Устойчивые к глифосату растения и способы, связанные с ними

Устойчивые к глифосату растения и способы, связанные с ними

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/593555, поданной 1 февраля 2012 года, и также по временной патентной заявке США с серийным номером № 61/625222, поданной 17 апреля 2012 года.

ПОЛОЖЕНИЕ В СООТВЕТСТВИИ С 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e) - СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В КАЧЕСТВЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ASCII

В соответствии с 37 C.F.R. § 1.821(c) или (e), файл, содержащий текстовую версию ASCII списка последовательностей, предоставлен совместно с настоящей заявкой.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии растений. Конкретные варианты осуществления относятся к новым полипептидам, вовлеченным в метаболизм N-(фосфонометил)глицина и к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие полипептиды. Конкретные варианты осуществления относятся к растениям, частям растений и клеткам растений, которые содержат указанные выше полипептиды и/или нуклеиновые кислоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Виды сорных растений давно являются проблемой на возделываемых полях. Хотя борьба с сорняками может быть трудоемкой работой, она упростилась благодаря доступности эффективных уничтожающих сорняки химических гербицидов. Повсеместное применение гербицидов, совместно с усовершенствованными сортами сельскохозяйственных растений и удобрениями для них, внесло значительный вклад в "зеленую революцию" в сельском хозяйстве. В частности, пригодными являются гербициды, которые обладают широким спектром гербицидной активности. К сожалению, гербициды широкого спектра, как правило, обладают вредоносным эффектом на сельскохозяйственные культуры, подвергнутые воздействию гербицида. Одним способом преодоления этой проблемы является получение сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербициду широкого спектра.

Одним примером гербицида широкого спектра является N-фосфонометилглицин, также известный как глифосат. Глифосат широко используется фермерами по всему миру для борьбы с сорняками перед посевом культуры, например, при нулевой обработке почвы. Кроме того, глифосат является эффективным средством для борьбы с сорняками и самосевными растениями между циклами производства или чередованием культур. Глифосат не переносится в почву после применения и он повсеместно считается одним из наиболее безопасных для окружающей среды и широкоэффективных химических гербицидов, доступных для применения в сельском хозяйстве.

Глифосат уничтожает растения путем ингибирования каскада шикимовой кислоты. Этот каскад приводит к биосинтезу ароматических соединений, включая аминокислоты, витамины и гормоны растений. Глифосат блокирует конденсацию фосфоенолпировиноградной кислоты (PEP) и 3-фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту путем связывания и ингибирования активности фермента 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, обычно обозначаемой как "EPSP-синтаза" и "EPSPS".

К сожалению, неизвестны сельскохозяйственные культуры, которые естественным образом устойчивы к глифосату, и, таким образом, применимость этого гербицида для борьбы с сорняками в сельскохозяйственных культурах ограничена. Одним из способов получения устойчивых к глифосату сельскохозяйственных культур является введение гена, кодирующего гетерологичную устойчивую к глифосату форму гена EPSPS, в культурное растение с использованием способов генной инженерии. С использованием химического мутагенеза были получены устойчивые к глифосату формы EPSPS в бактериях, и гетерологичные гены были введены в растения с получением устойчивых к глифосату растений. См., например, Comai et al. (1983) Science 221:370-71. Гетерологичные гены EPSPS можно сверхэкспрессировать в сельскохозяйственных культурах с получением желаемого уровня устойчивости.

Указанные выше примеры из уровня техники и ограничения, связанные с ними, являются иллюстративными, но не исключающими. Другие ограничения уровня техники станут понятными специалистам в данной области при прочтении описания.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны выделенные полипептиды, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1, и нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1 (например, SEQ ID NO: 2-4). Также описаны растения, части растений, органы растений, семена растений и клетки растений, содержащие гетерологичный полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1.

Некоторые варианты осуществления включают растение, часть растения, орган растения, семя растения и/или клетку растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1. В конкретных примерах гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Некоторые варианты осуществления включают растение, часть растения, орган растения, семя растения и/или клетку растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой, обладающей SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, в условиях высокой жесткости. В конкретных примерах растение, часть растения, орган растения, семя растения и/или клетка растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой, имеющей SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, в условиях высокой жесткости, содержит полипептид, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой, которая сообщает устойчивость к глифосату (или увеличивает устойчивость к глифосату) растению, части растения, органу растения, семени растения и/или клетке растения.

