Транзитный пептид хлоропластов

Транзитный пептид хлоропластов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/593555, поданной 1 февраля 2012 года, а также по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/625222, поданной 17 апреля 2012 года.

ПОЛОЖЕНИЕ В СООТВЕТСТВИИ С 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e) - СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ASCII

В соответствии с 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e), файл, содержащий текстовую версию ASCII списка последовательностей, предоставлен совместно с настоящей заявкой.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам генетического кодирования и экспрессии полипептидов, которые нацеливаются в хлоропласты высших растений. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые нацеливают полипептиды в хлоропласты, и/или к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим их. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая контролирует транспорт химерных полипептидов в хлоропласты, и/или к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим их.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Клетки растений содержат различные субклеточные органеллы, в общем называемые "пластидами", которые ограничены характерными мембранными системами и выполняют специализированные функции в клетке. Конкретные пластиды ответственны за фотосинтез, а также за синтез и запасание определенных химических соединений. Все пластиды происходят из пропластид, которые присутствуют в меристематических областях растения. Пропластиды могут развиваться, например, в: хлоропласты, этиопласты, хромопласты, геронтопласты, лейкопласты, амилопласты, элайопласты и протеинопласты. Пластиды существуют полуавтономным образом в клетке, они включают их собственную генетическую систему и аппарат синтеза белков, однако они зависят от тесного взаимодействия с ядерно-цитоплазматической системой в их развитии и биосинтетической активности.

В фотосинтезирующих клетках листьев высших растений наиболее заметными пластидами являются хлоропласты. Наиболее важной функцией хлоропластов является проведение запускаемых светом реакций фотосинтеза. Однако хлоропласты также осуществляют многие другие важные для клетки растения биосинтетические процессы. Например, все жирные кислоты клетки производятся ферментами в строме хлоропластов с использованием ATP, NAOPH и углеводов, которые свободно доступны в них. Более того, восстанавливающая мощность активируемых светом электронов обеспечивает восстановление нитрита (NO₂^-) в аммиак (NH₃) в хлоропластах; этот аммиак обеспечивает растение азотом, требуемым для синтеза аминокислот и нуклеотидов.

Хлоропласт также принимает участие в процессах, имеющих особое значение для агрохимической промышленности. Например, известно, что многие гербициды действуют, блокируя функции, которые выполняют хлоропласты. В недавних исследованиях была идентифицирована конкретная мишень нескольких гербицидов. Например, происходящие из триазинов гербициды ингибируют фотосинтез путем вытеснения молекулы пластохинона из его участка связывания в полипептиде массой 32 кДа фотосистемы II. Этот полипептид массой 32 кДа кодируется в геноме хлоропластов и синтезируется аппаратом органелл. Также были получены мутантные растения, которые являются устойчивыми к триазиновым гербицидам. Эти растения содержит мутантный полипептид массой 32 кДа, из которого пластохинон более не вытесняется триазиновыми гербицидами. Сульфонилмочевины ингибируют ацетолактатсинтазу в хлоропласте. Ацетолактатсинтаза вовлечена в синтез изолейцина и валина. Глифосат ингибирует функцию 5-енолпирувил-3-фосфошикиматсинтазы (EPSPS), которая представляет собой фермент, вовлеченный в синтез ароматических аминокислот. Все эти ферменты кодируются ядерным геномом, однако они перемещаются в хлоропласт, где происходит фактический синтез аминокислот.

Большинство белков хлоропластов кодируются в ядре клетки растения, синтезируются в качестве более крупных белков-предшественников в цитозоле и посттрансляционно импортируются в хлоропласт. Импорт через наружную и внутреннюю мембраны оболочки в строму является основным путем вхождения в белки, предназначенные для поступления в строму, мембрану тилакоида и просвет тилакоида. Локализация импортированных белков-предшественников в мембране тилакоида и просвете тилакоида осуществляется четырьмя различными механизмами, включая два из них, которые гомологичны системам транспорта бактериальных белков. Таким образом, механизмы локализации белка в хлоропластах частично происходят из прокариотического эндосимбионта. Cline and Henry (1996), Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26.

