Применение антитела i-3859 для выявления и диагностики рака

Применение антитела i-3859 для выявления и диагностики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к области прогнозирования и/или диагностики, и/или контроля лечения пролиферативного заболевания у пациента. Более конкретно, данное изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с CXCR4 (от англ. chemokine receptor 4-хемокиновый рецептор 4), а также применению указанного антитела и соответствующим способам выявления и диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных расстройств, связанных с экспрессией CXCR4. В некоторых воплощениях изобретения расстройствами являются онкогенные расстройства, связанные с повышенной экспрессией CXCR4 по отношению к норме, или любые другие патологии, связанные с избыточной экспрессией CXCR4. В заключение изобретение включает продукты и/или композиции или наборы, включающие по крайней мере такое антитело для прогноза и/или диагностики и/или контроля лечения некоторых видов рака.

Хемокины являются маленькими, секретируемыми пептидами, контролирующими миграцию лейкоцитов вдоль химического градиента лиганда, известного как хемокиновый градиент, особенно в иммунных реакциях (ZIotnick A. et al., 2000). Они делятся на два основных подсемейства, СС (β-хемокины) и СХС (α-хемокины), в зависимости от положения их NH₂-концевых остатков цистеина, и связываются с G-белками рецепторов, чьи два крупных подсемейства обозначаются как CCR и CXCR. До настоящего времени у человека было обнаружено более 50 хемокинов и 18 рецепторов хемокинов.

Многие виды рака имеют сложную сеть хемокинов, влияющую на инфильтрацию опухоли иммунными клетками, а также рост опухолевых клеток, выживание, миграцию и ангиогенез. Иммунные клетки, эндотелиальные клетки и сами опухолевые клетки экспрессируют рецепторы хемокинов и могут отвечать на градиент хемокинов. Исследования образцов биопсии рака человека и моделей рака мыши показывают, что экспрессия рецепторов хемокинов раковыми клетками связана с увеличением их метастатической способности. Злокачественные клетки из разных типов рака имеют различные профили экспрессии хемокиновых рецепторов, но CXCR4 является наиболее часто встречающимся. Клетки из по крайней мере 23 различных типов рака человека эпителиального, мезенхимального и гемопоэтического происхождения экспрессируют CXCR4 рецептор (Balkwill F. et al., 2004).

Хемокиновый рецептор 4 (также известный как fusin, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в виде двух изоформ, содержащих 352 или 360 аминокислот. Изоформа а имеет аминокислотную последовательность, представленную в базе данных Genbank под номером NP_001008540, в то время как изоформа b имеет аминокислотную последовательность, представленную в базе данных Genbank под номером NP_003458. Остаток Asn11 гликозилирован, остаток Туг21 модифицирован добавлением сульфатной группы, a Cys 109 и 186 связаны дисульфидным мостиком во внеклеточной части рецептора (Juarez J. et al., 2004).

Этот рецептор экспрессируется различного рода нормальными тканями, необученными Т-клетками без памяти, регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендритными клетками, естественными киллерами, CD34+гемопоэтическими стволовыми клетками и на низком уровне в сердце, толстой кишке, печени, почках и мозге. CXCR4 играет ключевую роль в движении лейкоцитов, лимфопоэзе В-клеток и миелопоэзе.

Рецептор CXCR4 сверхэкспрессируется в большом количестве разновидностей рака, включая лимфому, лейкемию, множественную миелому, рак толстой кишки (Ottaiano А. и др., 2004), рак молочной железы (Като М. и соавт., 2003), рак предстательной железы (Sun Y.X. et al., 2003), рак легких [мелкокпеточная и немелкоклеточная карцинома (Phillips R.J. et al., 2003)], рак яичников (Scotton C.J. et al., 2002), рак поджелудочной железы (Koshiba Т. et al., 2000), рак почки, рак головного мозга (Barbero S. et al., 2002), глиобластому, но не ограничиваясь ими.