В следующих вариантах осуществления изобретение относится к способам получения растения, части растения, органа растения, семени растения и/или клетки растения, которые являются устойчивыми к глифосату, включающим: трансформацию растения, части растения, органа растения, семени растения и/или клетки растения нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1; и экспрессию нуклеиновой кислоты так, чтобы получить полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1.

Другие варианты осуществления включают векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1. Конкретные примеры включают векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обладающий по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 1. Например, вектор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

Конкретные варианты осуществления включают устойчивые к глифосату растения и клетки растений, экспрессирующие гетерологичный полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1.

Дополнительные варианты осуществления включают способы борьбы с сорняками на поле или возделываемой посевной площади с устойчивыми к глифосату растениями, где такой способ может включать: посев растения или семени растения, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный полипептид, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1, на поле или возделываемой посевной площади; и внесение на поле или возделываемую посевную площадь достаточного количества глифосата для борьбы с сорняками на поле без существенного повреждения растения.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способным к регенерации клеткам для применения в тканевой культуре растений, устойчивых к глифосату. Такая тканевая культура может быть способна регенерировать растения, обладающие физиологическими и морфологическими характеристиками указанных выше устойчивых к глифосату растений, а также регенерировать растения, имеющие по существу тот же генотип, что и у устойчивых к глифосату растений. Способные к регенерации клетки в таких тканевых культурах могут представлять собой, например, зародыши, протопласты, клетки меристемы, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, корневые кончики, цветки, семена, стручки и стебли. Конкретные варианты осуществления относятся к растениям, способным регенерировать из тканевой культуры в соответствии с вышеуказанным.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к клеткам, которые не регенерируют с образованием растений, например, для применения для получения линий клеток растений, устойчивых к глифосату. В других вариантах осуществления изобретение относится к растениям, частично содержащим такие клетки.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению множества гербицидов к сельскохозяйственным культурам, посеянным на возделываемой посевной площади. Поверхностное внесение глифосата в дополнение к нескольким гербицидам обладает преимуществом, состоящим в различных гербицидных свойствах, так что обеспечивается борьба с сорняками с усовершенствованной комбинацией универсальности и экономичности. Например, отдельные гербициды могут иметь различный срок действия на возделываемой посевной площади; т.е. некоторые гербициды могут оставаться и быть эффективными в течение относительно длительного периода времени после их внесения на площадь, в то время как другие гербициды могут быстро разлагаться на другие и/или неактивные соединения. Усовершенствованная система использования гербицидов в соответствии с конкретными вариантами осуществления позволяет использовать глифосат и несколько гербицидов так, чтобы растениевод мог адаптировать выбор конкретных гербицидов для применения в конкретной ситуации.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения и применения растения, которое является устойчивым более чем к одному гербициду или классу или подклассу гербицидов, как описано ниже. В конкретных вариантах осуществления предусматривается растение, которое является устойчивым как к глифосату, так и по меньшей мере к одному другому гербициду (или классу или подклассу гербицидов) или химическому реагенту (или классу или подклассу химических реагентов) (например, фунгициды, инсектициды, регуляторы роста растений и т.п.). Такие растения могут быть применимы, например, в способах, включающих обработку сельскохозяйственных культур несколькими гербицидами. Таким образом, изобретение относится к устойчивым к гербицидам растениям, которые выдерживают обработку гербицидом или комбинацией гербицидов (включая комбинацию гербицидов, каждый из которых действует посредством отличающегося механизма гербицидной активности) или которые выдерживают обработку комбинацией по меньшей мере одного гербицида и по меньшей мере одного другого химического реагента. Таким образом, в настоящем описании описаны усовершенствованные способы выращивания сельскохозяйственных культур, в которых осуществляется селективная борьба с сорняками.