Белки-предшественники, предназначенные для экспрессии в хлоропластах, содержат N-концевые удлинения, известные как транзитные пептиды хлоропластов (CTP). Транзитный пептид является инструментов для специфического распознавания поверхности хлоропластов и для опосредования посттрансляционного перемещения пребелков через оболочку хлоропластов, и, таким образом, в различные субкомпартменты в хлоропласте (например, строма, тилакоид и мембрана тилакоида). Эти N-концевые транзитные пептидные последовательности содержат всю информацию, необходимую для импорта белка хлоропластов в пластиды; транзитные пептидные последовательности необходимы и достаточны для импорта в пластиду.

Гены растений, содержащие, согласно сообщениям, естественным образом кодируемые транзитные пептидные последовательности на их N-конце, включают малую хлоропластную субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho et al. (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42); EPSPS (см., например, Archer et al. (1990), J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 и United States Patents 6867293, 7045684, и Re. 36,449); триптофансинтазы (Zhao et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7); пластоцианина (Lawrence et al. (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63); хоризматсинтазы (Schmidt et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57); аккумулирующий световую энергию белок, связывающий хлорофилл a/b, (LHBP) (Lamppa et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999); и белок хлоропластов Arabidopsis thaliana (Lee et al. (2008), Plant Cell 20:1603-22). В публикации заявки на патент США № US 2010/0071090 описаны определенные нацеливающие на хлоропласты пептиды из Chlamydomonas sp.

Однако структурные требования к информации, кодируемой нацеливающими на хлоропласты пептидами, остаются неясными вследствие их высокого уровня разнообразия последовательности и отсутствия общих или консенсусных мотивов последовательности, хотя возможно, что они являются отдельными подгруппами нацеливающих на хлоропласты пептидов с независимыми структурными мотивами. Lee et al. (2008), выше. Кроме того, не все из этих последовательностей пригодны для гетерологичной экспрессии нацеленных на хлоропласты белков в высших растениях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны композиции и способы для нацеливания полипептидов в растении в хлоропласты. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропластов (например, пептид TraP14 или TraP24), функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В конкретных вариантах осуществления такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть полезными для экспрессии и нацеливания полипептида, кодируемого представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, в однодольном и двудольном растении. Кроме того, описаны векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой прокариотическую нуклеотидную последовательность (например, последовательность, выделенную из Cyanobacterium или Agrobacterium), или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой нуклеотидную последовательность, выделенную из низшего фотосинтезирующего эукариотического организма (например, последовательность, выделенная из хлорофита, такого как Chlamydomonas и Dunaliella), или ее функциональный вариант. В конкретных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой нуклеотидную последовательность, выделенную из Dunaliella salina или Chlamydomonas reinhardtii. В следующих вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой химерную нуклеотидную последовательность, содержащую неполную нуклеотидную последовательность прокариотического транзитного пептида хлоропластов TraP14 и TraP24, или его функционального варианта. В следующих вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой химерную нуклеотидную последовательность, содержащую более одной нуклеотидной последовательности эукариотического транзитного пептида хлоропластов, такую как более одной (например, две) нуклеотидных последовательности транзитного пептида хлоропластов из различных видов растении, или их функциональные варианты. В следующих вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, может представлять собой синтетическую нуклеотидную последовательность, которая может быть сконструирована по меньшей мере частично на основе нуклеотидной последовательности прокариотического транзитного пептида хлоропластов TraP14 и TraP24.

В некоторых вариантах осуществления композиции содержат молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одно средство для нацеливания полипептида в хлоропласт, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В конкретных вариантах осуществления, такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть пригодными для экспрессии и нацеливания полипептида, кодируемого представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, в однодольном или двудольном растении. Кроме того, описаны векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одно средство для нацеливания полипептида на хлоропласт, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Средствами для нацеливания полипептида на хлоропласт является нуклеотидная последовательность TraP14 и TraP24 и ее функциональные эквиваленты.