Уникальным лигандом рецептора CXCR4, описанным до настоящего времени, является SDF-1 (от англ. stromal cell-derived factor 1 - полученный из стромальных клеток фактор 1) или CXCL12 (от англ. chemokine (C-X-C motif) ligand 12 - хемокиновый (C-X-C мотив) лиганд 12). SDF-1 в большом количестве секретируется в лимфатических узлах, костном мозге, печени, легких и в меньшей степени почками, головным мозгом и кожей. CXCR4 также узнается хемокином-антагонистом, vMIP-ll (от англ. viral macrophage inflammatory protein II-вирусный макрофагальный воспалительный белок II), кодируемым человеческим вирусом герпеса III типа.

Комплекс CXCR4/SDF-1 играет ключевую роль в развитии рака и вовлечен непосредственно в миграцию и инвазию, приводящую к образованию метастаз. Действительно, раковые клетки экспрессируют рецептор CXCR4, они мигрируют и проникают в кровеносную систему. Затем раковые клетки задерживаются в сосудистых ложах в органах, производящих высокие уровни SDF-1 в местах пролиферации, индуцируют ангиогенез и образуют метастатические опухоли (Murphy P.M., 2001). Данный комплекс также участвует в пролиферации клеток через активацию пути экстраклеточной сигнал-регулируемой киназы (ЭРК) (Barbero S. et al., 2003) и ангиогенез (Romagnani P., 2004). Действительно, CXCR4 рецептор и его лиганд SDF-1 четко способствуют ангиогенезу, стимулируя экспрессию ФРЭС-А (фактор роста эндотелия сосудов А), которая в свою очередь увеличивает экспрессию CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). Также известно, что с ОАМ (опухоль-ассоциированные макрофаги), аккумулированные в гипоксических областях опухолей и стимулированные к взаимодействию с опухолевыми клетками и способствуют ангиогенезу. Было отмечено, что гипоксия активирует селективную экспрессию CXCR4 в различных типах клеток, включая ОАМ (Mantovani A et al., 2004). Недавно было показано, что комплекс CXCR4/SDF-1 регулирует движение/хоминг CXCR4+HSC/клеток-предшественников (от англ. hematopoietic stem cells - гемопоэтические стволовые клетки) и может играть роль в неоваскуляризации. Практика показывает, что кроме HSC, функциональный CXCR4 также экспрессируется стволовыми клетками из других тканей (TCSCs (от англ. tissue-committed stem cells - тканеспецифичные стволовые клетки)), поэтому SDF-1 могут играть ключевую роль в хемоаттрактации CXCR4+TCSCs клетками, необходимыми для регенерации органов/тканей, но данные TCSC также могут служить клеточным источником развития рака (теория РСК (раковых стволовых клеток)). Происхождение рака из стволовых клеток было продемонстрировано для лейкемии человека и недавно для нескольких солидных опухолей, таких как рак мозга и рак груди. Есть несколько примеров CXCR4+опухолей, возможно произошедших от нормальных CXCR4+ткане-Уорганоспецифических стволовых клеток, например, лейкозы, опухоли головного мозга, мелкокпеточный рак легких, рак молочной железы, гепатобластома, рак яичников и рак шейки матки (Kucia М. et al., 2005).

Ориентация метастазы рака, препятствующая CXCR4 рецептору, была продемонстрирована in vivo с использованием моноклональных антител, направленных против CXCR4 рецептора (Muller A. et al., 2001). Вкратце, было показано, что моноклональные антитела, направленные против рецептора CXCR4 (Mab 173 R&D Systems) значительно уменьшают количество метастазов в лимфатических узлах в ортотопической модели рака молочной железы (MDA-МВ231) у SCID (от англ. severe combined immunodeficiency-тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышей. Другое исследование (Phillips R.J. et al., 2003) также показало решающую роль комплекса CXCR4/SDF-1 в образовании метастазов в ортотопической модели карциномы легких (А549) с использованием поликлональных антител против SDF-1, но в этом исследовании не было никакого эффекта ни на рост опухоли, ни на ангиогенез. В нескольких других исследованиях также описано ингибирование либо метастазов in vivo с помощью миРНК дуплексов из CXCR4 (Liang Z. et al., 2005) биоустойчивого антагониста CXCR4 пептида (Tamamura H. et al., 2003), либо роста опухоли in vivo с использованием малой молекулы антагониста CXCR4, например AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Faico V. et al., 2007) или Mab (патент WO 2004/059285 A2). Таким образом, CXCR4 является проверенной терапевтической мишенью для раковых заболеваний.