Устойчивое к гербицидам растение в соответствии с некоторыми вариантами осуществления может включать молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует гетерологичный полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте (2,4-D). В соответствии с представленными выше абзацами, предусматриваются растения, которые содержат по меньшей мере третью молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В некоторых примерах устойчивое к гербицидам растение содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глюфосинату. Некоторые примеры включают устойчивое к гербицидам растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В конкретных примерах устойчивое к гербицидам растение содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к глифосату, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, который сообщает устойчивость к гербициду, который ингибирует ацетолактатсинтазу (ALS) (Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241), также известный как фермент синтаза ацетогидроксикислот (AHAS) фермент (Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). Некоторые примеры включают устойчивое к гербицидам растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, сообщающий растению признак, выбранный из группы, состоящей из признака устойчивости к гербицидам; признака устойчивости к насекомым; агрономического признака; признака устойчивости к заболеванию; признака модифицированной жирной кислоты; и признака сниженного содержания фитатов.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту можно комбинировать (или "пакетировать") в растении с любой молекулой нуклеиновой кислоты, например, но не ограничиваясь этим, для обеспечения дополнительной устойчивости к глифосату или другому гербициду, для обеспечения устойчивости к отдельным насекомым или заболеваниям, для обеспечения улучшения питания, для обеспечения улучшенных агрономических характеристик и для обеспечения белка или другого продукта, пригодного в кормах, продуктах питания, в промышленных способах применения, фармацевтических способах применения и/или в других применениях. Примеры включают пакетирование двух или более представляющих интерес нуклеиновых кислот в геноме растения. Такое "пакетирование генов" можно осуществлять посредством общепринятого разведения растений с использованием двух или более трансгенных объектов, трансформации растения конструкцией, которая содержит представляющие интерес последовательности, повторной трансформации трансгенного растения или добавления новых признаков посредством направленного встраивания способом гомологичной рекомбинации. Конкретные примеры такого набора включают любую из следующих комбинаций: нуклеиновая кислота dgt-28; нуклеиновая кислота Cry34Ab1; нуклеиновая кислота Cry35Ab1; нуклеиновая кислота Cry1F; нуклеиновая кислота Cry1Ac; нуклеиновая кислота aad-12; нуклеиновая кислота aad-1; нуклеиновая кислота pat; и нуклеиновая кислота DSM-2.

В дополнение к иллюстративным аспектам и вариантам осуществления, описанным выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления станут очевидными путем изучения представленного ниже описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 представлено частичное выравнивание последовательностей иллюстративных ферментов EPSP-синтаз (т.е., DGT-28, DGT-32, DGT-33 и других). Все три из этих иллюстративных ферментов DGT обладают общим консервативным аланином в положении аминокислоты 96 фермента EPSP-синтазы aroA. Положение этой аминокислоты указано звездочкой, и аминокислотный остаток подчеркнут.

Фиг. 2 включает выравнивание иллюстративных ферментов DGT (т.е. DGT-1, DGT-3 и DGT-7). Положение мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с глицина на аланин, указано первой звездочкой. Положение второго мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с треонина на изолейцин, указано второй звездочкой. Положение третьего мутантного аминокислотного остатка, который был изменен с пролина на серин, указано третьей звездочкой.

Фиг. 3-30 включают карты различных иллюстративных плазмид: pDAB107527 (Фиг. 3); pDAB105530 (Фиг. 4); pDAB105531 (Фиг. 5); pDAB105532 (Фиг. 6); pDAB105533 (Фиг. 7); pDAB105534 (Фиг. 8); pDAB4104 (Фиг. 9); pDAB102715 (Фиг. 10); pDAB107532 (Фиг. 11); pDAB107534 (Фиг. 12); pDAB102785 (Фиг. 13); pDAB100445 (Фиг. 14); pDAB102946 (Фиг. 15); pDAB100469 (Фиг. 16); pDAB102028 (Фиг. 17); pDAB102029 (Фиг. 18); pDAB102032 (Фиг. 19); pDAB102034 (Фиг. 20); pDAB100429 (Фиг. 21); pDAB100442 (Фиг. 22); pDAB100430 (Фиг. 23); pDAB102036 (Фиг. 24); pDAB102038 (Фиг. 25); pDAB102040 (Фиг. 26); pDAB102042 (Фиг. 27); pDAB107712 (Фиг. 28); pDAB107713 (Фиг. 29) и pDAB107714 (Фиг. 30).

