Композиции для ингибирования masp-2-зависимой активации комплемента
Иллюстрации
Показать всеНастоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено выделенное человеческое моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с MASP-2 человека. Кроме того, рассмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела и антигенсвязывающего фрагмента; экспрессионная кассета; клетка и способ продуцирования выделенного анти-MASP-2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Также описана композиция для лечения состояния, ассоциированного с MASP-2-зависимой активацией комплемента; применение анти-MASP-2-антитела для получения лекарственного средства и промышленное изделие для лечения состояния, ассоциированного с MASP-2-зависимой активацией комплемента. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии комплемент-опосредованных заболеваний. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 24 ил., 30 табл., 12 пр.
Реферат
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к ингибирующим антителам против MASP-2 и к композициям, содержащим такие антитела и используемым в целях ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/482567, поданной 4 мая 2011 года, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Указание относительно списка последовательностей
Список последовательностей, прилагаемый к настоящей заявке, представлен не в бумажной копии, а в виде текстового файла, а поэтому он вводится в настоящее описание посредством ссылки. Текстовый файл, содержащий список последовательностей, представлен под именем «MP_1_0115_PCT_SequenceListingasFiled_20120504_ST25». Этот текстовой файл, имеющий размер 158 кб, был создан 4 мая 2012 года и подан через EFS-Web вместе с подачей настоящей заявки.
Предшествующий уровень техники
Система комплемента действует на ранней стадии как механизм инициации, амплификации и распределения иммунного ответа на микробную инфекцию и на другие острые инфекции (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York) у человека и других позвоночных. Хотя активация комплемента обеспечивает эффективную защиту первого ряда от потенциальных патогенов, однако активация комплемента, которая стимулирует вырабатывание протективного иммунного ответа, может также представлять потенциальную угрозу для хозяина (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). Так, например, продукты протеолиза C3 и C5 стимулируют рекрутинг и активацию нейтрофилов. Хотя нейтрофилы необходимы для защиты хозяина, однако активированные нейтрофилы не могут быть идентифицированы по высвобождению ими деструктивных ферментов и могут вызывать поражение органов. Кроме того, активация комплемента может вызывать отложение литических компонентов комплемента на участках, расположенных поблизости от клеток-хозяев, а также на микробных мишенях, что приводит к лизису клеток-хозяев.
Система комплемента также участвует в патогенезе различных острых и хронических патологических состояний, включая инфаркт миокарда, инсульт, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), реперфузионное поражение, септический шок, проницаемость капилляров после тепловых ожогов, воспаление после операции по кардиопульмонарному шунтированию, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, тяжелая миастения и болезнь Альцгеймера. Почти при всех этих состояниях сам комплемент не вызывает эти состояния, но является одним из нескольких факторов, участвующих в патогенезе. Тем не менее, активация комплемента может представлять собой основной патологический механизм и служить эффективной точкой клинического контроля при многих из указанных патологических состояниях.
Все возрастающее признание важного значения в понимании механизмов комплемент-опосредованного поражения тканей при различных патологических состояниях еще раз указывает на необходимость разработки эффективных комплемент-ингибирующих лекарственных средств. В настоящее время экулизумаб (Soliris®), то есть антитело против C5, является единственным лекарственным средством, мишенью которого является комплемент, и которое было разрешено для применения в медицине. Кроме того, C5 является одним из нескольких эффекторных молекул, действующих на поздних этапах реакции системы комплемента, и блокада C5 не приводит к ингибированию активации системы комплемента. Поэтому ингибитор стадий инициации активации комплемента имел бы существенное преимущество по сравнению с ингибитором одного компонента, действующего на поздних этапах в каскаде реакций системы комплемента.
В настоящее время хорошо известно, что система комплемента может активироваться тремя различными путями: по классическому пути, по лектиновому пути и по альтернативному пути. Классический путь обычно запускается комплексом, состоящим из антител хозяина, связанных с чужеродной частицей (то есть с антигеном), и для вырабатывания специфического гуморального ответа требуется предварительная стимуляция антигеном. Поскольку активация классического пути зависит от предварительного адаптивного иммунного ответа у хозяина, то такой классический путь является частью приобретенной иммунной системы. В противоположность этому, лектиновый и альтернативный пути не зависят от адаптивного иммунного ответа и являются частью природной иммунной системы.