CXCR2 (от англ. chemokine receptor 2 - хемокиновый рецептор 2), другой хемокиновый рецептор, также описывается как интересная мишень в онкологии. Действительно, CXCR2 передает аутокринный сигнал клеточного роста в нескольких типах опухолевых клеток, а также косвенно может повлиять на рост опухоли путем стимуляции ангиогенеза (Tanaka Т. et al., 2005).

CXCR2 хемокиновый рецептор включает 360 аминокислот.Он экспрессируется в основном в эндотелиальных клетках и особенно во время неоваскуляризации. Несколько хемокинов связывают рецептор CXCR2: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α, -β и γ, которые принадлежат к ERL+проангиогенным хемокинам. Последовательность рецептора CXCR2 гомологична последовательности рецептора CXCR4: 37% последовательности идентичны и 48% последовательности гомологичны. Комплекс СХСР2/лиганды участвует в нескольких механизмах роста опухоли, таких как метастазирование (Singh P.K. et al., 1994), клеточная пролиферация (Owen J.D. et al., 1997) и ERL+хемокин-опосредованный ангиогенез (Stricter R.M. et al., 2004). Наконец, ОАМ и нейтрофилы являются ключевыми элементами индуцированного воспалением роста опухоли, а хемокины, такие как CXCL5, IL-8 и GRO-a, инициируют привлечение нейтрофилов.

Димеризация возникла как единый механизм для регуляции функции спаренных G-белком рецепторов, среди которых хемокиновые рецепторы (Wang J. and Norcross M., 2008). Показали, что гомо- и гетеродимеризация в ответ на связывание хемокина необходима для инициирования и изменения сигналинга с помощью ряда хемокиновых рецепторов. Все больше фактов поддерживает концепцию, что димеры рецепторов или олигомеры, вероятно, являются основной функциональной единицей хемокиновых рецепторов. Димеры хемокиновых рецепторов были найдены в отсутствие лигандов и хемокинов, вызывающих конфирмационные изменения рецепторных димеров. CXCR4, как известно, образует не только гомодимеры, но и гетеродимеры, в случае ДОР (дельта-опиоидный рецептор) (Hereld D., 2008) или CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). В последнем случае пептиды, полученные из трансмембранного домена CXCR4 ингибируют активацию путем блокирования лиганд-индуцируемых конформационных переходов димера (Percherancier Y. et al., 2005). Другое исследование показало, что CXCR4-TM4 пептид, синтетический пептид из трансмембранного региона CXCR4, уменьшает передачу энергии между протомерами CXCR4 в гомодимерах и ингибирует SDF-1-индуцированную миграцию и полимеризацию актина в злокачественных клетках (Wang J. et al., 2006). Совсем недавно было также описано, что CXCR7 образует функциональные гетеродимеры с CXCR4, что повышает SDF-1-индуцированный сигналинг (Sierra F. et al., 2007). Другие примеры основных гетеродимеров включают исследования, показывающие взаимодействовие CXCR1 и CXCR2, а также формирование соответствующих гомодимеров. Ни для одного из них не было отмечено взаимодействия с другим GPCR (альфа (1А)-адренорецептор), что указывает на специфику CXCR1 и CXCR2 взаимодействия (Wilson S. et al., 2005).