Также в настоящем описании описаны растения, ткани растения и клетки растения, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления растение, ткань растения или клетка растения могут иметь такую молекулу нуклеиновой кислоты, стабильно встроенную в ее геном. В некоторых вариантах осуществления растение, ткань растения или клетка растения могут временно экспрессировать такую молекулу нуклеиновой кислоты.

Также описаны способы для экспрессии нуклеотидной последовательности в растении или клетке растения в хлоропластах растения или клеток растения. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, можно использовать для трансформации клетки растения так, чтобы продуцировался слитый полипептид-предшественник, содержащий транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, слитый с продуктом экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в цитоплазме клетки растения, а затем слитый полипептид транспортируется in vivo в хлоропласт клетки растения.

Кроме того, описаны способы получения трансгенного растения, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропластов TraP14 и TraP24, функционально связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Также описаны растительные продукты (например, семена), полученные из таких трансгенных растений.

Указанные выше и другие признаки станут более понятными из представленного ниже описания нескольких вариантов осуществления, которые предоставлены с учетом прилагаемых фигур.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлено динамическое изображение молекулы мРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид TraP14 или TraP24, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления молекула мРНК, такая как представленная молекула, может транскрибироваться с молекулы ДНК, содержащей открытую рамку считывания, содержащую последовательность, кодирующую пептид TraP14 или TraP24, функционально связанную с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность может представлять собой последовательность, кодирующую представляющий интерес пептид, например, но не ограничиваясь этим, продукт маркерного гена или пептид, нацеливаемый на пластиду.

На фиг. 2 проиллюстрировано выравнивание предсказанных транзитных пептидов хлоропластов для белка глицерин-3-фосфатдегидрогеназы (GPDH) (SEQ ID NO: 1) и белка 3-енолпирувилшикимат-5-фосфатсинтетазы (EPSPS) (SEQ ID NO: 2) из Dunaliella salina. Звездочкой указано, где последовательности расщеплены и рекомбинированы с образованием TraP14 (SEQ ID NO: 3).

На фиг. 3 проиллюстрировано выравнивание предсказанных транзитных пептидов хлоропластов для белка EPSPS из Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 4) и белка EPSPS из Dunaliella salina (SEQ ID NO: 5). Звездочкой указано, где последовательности были расщеплены и рекомбинированы с образованием TraP24 (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 4 проиллюстрирована карта плазмиды pDAB109902.

На фиг. 5 проиллюстрировано микроскопическое изображение TraP14-GFP, трансформированного в протопласты кукурузы, на котором показано перемещение в хлоропласты протопласта кукурузы.

На фиг. 6 проиллюстрирована карта плазмиды pDAB107532.

На фиг. 7 проиллюстрирована карта плазмиды pDAB107534.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновой кислоты, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Представлена только одна цепь последовательности нуклеиновой кислоты, однако понятно, что комплементарная цепь включена путем указания представленной цепи. На прилагаемом списке последовательностей:

В SEQ ID NO: 1 представлена аминокислотная последовательность пептида GPDH из Dunaliella salina.

В SEQ ID NO: 2 представлена аминокислотная последовательность пептида EPSPS из Dunaliella salina.

В SEQ ID NO: 3 представлена аминокислотная последовательность химерного слитого белка TraP14.

В SEQ ID NO: 4 представлена аминокислотная последовательность пептида EPSPS из Chlamydomonas reinhardtii.

В SEQ ID NO: 5 представлена аминокислотная последовательность пептида EPSPS из Dunaliella salina.

В SEQ ID NO: 6 представлена аминокислотная последовательность химерного слитого белка TraP24.

В SEQ ID NO: 7 представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид TraP14, обозначенный как TraP14v2.