Активация системы комплемента приводит к последующей активации серин-протеазных зимогенов. Первой стадией активации классического пути является связывание молекулы специфического распознавания, C1q, с антиген-связанными комплексами IgG и IgM. C1q ассоциируется с серин-протеазными проферментами C1r и C1s в виде комплекса, обозначаемого C1. После связывания C1q с иммунными комплексами, аутопротеолитическое расщепление Arg-Ile-сайта C1r сопровождается C1r-опосредуемым расщеплением и активацией C1s, что сообщает ему способность расщеплять C4 и C2. C4 расщепляется на два фрагмента, обозначаемых C4a и C4b, и аналогогичным образом, C2 расщепляется на компоненты C2a и C2b. Фрагменты C4b могут образовывать ковалентные связи с расположенными рядом гидроксильными группами или аминогруппами и продуцировать C3-конвертазу (C4b2a) посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C2a активированного C2. C3-конвертаза (C4b2a) активирует C3 путем протеолитического расщепления на субкомпоненты C3a и C3b, что приводит к продуцированию C5-конвертазы (C4b2a3b), которая, посредством расщепления C5, способствует образованию комплекса, атакующего мембрану (C5b вместе с C6, C7, C8 и C9 также обозначаются «MAC»), и этот комплекс может разрушать клеточные мембраны и вызывать клеточный лизис. Активированные формы C3 и C4 (C3b и C4b) ковалентно осаждаются на поверхностях чужеродных мишеней, которые распознаются рецепторами комплемента на множестве фагоцитов.
Независимо от этого, первой стадией активации системы комплемента по лектиновому пути также является связывание молекул специфического распознавания, после которой происходит активация связанных серин-протеазных проферментов. Однако, в отличие от C1q, связывающегося с иммунным комплексом, молекулы распознавания в лектиновом пути составляют группу углевод-связывающих белков (маннан-связывающий лектин (MBL), H-фиколин, M-фиколин, L-фиколин и лектин C-типа CL-11), имеющие общее название «лектины». См. J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). См. также J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al., Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen S. et al., J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).
Ikeda с сотрудниками было впервые продемонстрировано, что MBL, подобно C1q, может активировать систему комплемента после связывания с эритроцитами, покрытыми дрожжевым маннаном, по C4-зависимому механизму (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987). MBL, член семейства белков коллектинов, представляет собой кальций-зависимый лектин, который связывается с углеводами по 3- и 4-гидроксигруппам, ориентированным в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Таким образом, наиболее часто встречающимися лигандами для MBL являются D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, а углеводы, не удовлетворяющие стерическим требованиям, имеют недетектируемую аффинность по отношению к MBL (Weis, W.I., et al., Nature 360:127-134, 1992). Взаимодействие между MBL и одновалентными сахарами является очень слабым, а их константы диссоциации обычно находятся в одноразрядном миллимолярном интервале. MBL достигает тесного специфического связывания с гликановыми лигандами посредством авидности, то есть посредством одновременного взаимодействия с множеством моносахаридных остатков, расположенных в непосредственно близости друг от друга (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299: 129-136, 1992). MBL распознает углеводные паттерны, которые обычно окаймляют микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. В отличие от этого, MBL не распознает D-галактозу и сиаловую кислоту, предпоследние и последние сахара, которые обычно окаймляют «зрелый» комплекс гликоконъюгатов, присутствующих на гликопротеинах плазмы и клеточной поверхности у млекопитающих. Считается, что такая специфичность связывания стимулирует распознавание «чужеродных» поверхностей и способствует защите от «аутоактивации». Однако MBL не связывается с высокой аффинностью с кластерами гликанов-«предшественников» с высоким содержанием маннозы на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, секвестрированных в эндоплазматической ретикулуме и в аппарате Гольджи клеток млекопитающих (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). Поэтому поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для активации по лектиновому пути посредством связывания с MBL.