Как упоминалось ранее, CXCR4 и CXCR2 рецепторы являются интересными опухолевыми мишенями. Взаимодействие с данными рецепторами должно ингибировать рост опухоли и метастазов очень эффективным способом, путем уменьшения пролиферации опухолевых клеток, ангиогенеза, миграции опухолевых клеток и инвазии, привлечения нейтрофилов и макрофагов к опухолям и путем ингибирования CXCR4 PCK.

Два моноклональные антитела, упомянутые как 515Н7 и 414Н5, связывающиеся и индуцирующие конформационные изменения как в гомодимерах CXCR4, так и в гетеродимерах CXCR4/CXCR2, и обладающие сильной противоопухолевой активностью, были охарактеризованы ранее (см. WO 2010/037831). Кроме того, заявитель продемонстрировал существование гетеродимера CXCR4/CXCR2.

Данное изобретение направлено на обеспечение по меньшей мере одного реагента, лишенного какой-либо in vivo активности в моделях рака, который может быть использован в качестве диагностического или прогностического инструмента для онкогенных расстройств, в особенности характеризующихся экспрессией CXCR4 или опосредованных аберрантной экспрессией CXCR4.

Опубликованная патентная заявка WO 2010/125162 раскрывает два анти-CXCR4 моноклональных антитела, упомянутых как 515Н7 и 301 аЕ5, и их применение в области лечения ВИЧ.

Авторы данного изобретения неожиданно продемонстрировали, что указанное антитело 301 аЕ5 (также называемое в настоящем описании как 301 Е5 или более предпочтительно, со ссылкой на депонированную гибридому, I-3859: для целей данной заявки, эти термины схожи) не имеет никакой in vivo активности в области лечения рака, в отличие от другого антитела 515Н7, демонстрирующего сильные противоопухолевые свойства (как описано в WO 2010/ 037831). В частности, I-3859 не предотвращает связывание CXCR4 лиганда с рецептором.

Кроме того, заявители обнаружили, что антитела I-3859 способны к:

1) узнаванию CXCR4 в виде мономеров;

2) узнаванию CXCR4 в виде CXCR4/CXCR4 гомодимера;

3) узнаванию CXCR4 в виде CXCR4/CXCR2 гетеродимера;

4) иммунопреципитации CXCR4 из клеточного лизата;

5) узнаванию CXCR4 на поверхности CXCR4-экспрессирующих клеток посредством FACS (от англ. fluorescence-activated cell sorting - сортировка клеток с активированной флуоресценцией); и

6) узнаванию CXCR4 методом иммуногистохимии.

Из-за этих новых свойств, прежде неизвестных для антитела I-3859, авторы изобретения обнаружили, что указанное антитело может быть применено для идентификации CXCR4-экспрессирующих клеток и, в частности, экспрессирующих CXCR4 опухолевых клеток.

Таким образом, данное изобретение состоит в применении указанного антитела для обнаружения присутствия и/или местоположения CXCR4-зкспрессирующего заболевания. Изобретение может быть использовано в диагностике и/или прогнозировани, предпочтительно in vitro, CXCR4-экспрессирующих заболеваний. Предпочтительно указанным CXCR4-экспрессирующим заболеванием является рак.

Другим предпочтительным свойством антитела I-3859 в данном изобретении является распознавание эпитопа, близкого к эпитопу терапевтического моноклонального антитела 515Н7. Более конкретно, как было показано в экспериментальных примерах, I-3859 способно конкурировать с терапевтическим антителом 515Н7 за связывание с его эпитопом. Таким образом, указанное антитело I-3859 может использоваться, например, для выбора пациентов для лечения с помощью 515Н7 Mab. В частности, антитело I-3859 может быть использовано, для того чтобы проверить, что конформация CXCR4, присутствующего на поверхности клеток пациента, аналогична конформации, распознаваемой антителом 515Н7, показывая, что указанный пациент поддается терапии на основе антител 515Н7.