В SEQ ID NO: 8 представлена нуклеотидная последовательность пептида TraP24, обозначенного как TraP24 v2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Обзор нескольких вариантов осуществления

Транзитный пептид хлоропластов (CTP) (или транзитный пептид пластид) функционирует во время трансляции или после трансляции, направляя полипептид, содержащий CTP в пластиду, например, хлоропласт. В некоторых вариантах осуществления изобретения либо эндогенные белки хлоропластов, либо гетерологичные белки хлоропластов, могут быть направлены в хлоропласт путем экспрессии такого белка в качестве более крупного предшественника, содержащего CTP.

В иллюстративном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CTP, выделяли из последовательности гена EPSPS, полученной из Dunaliella salina (номер доступа базы данных NCBI № AMBM68632), последовательности гена GPDH, полученной из Dunaliella salina (номер доступа базы данных NCBI № EU624406), и последовательности гена EPSPS, полученной из Chlamydomonas reinhardtii (номер доступа базы данных NCBI № XP_001702942). CTP был идентифицирован и выделен из полноразмерного белка путем анализа последовательности гена с помощью сервера для прогнозирования ChloroP. Emanuelsson et al. (1999), Protein Science 8:978-84 (доступен на cbs.dtu.dk/services/ChloroP). Предсказанный белковый продукт выделенных кодирующих CTP последовательностей использовали для получения химерных кодирующих CTP последовательностей нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, TraP14 и TraP24.

В следующем иллюстративном варианте осуществления пептид TraP14 синтезировали независимо и подвергали слиянию с желтым флуоресцентным белком (GFP) с получением химерного полипептида TraP14-GFP. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный полипептид TraP14-GFP, вводили в бинарный вектор, так чтобы кодирующая TraP14-GFP последовательность нуклеиновой кислоты была функционально связана с промотором AtUbi10.

В следующем иллюстративном варианте осуществления бинарный вектор, содержащий кодирующую TraP14-GFP последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с промотором AtUbi10, временно трансформировали в кукурузу (Zea mays) с помощью Agrobacterium. Конфокальная микроскопия и анализ с использованием вестерн-блоттинга подтвердили, что TraP14 успешно нацеливал GFP в хлоропласты кукурузы.

В следующем иллюстративном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодировала синтетический пептид TraP по изобретению, синтезировали независимо и функционально связывали с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей агрономически важную последовательность гена. Последовательности TraP подвергали слиянию с признаками устойчивости к гербициду (например, dgt-32 и dgt-33) с получением синтетических молекул нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодировала химерный слитый полипептид TraP14:DGT-32 или TraP24:DGT-33. Такие молекулы нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодировала химерный полипептид TraP14:DGT-32 или TraP24:DGT-33, вводили в бинарный вектор, так чтобы каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая TraP14:dgt-32 или TraP24:dgt-33, была функционально связана с промотором и другими регуляторными элементами генов. Бинарный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TraP14:dgt-32 или TraP24:dgt-33, использовали для трансформации вида растений varopis. Трансгенные растения анализировали в отношении устойчивости к гербицидам в результате экспрессии и перемещения ферментов DGT-32 или DGT-33 в хлоропласт.

Ввиду указанных выше детальных рабочих примеров последовательности TraP14 и TraP24 по изобретению можно использовать, чтобы направить любой полипептид в пластиду в широком диапазоне видов растений. Например, с помощью способов, которые станут доступными специалистам в данной области с помощью настоящего изобретения, химерный полипептид, содержащий последовательность пептида TraP14 и TraP24, слитую с N-концом любой второй пептидной последовательности, можно вводить в клетку-хозяина для нацеливания второй пептидной последовательности в пластиду. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, пептид TraP14 и TraP24 может обеспечить увеличенную эффективность импорта и обработки пептида, для которого является желательной экспрессия в пластиде.