Фиколины имеют лектиновый домен, отличающийся от лектинового домена MBL и называемый фибриноген-подобным доменом. Фиколины связываются с сахарными остатками по Ca++-независимому механизму. У человека были идентифицированы фиколины трех видов (L-фиколин, M-фиколин и H-фиколин). Два сывороточных фиколина, L-фиколин и H-фиколин, имеют общую специфичность к N-ацетил-D-глюкозамину, однако H-фиколин также связывается и с N-ацетил-D-галактозамином. Различия в специфичности L-фиколина, H-фиколина, CL-11 и MBL к сахарам означают, что различные лектины могут быть комплементарны различным гликоконъюгатам и нацелены на различные, хотя и перекрывающиеся, гликоконъюгаты. Эта концепция подтверждается последними сообщениями в литературе, указывающими на то, что из всех известных лектинов, участвующих в лектиновом пути, только L-фиколин специфически связывается с липотейхоевой кислотой, то есть гликоконъюгатом клеточной стенки, присутствующим на всех грамположительных бактериях. (Lynch, N.J., et al., J. Immunol. 172: 1198-1202, 2004). Коллектины (то есть MBL) и фиколины не обнаруживают какого-либо значимого сходства по своим аминокислотным последовательностям. Однако эти две группы белков имеют одинаковую организацию доменов и, подобно C1q, участвуют в сборке олигомерных структур, что максимизирует вероятность их связывания во многих сайтах.
Концентрации MBL в сыворотке у здоровых индивидуумов в высокой степени варьируются и генетически регулируются полиморфизмом/мутациями в промоторных и в кодирующих областях гена MBL. Уровень экспрессии MBL как белка острой фазы еще более повышается в процессе воспаления. L-фиколин присутствует в сыворотке в концентрациях, аналогичных концентрациям MBL. Поэтому L-фиколиновая ветвь лектинового пути по своей структуре является, возможно, сравнимой с MBL-ветвью. MBL и фиколины могут также действовать как опсонины, что позволяет фагоцитам нацеливаться на MBL- и фиколин-окаймляющие поверхности (см. Jack et al., J. Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004); Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002); Aoyagi et al., J. Immunol. 174(1):418-25 (2005)). Такая опсонизация требует взаимодействия этих белков с рецепторами фагоцитов (Kuhlman, M, et al., J. Exp. Med. 169:1733, 1989; Matsushita, M., et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, 1996), идентичность которых пока еще не установлена.
Человеческий MBL стимулирует специфическое и высокоаффинное взаимодействие посредством его коллаген-подобного домена с уникальными C1r/C1s-подобными сериновыми протеазами, называемыми MBL-ассоциированными сериновыми протеазами (MASP). В настоящее время описано три MASP. Сначала был идентифицирован один фермент «MASP», и этот фермент был охарактеризован как фермент, ответственный за инициацию каскада реакций комплемента (то есть реакций расщепления C2 и C4) (Matsushita M & Fujita T., J. Exp Med 176(6):1497-1502 (1992), Ji, Y.H., et al., J. Immunol. 150:571-578, 1993). Затем было определено, что MASP-активность фактически представляет собой смесь двух протеаз: MASP-1 и MASP-2 (Thiel, S., et al., Nature 386:506-510, 1997). Однако было продемонстрировано, что для активации комплемента достаточно и одного комплекса MBL-MASP-2 (Vorup-Jensen, T., et al., J. Immunol. 165:2093-2100, 2000). Кроме того, только MASP-2 в высокой степени расщепляет C2 и C4 (Ambrus, G., et al., J. Immunol. 170: 1374-1382, 2003). Следовательно, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию C4 и C2 и генерирование C3-конвертазы, C4b2a. Этот механизм значительно отличается от механизма комплекса C1 классического пути, где координированное действие двух специфических сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Кроме того, была выделена третья новая протеаза, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15: 127-35, 2001). MASP-1 и MASP-3 представляют собой продукты альтернативного сплайсинга одного и того же гена.
MASP имеют организацию доменов, идентичную организациям доменов C1r C1s, то есть ферментных компонентом комплекса C1 (Sim, R.B., et al., Biochem. Soc. Trans. 25:545, 2000). Эти домены включают N-концевой домен C1r/C1s/домен VEGF морского ежа/домен белка морфогенеза кости (CUB); домен, подобный эпидермальному фактору роста; второй домен CUB; тандем доменов белка регуляции комплемента и домен сериновой протеазы. Как и в протеазах C1, активация MASP-2 осуществляется посредством расщепления Arg-Ile-связи, непосредственно у домена сериновой протеазы, что приводит к расщеплению фермента на цепи А и В, связанные дисульфидными связями, где указанные цепи состоят из доменов сериновой протеазы. Недавно был описан генетически детерминированный дефицит MASP-2 (Stengaard-Pedersen, K., et al., New Eng. J. Med. 349:554-560, 2003). Мутация одного нуклеотида приводит к замене Asp-Gly в домене CUB1 и сообщает MASP-2 неспособность связываться с MBL.