Фиг. 31 включает величины IC₅₀, полученные после внесения различных мутаций в DGT-1 (A) и DGT-7 (B) с использованием 1 мМ PEP. Для кривых IC₅₀ как Фиг. 31(A), так и Фиг. 31(B), закрашенные треугольники соответствуют дикому типу, закрашенные круги соответствуют мутантам GA, незакрашенные квадраты соответствуют мутантам GAPS, и закрашенные квадраты соответствуют мутантам TIPS.

Фиг. 32-46 включают карты различных иллюстративных плазмид: pDAB102719 (Фиг. 32); pDAB102718 (Фиг. 33); pDAB107663 (Фиг. 34); pDAB107664 (Фиг. 35); pDAB107665 (Фиг. 36); pDAB107666 (Фиг. 37); pDAB109812 (Фиг. 38); pDAB101556 (Фиг. 39); pDAB107698 (Фиг. 40); pDAB108384 (Фиг. 41); pDAB108385 (Фиг. 42); pDAB108386 (Фиг. 43); pDAB108387 (Фиг. 44); pDAB102716 (Фиг. 45); pDAB102717 (Фиг. 46); pDAB110828 (Фиг. 47); pDAB110827 (Фиг. 48); pDAB107545 (Фиг. 49); pDAB107548 (Фиг. 50); pDAB107553 (Фиг. 51); pDAB102792 (Фиг. 52); pDAB107602 (Фиг. 53); и pDAB107533 (Фиг. 54).

СПОСОБ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор

В настоящем описании описаны новые полипептиды, вовлеченные в метаболизм N-(фосфонометил)глицина, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды. В некоторых примерах такой полипептид сообщает (или увеличивает) устойчивость к глифосату в клетке растения, где полипептид гетерологично экспрессируется, например, без неблагоприятного влияния на связывание EPSP-синтазы с ее природным субстратом фосфоенолпируватом (PEP).

II. Термины

Чтобы дополнительно пояснить объем настоящего изобретения, предоставлены следующее конкретные определения, термины и сокращения.

Если конкретно не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в данной области. Если не очевидно из контекста, в котором находится термин, термин в форме единственного числа включает множественное число, и подразумевают, что термины во множественном числе включают единственное число. Таким образом, элемент или компонент в форме единственного числа являются неограничивающими в отношении количества экземпляров (т.е. случаев) элемента или компонента. Когда в настоящем описании предусматриваются диапазоны числовых величин (например, "менее чем приблизительно X", "менее чем X" и "например, X₁… и X₂"), подразумевают, что диапазоны включают все величины и диапазоны величин, включенные в предоставленный диапазон, как если бы эти включенные величины и диапазоны были явно перечислены.

Как используют в рамках изобретения, термины "содержащий", "включающий," "имеющий" и "содержащий" и их варианты являются открытыми (т.е. неисключающими). Например, композиция или способ, которые включают перечень элементов, необязательно ограничиваются только этими элементами. Такая композиция или способ могут включать (или могут не включать) другие элементы, явно не указанные или не присущие композиции или способу. Кроме того, если явно не указано иное, "или" используют во включающем (а не исключающем) значении. Например, условие "A или B" удовлетворяется любым из следующих: A является истинным (или присутствует) и B является ложным (или отсутствует); A является ложным (или отсутствует) и B является истинным (или присутствует); и как A, так и B, являются истинными (или присутствуют).

Растение: как используют в рамках изобретения, термин "растение" включает целое растение и любого потомка, клетку, ткань или часть растения. Термин "части растений" включает любую часть(и) растения, включая, например, но не ограничиваясь этим: семена (включая зрелое семя и незрелое семя); черенок растения; клетку растения; культуру клеток растения; орган растения (например, пыльцу, эмбрионы, цветки, плоды, побеги, листья, корни, стебли и эксплантаты). Ткань растения или орган растения могут представлять собой семя, протопласт, каллюс или любую другую группу клеток растений, которые организованы в структурный или функциональный элемент. Клетка растения или культура тканей могут быть способны регенерировать растение, имеющее физиологические и морфологические характеристики растения, из которого были получены клетка или ткань, и регенерировать растение, имеющее по существу тот же генотип, что и у растения. В противоположность этому, некоторые клетки растений не способны регенерировать с образованием растений. Регенерируемые клетки в клетке растения или тканевой культуры могут представлять собой эмбрионы, протопласты, клетки меристемы, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, корневые кончики, столбики початка, цветки, зерна, колосья, початки, пленку зерна или цветоножки.