II. Сокращения

CTP транзитный пептид хлоропластов

EPSPS 3-енолпирувилшикимат-5-фосфатсинтетаза

YFP желтый флуоресцентный белок

T_i индуцирующий опухоль (плазмиды, происходящие из A. tumefaciens)

T-ДНК трансферная ДНК

III. Термины

Чтобы упростить обзор различных вариантов осуществления изобретения, предоставлены следующие пояснения конкретных терминов:

Транзитный пептид хлоропластов: как используют в рамках изобретения, термин "транзитный пептид хлоропластов" (CTP) (или "транзитный пептид пластид") может относиться к аминокислотной последовательности, которая, когда она присутствует на N-конце полипептида, направляет импорт полипептида в пластиду клетки растения, например, хлоропласт. CTP обычно необходим и достаточен для направления импорта белка в пластиду (например, первичная, вторичная или третичная пластида, такая как хлоропласт) клетки-хозяина. Предполагаемый транзитный пептид хлоропластов может быть идентифицирован с помощью одного из нескольких доступных алгоритмов (например, PSORT и ChloroP (доступные на www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). ChloroP может особенно хорошо предсказывать транзитные пептиды хлоропластов. Emanuelsson et al. (1999), Protein Science 8:978-84. Однако ни один из существующих алгоритмов не обеспечивает предсказание функциональных транзитных пептидов хлоропластов со 100% эффективностью. Таким образом, важно подтвердить, что в идентифицированный предполагаемый транзитный пептид хлоропластов действительно функционирует, например, как предусматривается в методологии in vitro или in vivo.

Транзитные пептиды хлоропластов могут быть расположены на N-конце полипептида, который импортируется в пластиду. Транзитный пептид может облегчать транспорт во время трансляции или после трансляции полипептида, содержащего CTP, в пластиду. Транзитные пептиды хлоропластов, как правило, содержат от приблизительно 40 до приблизительно 100 аминокислот, и выявлено, что такие CTP содержат определенные общие характеристики, например, CTP содержат очень мало, или даже не содержат, отрицательно заряженных аминокислот (таких как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин или глутамин); N-концевые области CTP лишены заряженных аминокислот, глицина и пролина; центральная область CTP также, вероятно, имеет высокое содержание основных или гидроксилированных аминокислот (таких как серин и треонин); и C-концевая область CTP, вероятно, обогащена аргинином и может содержать амфипатическую структуру бета-слоя. Протеазы пластид могут отщеплять CTP от оставшейся части полипептида, содержащей CTP, после импорта полипептида в пластиду.

Контакт: как используют в рамках изобретения, термин "контакт с" или "захват" клеткой, тканью или организмом (например, клеткой растения; тканью растения и растением), в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, включает интернализацию молекулы нуклеиновой кислоты в организм, например, но не ограничиваясь этим: контактирование организма с композицией, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты; и пропитывание организмов раствором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты.

Эндогенный: как используют в рамках изобретения, термин "эндогенный" относится к веществам (например, молекулы нуклеиновой кислоты и полипептиды), которые происходят из конкретного организма, ткани или клетки. Например, "эндогенный" полипептид, экспрессируемый в клетке растения, может относиться к полипептиду, который обычно экспрессируется в клетках того же типа из не модифицированных способами генной инженерии растений того же вида.

Экспрессия: как используют в рамках изобретения, "экспрессия" кодирующей последовательности (например, гена или трансгена) относится к процессу, посредством которого кодируемая информация транскрипционного элемента нуклеиновой кислоты (включая, например, геномную ДНК или кДНК) преобразуется в функциональную, нефункциональную или структурную часть клетки, часто включающему синтез белка. На экспрессию генов могут влиять внешние сигналы; например, воздействие на клетку, ткань или организм агента, который увеличивает или снижает экспрессию гена. Экспрессия гена также может регулироваться на любом этапе в каскаде от ДНК к РНК к белку. Регуляция экспрессии гена происходить, например, путем контроля, действующего на транскрипцию, трансляцию, транспорт и процессинг РНК, деградацию промежуточных молекул, таких как мРНК, или путем активации, инактивации, компартментализации или деградации конкретных молекул белков после их получения, или путем любой их комбинации. Экспрессию гена можно измерять на уровне РНК или на уровне белка любым способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг или анализ(ы) активности белка in vitro, in situ или in vivo.