Первый аспект изобретения представляет собой выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, специфически связывающееся с CXCR4 с высоким сродством и лишенное какой-либо активности in vivo. Указанное выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, может быть применено в методах диагностики или прогнозирования патологических гиперпролиферативных онкогенных нарушений, опосредованных экспрессией CXCR4. В частности, указанные выделенные антитела могут быть использованы для in vivo визуализации. Предпочтительно, выделенное антитело в данном изобретении связывается с человеческим CXCR4.

В предпочтительном варианте изобретения, выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его производное предоставляется для применения в обнаружении присутствия CXCR4-экспрессирующих опухолей, где указанное антитело содержит по меньшей мере одну дополнительную CDR (complementary determining region - определяющая комплементарность антитела антигену область), выбранную из CDRs, включающих аминокислотную последовательность SEQ ID Nos: от 1 до 6 или по меньшей мере одну CDR, чья последовательность по крайней мере на 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям от 1 до 6.

Более предпочтительно, изобретение включает антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или их производные, в соответствии с данным изобретением, полученные путем генетической рекомбинации или химического синтеза.

В соответствии с предпочтительным вариантом данного изобретения антитело, или его производное, или его антигенсвязывающий фрагмент, характеризуется тем, что состоит из моноклонального антитела.

Термин "моноклональное антитело", употребляемый в данном описании, означает антитело, полученное из почти гомогенной популяции антител. Более конкретно, отдельные антитела из популяции идентичны за исключением редких произошедших естественным путем мутаций, присутствующих в минимальных пропорциях. Другими словами, моноклональное антитело состоит из гомогенного антитела, полученного путем роста одного клеточного клона (например, гибридомы, эукариотическая клетка-хозяин, трансфецированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотическая клетка-хозяин, трансфецированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, и т.д.) и, как правило, характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, обычно включающих разные антитела, направленные против различных детерминант, или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа конкретного антигена.

Типичные антитела IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемых определяющими комплементарность областями ("CDRs") или "гипервариабельными участками", ответственные в первую очередь за связывание с эпитопом антигена. Они обычно называются CDR1, CDR2 и CDR3 и нумеруются последовательно с N-конца. Более высоко консервативные части вариабельных областей называются "каркасные области".

Существуют три CDRs тяжелых цепей и 3 CDRs легких цепей. Термин CDR или CDRs, используется в данном описании для того, чтобы указать, в зависимости от случая, одна из этих областей или несколько, или даже все из этих областей, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственны за связывание с помощью аффинности антитела к распознаваемому антигену или эпитопу.

В соответствии с изобретением, CDRs антитела будут определены в соответствии с системой нумерации IMGT. Для специалиста в данной области будет очевидно вывести CDRs, в соответствии с Kabat из CDRs, в соответствии с IMGT. CDRs, в соответствии с Kabat должны рассматриваться как часть изобретения.

Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов вне зависимости от рецептора антигена, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, С., Ruiz, M., Giudicelli,. V., Foulquier, E., Truong, L, Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Сотр. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT, консервативные аминокислоты всегда имеют ту же самую позицию, например цистеин 23 (первый - CYS), триптофан 41 (сохраненный - TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-й CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1 - IMGT: позиции с 1 до 26, FR2 - IMGT: с 39 до 55, FR3 - IMGT: с 66 до 104 и FR4 - IMGT: с 118 до 128) и гипервариабельных участков: CDR1 - IMGT: с 27 до 38, CDR2 - IMGT: с 56 до 65 и CDR3 - IMGT: с 105 до 117. Поскольку разрывы представляют собой оставшиеся позиции, длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделяются точками, например, [8.8.13]) становится важной информацией. Уникальная нумерация IMGT применяется в графических 2D представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P.,' Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

В частности, согласно первому аспекту изобретение включает антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, или его производное, способные специфически связываться с CXCR4, включающим: I) тяжелую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну из следующих CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как определено в соответствии с системой нумерации IMGT, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No.1, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No.2 и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No.3; и/или II) легкую цепь, содержащую, по меньшей мере, одну из следующих CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как определено в соответствии с системой нумерации IMGT, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No.4, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No.5 и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No.6.