MBL может также ассоциироваться с альтернативно сплайсированной формой MASP-2, известной как MBL-ассоциированный белок размером 19 кДа (MAp19) (Stover, CM., J. Immunol. 162:3481-90, 1999) или небольшой MBL-ассоциированный белок (sMAP) (Takahashi, M., et al., Int. Immunol. 11:859-863, 1999), который не обладает каталитической активностью MASP-2. MAp19 содержит первые два домена MASP-2, за которыми следует дополнительная последовательность из четырех уникальных аминокислот. Гены MASP 1 и MASP 2 расположены на человеческих хромосомах 3 и 1, соответственно (Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466, 2002).
Существует ряд данных, позволяющих предположить, что различные комплексы MBL-MASP и большая фракция MASP в сыворотке не образуют комплексы с MBL (Thiel, S., et al., J. Immunol. 165:878-887, 2000). H- и L-фиколин связываются со всеми MASP и, как и MBL, активируют лектиновый путь комплемента (Dahl, M.R., et al., Immunity 15: 127-35, 2001; Matsushita, M., et al., J. Immunol. 165:3502-3506, 2002). Лектиновый и классические пути образуют общую C3-конвертазу (C4b2a), и на этой стадии эти два пути сходятся.
Существует широко распространенное мнение, что лектиновый путь играет важную роль в защите неинфицированного хозяина от инфекции. Убедительные доказательства участия MBL в защите хозяина были получены в анализах, проводимых у пациентов со сниженными уровнями функционального MBL в сыворотке (Kilpatrick, D.C., Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, 2002). У этих пациентов наблюдается восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Такие симптомы обычно появляются в раннем возрасте, в четком временном «окне» восприимчивости к инфекциям по мере убывания титров материнских антител, но еще до развития гуморального ответа с образованием полного репертуара антител. Этот синдром часто является следствием мутаций в нескольких сайтах коллагенозной части MBL, которые препятствуют соответствующему образованию олигомеров MBL. Однако, поскольку MBL может функционировать как опсонин независимо от комплемента, то неизвестно, в какой степени повышение чувствительности к инфекции обусловлено снижением активации комплемента.
В отличие от классических и лектиновых путей, не было обнаружено каких-либо инициаторов альтернативного пути, которые обеспечивали бы функции распознавания, присущие C1q и лектинам в двух других путях. В настоящее время хорошо известно, что альтернативный путь спонтанно подвергается циклической активации на низком уровне, которая может легко усиливаться на чужеродных или других аномальных поверхностях (бактерий, дрожжей, инфицированных вирусом клеток или поврежденной ткани), не имеющих собственных молекулярных элементов, которые поддерживают уже имеющуюся спонтанную активацию комплемента. Существует четыре белка плазмы, непосредственно участвующих в активации альтернативного пути, а именно, C3, факторы B и D, и пропердин. Несмотря на наличие множества данных, указывающих на участие классических и альтернативных путей комплемента в патогенезе неинфекционных заболеваний у человека, роль лектинового пути в таком патогенезе еще только начали исследовать. Последние исследования показали, что активация лектинового пути может быть ответственна за активацию комплемента и ассоциированное с нейтрализует воспаление при ишемии/реперфузионном повреждении. Collard и сотрудники (2000) сообщали, что культивированные эндотелиальные клетки, подвергаемые окислительному стрессу, связываются с MBL и обнаруживают осаждение C3 после воздействия на них человеческой сыворотки (Collard, CD., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, 2000). Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими моноклональными анти-MBL антителами приводит к ингибированию связывания с MBL и активации комплемента. Эти данные распространяются на крысиную модель ишемии миокарда-реперфузии, при которой у крыс, обработанных блокирующим антителом против крысиного MBL, наблюдалось более явное снижение повреждения миокарда после закупорки коронарной артерии, чем у крыс, обработанных контрольным антителом (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-1418, 2001). Молекулярный механизм связывания MBL с васкулярным эндотелием после окислительного стресса остается пока неясным, однако последние исследования позволяют предположить, что активация лектинового пути после окислительного стресса может быть опосредована связыванием MBL с васкулярными эндотелиальными цитокератинами, а не с гликоконъюгатами (Collard, CD., et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, 2001). Другие исследования указывали на роль классических и альтернативных путей в патогенезе ишемии/реперфузионном повреждении, а роль лектиновго пути в патогенезе такого заболевания, пока остается предметом дискуссии (Riedermann, N.C, et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).