Генетический материал: как используют в рамках изобретения, термин "генетический материал" включает все гены и молекулы нуклеиновых кислот, такие как ДНК и РНК.

Гетерологичный: как используют в рамках изобретения, термин "гетерологичный" относится к веществам (например, молекулы нуклеиновой кислоты и полипептиды), которые не происходят из конкретного организма, ткани или клетки. Например, "гетерологичный" полипептид, экспрессируемый в клетке растения, может относиться к полипептиду, который обычно не экспрессируется в клетках того же типа из не модифицированных способами генной инженерии растений того же вида (например, полипептид, который экспрессируется в других клетках того же организма или клетках другого организма).

Выделенный: как используют в рамках изобретения, термин "выделенный" относится к молекуле (например, молекулы нуклеиновой кислоты и полипептиды), которые по существу отделены или очищены от других молекул того же типа (например, другие молекулы нуклеиновой кислоты и другие полипептиды), с которыми молекула обычно ассоциирована в клетке организма, в котором молекула встречается естественным образом. Например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть по существу отделена или очищена от хромосомной ДНК или внехромосомной ДНК в клетке организма, в которой молекула нуклеиновой кислоты встречается естественным образом. Таким образом, термин включает рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты и полипептиды, которые биохимически очищены так, чтобы другие молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды и клеточные компоненты, были удалены. Также термин включает рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, химически синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты и рекомбинантно продуцированные полипептиды.

Термин "по существу очищенный", как используют в рамках изобретения, относится к молекуле, которая отделена от других молекул, обычно ассоциированных с ней в ее нативном состоянии. По существу очищенная молекула может быть преобладающим видом, присутствующим в композиции. По существу очищенная молекула может быть, например, по меньшей мере на 60% свободной, по меньшей мере на 75% свободной, или по меньшей мере на 90% свободной от других молекул, помимо растворителя, присутствующего в природной смеси. Термин "по существу очищенный" не относится к молекулам, присутствующим в их нативном состоянии.

Молекула нуклеиновой кислоты: как используют в рамках изобретения, термин "молекула нуклеиновой кислоты" может относиться к полимерной форме нуклеотидов, которая может включать как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК, и их синтетические формы и смешанные полимеры. Нуклеотид может относиться к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированной форме любого типа нуклеотида. "Молекула нуклеиновой кислоты", как используют в рамках изобретения, является синонимом "нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотида". Молекула нуклеиновой кислоты обычно имеет по меньшей мере 10 оснований в длину, если нет иных указаний. Термин включает одноцепечечные и двухцепочечные формы ДНК. Молекулы нуклеиновой кислоты включают димерные (так называемые тандемные) формы, и продукты транскрипции молекул нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может включать либо модифицированные нуклеотиды, либо и те, и другие, связанные вместе встречающимися в природе и/или не встречающимися в природе нуклеотидными связями.

Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированными химически или биохимически, или могут содержать неприродные или преобразованные нуклеотидные основания, как хорошо понятно специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи: например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.; заряженные связи: например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.; выступающие части: например, пептиды; интеркалирующие агенты: например, акридин, псорален и т.д.; хелаторы; алкилаторы и модифицированные связи: например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает любую топологическую конформацию, включая одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексную, триплексную, шпилечную, кольцеобразную конформации и конформацию висячего замка.

Как используют в рамках изобретения в отношении ДНК, термин "кодирующая последовательность", "структурная нуклеотидная последовательность" или "структурная молекула нуклеиновой кислоты" относится к нуклеотидной последовательности, которая в конечном итоге транслируется в полипептид через транскрипцию и мРНК, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Что касается РНК, термин "кодирующая последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая транслируется в пептид, полипептид или белок. Границы кодирующей последовательности определяются путем трансляции инициирующего кодона на 5'-конце и стоп-кодона на 3'-конце. Кодирующие последовательности включают, но не ограничиваются ими: геномную ДНК; кДНК; EST и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.