В еще одном варианте данное изобретение также может являться антителом или антигенсвязывающим фрагментом, или его производным, содержащим:

- тяжелую цепь, содержащую следующие три CDRs, как определено в соответствии с IMGT, соответственно CDR-H1, имеющую последовательность SEQ ID No.1, CDR-H2, имеющую последовательность SEQ ID No.2 и CDR-H3, имеющую последовательность SEQ ID No.3, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичность после оптимального выравнивания последовательностей с SEQ ID No.1, 2 или 3 соответственно; и

- легкую цепь, содержащую следующие три CDRs, как определено в соответствии с IMGT, соответственно CDR-L1, имеющую последовательность SEQ ID No.4, CDR-L2, имеющую последовательность SEQ ID No.5 и CDR-L3, имеющую последовательность SEQ ID No.6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичность после оптимального выравнивания последовательностей с SEQ ID No.4, 5 или 6, соответственно.

В контексте настоящего изобретения "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученными после оптимального выравнивания. Данный процент является чисто статистическим и различия между двумя последовательностями распределены случайным образом по их длине. Сравнение последовательностей двух нуклеиновых кислот или аминокислот традиционно проводится путем сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, указанное сравнение возможно проводить по сегментам или с помощью "окна выравнивания". Оптимальное выравнивание сравнениваемых последовательностей может быть осуществлено, в дополнение к сравнению вручную, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита- Ватермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Bioi. 48:443], с помощью алгоритма локальной гомологии Пирсона-Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или с помощью компьютерного программного обеспечения использующего перечисленные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном комплексе Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или с помощью программного обеспечения BLAST NR или BLAST P).

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, в ходе которого сравниваемые последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, способные содержать вставки или делеции, сравниваются с контрольной последовательностью для их оптимального выравнивания. Процент идентичности рассчитывают путем определения числа положений, в которых аминокислота или нуклеотидный остаток идентичен в обеих последовательностях, деления количества идентичных положений на общее число положений в окне выравнивания и умножения результата на 100 для получения процента идентичности между двумя последовательностями.

Например, программа BLAST, "BLAST 2 последовательности " (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbial., 1999, Lett. 174:247-250) доступная на сайте http://www.ncbi.nhn.nih.gov/gorf/bl2.html, может быть использована с параметрами по умолчанию (в частности, для параметров "open gap penalty": 5, и "extension gap penalty": 2; выбранной матрицей является, например, "BLOSUM 62" матрица, предлагаемая программой); процент идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями вычисляется непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, проявляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичности с эталонной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают те, которые содержат эталонную последовательность, некоторые модификации, в особенности делеция, вставка или замена по крайней мере одной аминокислоты, укорочение или удлинение. В случае замены одной или более последовательных или непоследовательно идущих аминокислот, предпочтение отдается таким заменам, в которых замещенные аминокислоты заменены на "эквивалентные" аминокислоты. В данном описании выражение "эквивалентная аминокислота" используется для обозначения любой аминокислоты, замена которой на одну из структурных аминокислот, не приведет к изменению биологической активности соответствующих антител и в тех конкретных примерах, приведенных ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены или по их структурной гомологии с аминокислотами, которые они замещают или по результатам сравнительных испытаний биологической активности между различными антителами, которые могут быть получены.

В качестве неисчерпывающего примера ниже в таблице 1 приведены возможные замены, которые вероятно не будут приводить к значительному изменению биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Таблица 1
Исходный остаток	Замена(ы)
Ala (А)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His

Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
Ile (I)	Leu
Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

Согласно еще одному варианту изобретение представляет собой антитело I-3859, или один из его антигенсвязывающих фрагментов или производных, указанное антитело, содержащее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No.7 или последовательность с, по крайней мере, 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичности после оптимального выравнивания с последовательностью SEQ ID No.7; и/или содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No.8, или последовательность с, по крайней мере, 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичности после оптимального выравнивания с последовательностью SEQ ID No.8.

