растений также подробно описан в предварительной заявке США (рег.№ 61/419703), поданной 3 декабря 2010 под заголовком «OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS».

Как было описано ранее, введение и интеграция трансгена в геном растения представляют собой спонтанные события внесения некоторых генетических событий (а поэтому, термин «модификация» («event») относится к вставке, которая экспрессируется в трансформируемом растении). То есть, при осуществлении многих методов трансформации, таких как трансформация агробактерией (Agrobacterium), метод «выстреливания генов» и WHISKERS, нельзя точно предсказать, в какой участок генома будет встраиваться трансген. Таким образом, идентификация фланкирующей геномной ДНК растения по обеим сторонам вставки может играть важную роль для идентификации растения, которое имеет данную инсерционную модификацию. Так, например, могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, которые генерируют ПЦР-ампликон в области стыка между вставкой и геномом хозяина. Этот ПЦР-ампликон может быть использован для идентификации уникальной инсерционной модификации или инсерционной модификации другого типа.

В процессе введения вставки в геном клеток растений нередко возникают некоторые делеции или другие альтерации во вставке и/или во фланкирующих ее геномных последовательностях. Таким образом, релевантный сегмент описанной здесь плазмидной последовательности может содержать некоторые незначительные модификации. Это справедливо также и для описанных здесь фланкирующих последовательностей. Таким образом, растение, содержащее полинуклеотид, имеющий определенную степень идентичности с рассматриваемыми фланкирующими последовательностями и/или с последовательностями вставки, входит в объем настоящего изобретения. Полинуклеотидная последовательность может считаться идентичной последовательности согласно изобретению, если она по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична представленной или описанной здесь последовательности. Для определения таких растений и полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению может быть также проведена гибридизация в определенных условиях, описанных в настоящей заявке. Последовательность, содержащая фланкирующие последовательности и полноразмерную последовательность вставки, может быть подтверждена путем сравнения с последовательностью депонированных семян.

Термин «генетические события» («event») означает изначально случайные события трансформации, причем, за время разработки настоящего изобретения, по меньшей мере 2500 семян линии сои, содержащей указанные генетические модификации, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110 и являются общедоступными, без каких-либо ограничений (но в соответствии с патентным правом). Этот депозит был зарегистрирован в ATCC под депозитарным номером No. PTA-11993. 100 упаковок (25 семян на упаковку) семян Glycine max (семена сои Glycine max L.: pDAB8264.42.32.1) было депонировано 11 июля 2011. Этот депозит был проанализирован 26 июля, 2011, и на данное время, эти семена были жизнеспособными. Указанный депозит был положен на хранение согласно Будапештскому договору о депонировании семян в целях проведения патентной процедуры. Данный депозит будет храниться, без ограничений к его доступу, в депозитарии ATCC, который является общедоступным депозитарием, в течение 30 лет, или в течение пяти лет после самого последнего запроса, или в течение срока действия патента, каким бы долгим он не был, и этот депозит будет заменен, если он утратит свою жизнеспособность в течение этого периода времени.

Депонированные семена являются частью настоящего изобретения. Совершенно очевидно, что из этих семян могут быть выращены растения сои, и такие растения являются частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, содержащимся в этих растениях сои, которые могут быть использованы для детектирования этих растений и их потомства. Методы детектирования и наборы согласно изобретению могут быть применены для идентификации любого одного, двух или даже всех трех этих трансформантов, в зависимости от конечной цели проведения данного теста.

Описанные здесь определения и примеры приводятся для лучшего понимания настоящего изобретения и в качестве руководства по его практическому осуществлению. Если это не оговорено особо, то употребляемые здесь термины имеют свои общепринятые значения, понятные среднему специалисту в данной области. В настоящем описании используется номенклатура оснований ДНК согласно ст. 37 Свода законов США (CFR) § 1.822.

Используемый здесь термин «потомство» означает потомство любого поколения родительского растения, которое содержит генетическое событие pDAB8264.42.32.1.

«Трансгенное растение с генетическим событием» («event») получают путем трансформации клеток растений гетерологичной ДНК, то есть, конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей представляющий интерес трансген; регенерации популяции растений, полученных после встраивания трансгена в геном растения; и отбора конкретного растения, отличающегося тем, что оно имеет инсерцию в конкретном положении генома. Термин «трансгенное растение с генетическим событием» («event») означает исходный трансформант и потомство трансформанта, которые включают гетерологичную ДНК. Термин «трансгенное растение с генетическим событием» («event») также означает растение потомства, продуцированного посредством полового ауткроссинга трансформанта и растения другого сорта, включающего геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания с рекуррентным родителем, встроенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК), происходящая от трансформированного родителя, присутствует в потомстве этого кросса на том же самом хромосомном участке. Термин «трансген» («event») также означает ДНК исходного трансформанта и его потомства, содержащих встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, расположенную в непосредственной близости от встроенной ДНК, которая, как предполагается, должна передаваться потомству, которое получает эту встроенную ДНК, включая представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая содержит встроенную ДНК (например, исходного трансформанта и его потомства, продуцируемого после самоопыления), и родительской линии, которая не содержит встроенную ДНК.

«Последовательность стыка» охватывает положение, в котором ДНК, встроенная в геном, присоединена к ДНК генома нативного растения сои, фланкирующей положение инсерции, и идентификации или детектирования одной или другой последовательности стыка в растительном генетическом материале будут достаточными для выявления такого трансгена. Настоящее изобретение включает последовательности ДНК, которые охватывают инсерции в описанных здесь трансформантах сои и фланкирующие ДНК аналогичной длины. Конкретные примеры таких диагностических последовательностей описаны в настоящей заявке, однако, в настоящем изобретении могут быть использованы и другие диагностические последовательности, которые перекрываются с последовательностями стыка указанных инсерций или с последовательностями стыка инсерций и геномной последовательности.

Настоящее изобретение, в частности, относится к идентификации событий трансформации с использованием таких фланкирующих последовательностей, последовательностей стыка и последовательностей вставки. Настоящее изобретение включает использование родственных ПЦР-праймеров и ампликонов. В соответствии с настоящим изобретением, для детектирования или идентификации коммерчески доступных сортов или линий трансгенной сои, выведенных из запатентованных линий трансгенной сои, могут быть применены методы ПЦР-анализа с использованием ампликонов, которые охватывают встроенную ДНК и ее граничные области.

Бинарная плазмида pDAB8264 (SEQ ID NO:21) включает генетические элементы, представленные на фиг.1. Нижеследующие генетические элементы (не включая граничные последовательности T-цепи) содержатся в области T-цепи pDAB8264. В таблице 1, нумерация остатков генетических элементов соответствует нумерации остатков описанной здесь последовательности SEQ ID NO:21.

Таблица 1Нумерация остатков генетических элементов, содержащихся в бинарной плазмиде pDAB8264 (SEQ ID NO:21)
Генетический элемент	Положение	Ссылка
RB7 MARv3 (Область присоединения к матрице)	137 п.н. - 1302 п.н.	Thompson and Myatt, (1997) Plant. Mol. Biol., 34: 687-692.; WO9727207
Интронная последовательность	1303 п.н. - 1341 п.н.	Нет
Гистон H4A7 48 3 'UTR (нетранслируемая область)	1342 п.н. - 2002 п.н.