В некоторых вариантах осуществления изобретение включает нуклеотидные последовательности, которые могут быть выделенными, очищенными или частично очищенными, например, с использованием способов разделения, например, таких как ионообменная хроматография; способов исключения по молекулярному размеру или по аффинности; способов фракционирования на основе растворимости в различных растворителях; или способов генетической инженерии, такие как амплификация, клонирование и субклонирование.

Идентичность последовательностей: термин "идентичность последовательностей" или "идентичность", как используют в рамках изобретения в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, может относиться к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие на протяжении указанного окна сравнения.

Как используют в рамках изобретения, термин "процент идентичности последовательностей" может относиться к величине, определяемой путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (например, последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей) на протяжении окна сравнения, где часть последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставок или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения количества положений, в которых идентичный нуклеотидный или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях с получением количества совпавших положений, деления количества совпавших положений на общее количество положений в окне сравнения, и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны, например, в: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Детальное рассмотрение способов выравнивания последовательностей и вычисления гомологии может быть найдено, например, в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST^™; Altschul et al. (1990)) от National Center for Biotechnology Information (NCBI) доступен из нескольких источников, в том числе National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), и через интернет, для применения совместно с несколькими программами анализа последовательностей. Описание того, как определять идентичность последовательностей с использованием этой программы, доступно через интернет в разделе "help" для BLAST™. Для сравнений последовательностей нуклеиновых кислот можно использовать функцию "Blast 2 sequences" программы BLAST™ (Blastn) с использованием матрицы BLOSUM62 по умолчанию с параметрами по умолчанию. Последовательности нуклеиновых кислот с большим сходством с эталонными последовательностями будут демонстрировать увеличение процентной идентичности при оценке этим способом.

Специфично гибридизующийся/специфически комплементарный: как используют в рамках изобретения, термины "специфично гибридизующийся" и "специфически комплементарный" представляют собой термины, которые указывают на достаточную степень комплементарности, чтобы между молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью происходило стабильное и специфическое связывание. Гибридизация между двумя молекулами нуклеиновых кислот вовлекает формирование антипараллельного выравнивания между последовательностями нуклеиновых кислот двух молекул нуклеиновой кислоты. Затем две молекулы способны образовывать водородные связи с соответствующими основаниями на противоположной цепи с образованием дуплексной молекулы, которая, если она является достаточно стабильной, поддается выявлению с использованием способов, хорошо известных в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты не должна быть на 100% комплементарной ее последовательности-мишени, чтобы быть специфически гибридизующейся. Однако величина комплементарности последовательностей, которая должна существовать для гибридизации, чтобы она была специфической, зависит от используемых условий гибридизации.

Условия гибридизации, обеспечивающие конкретные степени жесткости, варьируют, в зависимости от типа выбранного способа гибридизации и композиции и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновых кислот. Как правило, жесткость гибридизации определяется температурой гибридизации и ионной силой (особенно концентрацией Na⁺ и/или Mg⁺⁺) буфера для гибридизации, хотя также на жесткость влияет количество раз промывания. Вычисления, касающиеся условий гибридизации, требуемых для достижения конкретных степеней жесткости, известны средним специалистам в данной области, и рассмотрены, например, в Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; и Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Дальнейшая детальная инструкция и руководство в отношении гибридизации нуклеиновых кислот могут быть найдены, например, в Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; и Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

Как используют в рамках изобретения, "жесткие условия" охватывают условия, при которых гибридизация происходит, только если существует менее 20% несоответствий гибридизующейся молекулой и гомологичной последовательностью в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. "Жесткие условия" включают другие конкретные уровни жесткости. Таким образом, как используют в рамках изобретения, условия "умеренной жесткости" представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 20% несоответствием последовательностей не гибридизуются; условия "высокой жесткости" представляют собой условия, в которых последовательности с более чем 10% несоответствий не гибриди