В частности, указанное антигенсвязывающее производное состоит из связывающего белка, содержащего каркасный пептид, на который привита по крайней мере одна CDR, причем указанная CDR привита таким образом, чтобы сохранить все или часть свойств распознавания паратопа исходного антитела. В предпочтительном варианте осуществления указанный антигенсвязывающий белок представляет собой слитый белок, состоящий из каркасного пептида и по меньшей мере одной указанной CDR.

Одна или несколько последовательностей среди шести CDR последовательностей, описанных в данном изобретении, также могут присутствовать на различных иммуноглобулиновых каркасных белках. В этом случае последовательность белка делает возможным воссоздание пептидного скелета, подходящего для правильной укладки привитых CDRs, позволяя им сохранить свои свойства распознавания паратопа антигена.

Специалист в данной области будет осведомлен о способах выбора типа каркасного белка для прививки CDR. В частности, известно, что выбранные каркасные белки должны соответствовать как можно большему количеству критериев (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187):

- достаточная филогенетическая консервативность;

- известная трехмерная структура (определенная, например, путем кристаллографии, ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии или любым другим способом, известным специалисту в данной области);

- небольшой размер;

- пост-транскрипционных модификаций мало или совсем нет; и/или

- легко производить,экспрессировать и очищать.

Источником этих белковых каркасов могут быть структуры, отобранные среди фибронектина и предпочтительно 10 домен фибронектина III типа, липокалин, антикалин (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), белок Z, полученный из домена В белка А золотистого стафилококка, тиоредоксин А или белки с повторяющимися мотивами наподобие "анкириновых повторов" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol.100, No.4, 1700-1705), "армадилловых повторов", "лейцин-богатых повторов" и "тетратрикопептидных повторов", но ими выбор не ограничивается. Все подобные белковые мотивы были широко охарактеризованы в данной области, и, таким образом, хорошо известны специалистам в данной области.

Как описано выше, такие пептидные каркасы составляют от 1 до 6 CDRs, полученных из исходного антитела. Предпочтительно, но не является обязательным требованием, чтобы специалист в данной области техники выбирал хотя бы одну CDR из тяжелой цепи, поскольку последняя, как известно, в первую очередь отвечает за специфичность антитела. Выбор одного или нескольких соответствующих CDRs, очевиден специалисту в данной области, который будет затем выбирать подходящий известный способ (Beset al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

По антигенсвязывающим фрагментам антитела в соответствии с изобретением, должны быть пониматься, например, фрагменты Fv, scFv (sc=single chain - одноцепочечный), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или диатела или любой фрагмент, чей период полураспада был увеличен путем химической модификации, такой как добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) (ПЭГилированные фрагменты называют Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab’)₂-ПЭГ и Fab'-ПЭГ), либо включение в липосому, микросферы или PLGA, указанные фрагменты, обладающие по крайней мере одним из характерных CDRs по изобретению, которые в особенности способны проявлять основную активность, даже частичную, антитела, из которого они получены.

Предпочтительно, указанный антигенсвязывающие фрагменты будут содержать или включать в себя часть последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, из которого они получены, упомянутая часть последовательности достаточна, чтобы сохранить ту же специфичность связывания, что и антитело, из которого она получена и достаточную аффинность, предпочтительно, по меньшей мере, равную 1/100, более предпочтительно, по крайней мере, 1/10 от таковой у антитела, из которого она получена.

Такой антигенсвязывающий фрагмент будет содержать, по крайней мере, пять аминокислот, предпочтительно 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 или 100 идущих друг за другом аминокислот из последовательности антитела, из которого он получен.