Части растений включают пожинаемые части и части, пригодные для размножения растений-потомков. Части растений, пригодные для размножения, включают, например, но не ограничиваясь ими: семя; плод; черенок; проросток; клубень и корневище. Пожинаемая часть растения может представлять собой любую часть растения, включая, например, но не ограничиваясь ими: цветок; пыльцу; проросток; клубень; лист; стебель; плод; семя и корень.

Клетка растения представляет собой структурный и физиологический элемент растения, содержащий протопласт и клеточную стенку. Клетка растения может быть в форме выделенной отдельной клетки или совокупности клеток (например, рыхлый каллюс и культивируемая клетка), и она может быть частью более высоко организованного элемента (например, ткань растения, орган растения и растение). Таким образом, клетка растения может представлять собой протопласт, продуцирующую гаметы клетку, или клетку или группу клеток, которые регенерируют в целое растение. По существу, в вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, семя, которое содержит множество клеток растений и способно регенерировать в целое растение, считают "клеткой растения".

Резистентность/устойчивость к гербицидам: при указании на растения, которые являются резистентными или устойчивыми к глифосату, подразумевают, что применение некоторого количества глифосата к растению не оказывает значительного влияния или не уничтожает растение, где растение дикого типа того же вида значительно повреждалось и/или погибало бы при использовании этого количества глифосата. Растение может быть естественным образом устойчивым к конкретному гербициду или растению можно сообщать устойчивость к гербициду с помощью способов генной инженерии, например, таких как селекция; генетическая трансформация и/или внесение трансгена в геном растения. "Устойчивое к глифосату растение" относится к растению, содержащему полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, которые сообщают устойчивость к гербициду, когда их предоставляют гетерологичному растению или другому организму, экспрессирующему их (т.е. делают растение или другой организм устойчивыми к гербициду).

Растение, которое является резистентным или устойчивым к глифосату, может демонстрировать некоторый минимальный эффект от применения глифосата к растению. Например, может происходить изменение нормального роста и развития растения, где растение может проявлять признаки или симптомы, которые ассоциированы со стрессом или заболеванием. Такой минимальный эффект вследствие применения глифосата к растениям, которые являются резистентными или толерантными к глифосату, отличается от неблагоприятного эффекта, который является результатом применения глифосата к растениям, которые чувствительны к глифосату. Специалист в данной области может различить растения, которые являются устойчивыми к глифосату, и растения, которые являются чувствительными к глифосату. Применение глифосата к растениям, содержащим нуклеиновую кислоту, которая сообщает устойчивость к глифосату, приводит к значительно меньшему эффекту, чем применение того же количества глифосата к растению того же вида, которое не содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая сообщает устойчивость к глифосату.

Растение, которое является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, демонстрирует увеличенную устойчивость по сравнению с соответствующим контрольным растением. Повреждение вследствие гербицида или другой химической обработки можно оценивать посредством оценки любого параметра роста или благополучия растения. Такие параметры известны специалистам в данной области и их выбор осуществляется, исходя из мнения квалифицированного специалиста. Повреждение растения можно оценивать путем визуального исследования и/или посредством статистического анализа одного или нескольких подходящего параметра(ов) роста или благополучия растения в индивидуальном растении или группе(ах) растений. Таким образом, повреждение можно оценивать путем оценки параметров, включающих, например и не ограничивающихся ими: высоту растения; массу растения; цвет листьев; длину листьев; цветение; способность к размножению; выметывание пестичных столбиков; выход и продукцию семян. Повреждение также можно оценивать путем оценки времени, прошедшего до конкретной стадии развития (например, выметывание пестичных столбиков, цветение и сбрасывание пыльцы), или времени, пошедшего до тех пор, пока растение не восстановится после обработки конкретным химическим реагентом и/или гербицидом.