Предпочтительно, чтобы эти антигенсвязывающие фрагменты представляли собой Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или диатела, обычно обладающие такой же специфичностью связывания, что и антитело, из которого они получены. В соответствии с данным изобретением, антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены из антител, описанных выше такими методами, как ферментативное расщепление, в том числе пепсином или папаином, и/или путем расщепления дисульфидных мостиков посредством химического восстановления. Фрагменты антител могут быть также получены с помощью методов рекомбинантной генетики, также известных специалисту в данной области, или с помощью пептидного синтеза с помощью, например, автоматических синтезаторов пептидов, наподобие тех, которые продаются фирмой Applied Biosystems, и т.д.

Мышиная гибридома, способная секретировать моноклональное антитело согласно изобретению, депонирована в CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция, 22 октября 2007 года под номером I-3859. Указанная гибридома получена путем слияния Balb/C иммунизированных спленоцитов мышей и клеток миеломы Sp 2/O-линии Ag 14.

Моноклональное антитело, называемое в данном описании 301аЕ5 или I-3859, или его антигенсвязывающий фрагмент или производное, арактеризуется тем, что выделяется указанной гибридомой.

Антитело I-3859 также может быть описано через его нуклеотидные последовательности, т.е. как содержащий тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, кодируемый последовательностью SEQ ID No.9, CDR-H2, кодируемый последовательностью SEQ ID No.10 и CDR-НЗ, кодируемый последовательностью SEQ ID No.11; и/или легкую цепь, содержащую CDR-L1, кодируемый последовательностью SEQ ID No.12, CDR-L2, кодируемый последовательностью SEQ ID No.13 и CDR-L3, кодируемый последовательностью SEQ ID No.14.

Антитело I-3859 содержит тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No.15, или нуклеотидной последовательностью демонстрирующей процент идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с SEQ ID No.15; и/или легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID No.16, или нуклеотидной последовательностью демонстрирующей процент идентичности, по меньшей мере, 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с SEQ ID No.16.

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеиновая последовательность", "последовательность нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность", используются взаимозаменяемо в данном описании, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированных или нет, определяя фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержащие или не содержащие неприродные нуклеотиды, и представляющую собой или двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или транскрипционный продукт указанных ДНК.

"Нуклеиновые последовательности, демонстрирующей процент идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с предпочтительной последовательностью" означает нуклеиновые последовательности, проявляющие, по отношению к эталонной нуклеиновой последовательности, некоторые модификации, такие как, в частности, делеция, укорочение, удлинение, химерное слияние и/или замена, особенно точечные. Предпочтительно, чтобы данные последовательности кодировали те же аминокислотные последовательности, что и эталонная последовательность, что связано с вырожденностью генетического кода, или были комплементарными последовательностями, способными специфически гибридизоваться с эталонными последовательностями, предпочтительно в крайне жестких условиях, в частности определенных ниже.

Гибридизация в крайне жестких условиях означает, что условия, связаны с температурой и ионной силой выбранными таким образом, что они обеспечивают поддержание гибридизации между двумя комплементарными фрагментами ДНК. На чисто иллюстративной основе, крайне жесткие условия на стадии гибридизации с целью определения нуклеотидных фрагментов, описанных выше, являются предпочтительными следующим образом.

ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации осуществляют в два этапа: (1) предгибридизация при 42°С в течение трех часов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,5), содержащего 5Х SSC (1X SSC соответствует раствору 0,15 М NaCl+0,015 М цитрат натрия), 50% формамида, 7% SDS (sodium dodecyi sulfate - додецилсульфат натрия), 10Х раствор Денхардта, 5% сульфат декстрана и 1% ДНК спермы лосося; (2) основная гибридизация в течение 20 часов при температуре в зависимости от длины зонда (то есть: 42°С для зонда >100 нуклеотидов в длину) с последующими двумя 20-минутными промывками при 20°С в 2Х SSC+2% SDS, одна 20-минутная промывка при 20°С в 0,1Х SSC+0,1% SDS. Последнюю промывку проводят в 0,1Х SSC+0,1% SDS в течение 30 минут при 60°С для зонда >100 нуклеотидов в длину. Крайне жесткие условия гибридизации, описанные выше для полинуклеотида определенного размера могут быть адаптированы