При проведении оценки повреждений, конкретным степеням повреждения можно приписывать величины так, чтобы можно было проводить статистический анализ или количественные сравнения. Использование диапазонов величин для описания конкретных степеней повреждения известно в данной области, и можно использовать любой походящий диапазон или шкалу. Например, можно присваивать показатели повреждения гербицидом (также называемые показателями устойчивости). Таким образом, на устойчивость к гербициду могут указывать другие оценки на этой школе, где соответствующее контрольное растение (или группа контрольных растений) проявляет статистически более низкий показатель по шкале в ответ на обработку гербицидом, чем группа рассматриваемых растений.

Повреждение, вызываемое гербицидом или другим химическим реагентом, можно оценивать в различные моменты времени после обработки растения гербицидом. Часто, повреждение оценивают приблизительно в момент времени, когда контрольное растение проявляет максимальное повреждение. Иногда повреждение оценивают после периода времени, на протяжении которого контрольное растение, которое не было обработано гербицидом или другим химическим реагентом, выросло и/или развилось на поддающемся измерению уровне по сравнению с размером или стадией, при которых проводили обработку. Повреждение можно оценивать в любой из множества подходящих периодов времени, например, через 12 часов; через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и/или 14 суток; через 3 и/или 4 недели или более, после того, как рассматриваемое растение обработали гербицидом. Является пригодным любой момент времени оценки при условии, что он позволяет обнаружение различий в ответ на обработку исследуемого и контрольного растений.

Гербицид не вызывает "значительного повреждения" растения, либо когда он не имеет эффекта на растение, либо когда он имеет некоторый эффект на растение, после которого растение впоследствии восстанавливается, либо когда он имеет эффект на растение, который является вредоносным, но который уравновешивается, например, воздействием конкретного гербицида на сорняки. Таким образом, например, сельскохозяйственная культура может "не повреждаться значительно" гербицидом или другой обработкой, если растение проявляет менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 9%, менее чем приблизительно 8%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 6%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2% или менее чем приблизительно 1% снижение по меньшей мере одного подходящего параметра, который указывает на здоровье и/или продуктивность растения, по сравнению с соответствующим контрольным растением (например, необработанное растение того же вида). В конкретных вариантах осуществления растение является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, если оно демонстрирует повреждение по сравнению с соответствующим контрольным растением, которое является меньшим, чем повреждение, которое проявляет контрольное растение, по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, или 1000% или более. Сельскохозяйственная культура, на которую гербицид или другая обработка не оказывает значительного влияния, может проявлять снижение по меньшей мере одного параметра, однако это снижение является временным, и растение полностью восстанавливается в пределах, например, приблизительно 1 недели, приблизительно 2 недель, приблизительно 3 недель, приблизительно 4 недель или приблизительно 6 недель. В конкретных вариантах осуществления растение, которое является устойчивым к гербициду или другому химическому реагенту, может быть характеризовано тем, что применение гербицида или другого химического реагента не оказывает существенного влияние на растение.

Подходящие параметры, которые указывают на здоровье и/или продуктивность растения, включают, например, но не ограничиваясь ими: высоту растения; вес растения; длину листа; время, прошедшее до конкретной стадии развития; цветение; выход и продукцию семян. Оценку параметра можно проводить путем визуального исследования и/или посредством статистического анализа параметра. После оценки в рассматриваемом растении и контрольном растении, можно проводить сравнение так, чтобы определить, повреждается или не повреждается ли рассматриваемое растение гербицидом или другой обработкой.

Соответствующие контрольные растения, которые можно использовать для определения устойчивости к гербициду (или другому химическому реагенту), включают растения того же вида, которые не содержат предполагаемую гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или полипептид, сообщающие устойчивость к гербициду, и растения, которые содержат предполагаемую гетерологичную нуклеиновую кислоту и/или полипептид, сообщающие устойчивость к гербициду, но которые не обработаны гербицидом.

Гербицид: "гербицид" представляет собой химическое вещество, которое вызывает временное или постоянное повреждение растения. Неограничивающие примеры гербицидов приведены и более подробно рассмотрены в настоящем описании. Гербицид может включаться в растение или в его клетки, или он может действовать на растение или его клетки без включения. "Активный ингредиент" представляет собой химическое вещество в гербицидном составе, которое ответственно за фитотоксичность состава. Активные ингредиенты в коммерческих гербицидных составах, как правило, обозначают как активный ингредиент на товарной этикетке. Информация товарных этикеток доступна от U.S. Environmental Protection Agency, и она обновляется в сети Интернет на oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own. Информация товарных этикеток также доступна в сети Интернет на www.cdms.net.

При использовании в отношении гербицида, термин "эквивалент кислоты" относится к уровню или количеству относительно гербицидно активной исходной кислоты.

Выделенный: "выделенный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или полипептид) по существу отделен, продуцирован отдельно или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент встречается в природе (т.е. других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК, и белков), при осуществлении химического или функционального изменения компонента (например, нуклеиновая кислота может быть выделена из хромосомы путем разрушения химических связей, соединяющих нуклеиновую кислоту с остальной ДНК в хромосоме). Молекулы нуклеиновых кислот и белки, которые являются "выделенными", включают молекулы нуклеиновых кислот и белки, очищенные стандартными способами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот, белки и пептиды.

Нуклеиновая кислота: термины "полинуклеотид", "нуклеиновая кислота" и "молекула нуклеиновой кислоты" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они охватывают одну нуклеиновую кислоту; несколько нуклеиновых кислот; фрагмент, вариант или производное нуклеиновой кислоты; и конструкцию нуклеиновой кислоты (например, матричная РНК (мРНК) и плазмидная ДНК (пДНК)). Полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут содержать нуклеотидную последовательность полноразмерной последовательности кДНК или ее фрагмент, включая нетранслируемые 5′- и/или 3′-последовательности и кодирующую последовательность(и). Полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, которые могут включать немодифицированные рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды или модифицированные рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Например, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут состоять из одноцепочечной и двухцепочечной ДНК; ДНК, которая представляет собой смесь одноцепочечной и двухцепочечной областей; одноцепочечной и двухцепочечной РНК; и РНК, которая представляет собой смесь одноцепочечной и двухцепочечной областей. Гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, или они могут представлять собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных областей. Указанные выше термины также включают химически, ферментативно и метаболически модифицированные формы полинуклеотида или нуклеиновой кислоты.

Понятно, что конкретная ДНК также относится к комплементарной ей ДНК, последовательность которую определяют в соответствии с правилами спаривания дезоксирибонуклеотидных оснований.

Как используют в рамках изобретения, термин "ген" относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует функциональный продукт (РНК или полипептид/белок). Ген может включать регуляторные последовательности, предшествующие (5′-некодирующие последовательности) и/или следующие после (3′-некодирующие последовательности) последовательности, кодирующей функциональный продукт.

Как используют в рамках изобретения, термин "кодирующая последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность. "Регуляторная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, расположенной выше (например, 5′-некодирующие последовательности), внутри или ниже (например, 3′-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, которая влияет на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК, или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают, например, но не ограничиваются ими: промоторы; лидерные последовательности трансляции; интроны; распознаваемые участки для полиаденилирования; участки процессинга РНК; связывающее эффектор участки и структуры стебель-петля.

Как используют в рамках изобретения, термин "вырожденность кодонов" относится к избыточности генетического кода, которая обеспечивает варьирование конкретной нуклеотидной последовательности без влияния на аминокислотную последовательность кодируемого полипептида. Поскольку каждый кодон состоит из трех нуклеотидов, и нуклеотиды, составляющие ДНК, ограничены четырьмя конкретными основаниями, существует 64 возможных комбинации нуклеотидов, 61 из которых кодируют аминокислоты (остальные три кодона кодируют сигналы, завершающие трансляцию). В результате многие аминокислоты обозначаются более чем одним кодоном. Например, аминокислоты аланин и пролин кодируются четырьмя триплетами, серин и аргинин - шестью, в то время как триптофан и метионин кодируются только одним триплетом. "Генетический код", который демонстрирует, какие кодоны кодируют какие аминокислоты, общеизвестен в данной области. Его вырожденность позволяет основаниям ДНК варьировать в широком диапазоне без изменен