Последние исследования показали, что MASP-1 (и, возможно, также MASP-3) необходим для превращения фактора D, то есть фермента активации альтернативного пути, из его зимогенной формы в ферментативно активную форму (см. Takahashi M. et al., J. Exp. Med. 207(1):29-37 (2010)). На физиологическую важность такого процесса указывает отсутствие функциональной активности альтернативного пути в плазме MASP-1/3-дефицитных мышей. Для функционирования альтернативного пути необходимо протеолитическое продуцирование C3b из нативного C3. Поскольку C3-конвертаза альтернативного пути (C3bBb) содержит C3b как основную субъединицу, то вопрос о рассмотрении происхождения первого C3b в альтернативном пути представляет серьезную проблему и дает стимул к проведению фундаментальных исследований.
C3 принадлежит к семейству белков (наряду с C4 и с макроглобулином α-2), которые содержат редкую посттрансляционную модификацию, известную как тиоэфирная связь. Тиоэфирная группа состоит из глутамина, у которого концевая карбонильная группа образует ковалентную тиоэфирную связь с сульфгидрильной группой цистеина без трех аминокислот. Эта связь является нестабильной, и электрофильный глутамил-тиоэфир может взаимодействовать с нуклеофильными группами, такими как гидроксильные группы или аминогруппы, и тем самым образовывать ковалентную связь с другими молекулами. Тиоэфирная связь является достаточно стабильной, если она секвестрирована в гидрофобном «кармане» интактного C3. Однако протеолитическое расщепление C3 на C3a и C3b приводит к «обнажению» в высокой степени реакционноспособной тиоэфирной связи на C3b, и, после нуклеофильной атаки смежными молекулами, содержащими гидроксильные группы или аминогруппы, C3b становится ковалентно связанной с мишенью. Считается, что помимо хорошо подтвержденной роли C3-тиоэфира в ковалентном связывании C3b с мишенями комплемента, C3-тиоэфир также играет главную роль в запуске альтернативного пути. В соответствии с широко распространенной «теории холостого хода», альтернативный путь инициируется продуцированием конвертазы в жидкой фазе, iC3Bb, которая образуется из C3 под действием гидролизованного тиоэфира (iC3; C3(H2O)) и фактора B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, 1984). C3b-подобный C3(H2O) продуцируется из нативного C3 посредством медленного спонтанного гидролиза внутреннего тиоэфира, присутствующего в белке (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). Благодаря активности C3(H2O)Bb-конвертазы, молекулы C3b осаждаются на поверхности мишени, и тем самым инициируют альтернативный путь.
Об инициаторах активации альтернативного пути известно очень мало. Считается, что активаторами могут быть стенки дрожжевых клеток (зимосан), многие чистые полисахариды, кроличьи эритроциты, некоторые иммуноглобулины, вирусы, грибы, бактерии, опухолевые клетки животных, паразиты и поврежденные клетки. Единственным общим признаком этих активаторов является присутствие углевода, однако, из-за сложности и разнообразия углеводных структур, трудно определить общие молекулярные детерминанты для распознавания. Широко распространено мнение, что активация альтернативного пути регулируется посредством тонкого баланса между ингибирующими регуляторными компонентами этого пути, такими как фактор Н, фактор I, DAF, CR1 и пропердин, который является единственным позитивным регулятором альтернативного пути. См. Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).
Помимо явно нерегулируемого механизма активации, описанного выше, альтернативный путь может также давать петлю усиленной амплификации для C3-конвертазы (C4b2a) лектинового/классического пути, поскольку любой продуцируемый C3b может участвовать, вместе с фактором В, в образовании дополнительной C3-конвертазы (C3bBb) альтернативного пути. C3-конвертаза альтернативного пути стабилизируется посредством связывания пропердина. Пропердин способствует 6-10-кратному увеличению времени полужизни C3-конвертазы альтернативного пути. Добавление C3b к C3-конвертазе альтернативного пути способствует образованию C5-конвертазы альтернативного пути.
Считается, что все три пути (то есть классический, лектиновый и альтернативный) сходятся в C5, который, при его расщеплении, образует продукты, обладающие множеством провоспалительных эффектов. Путь, в котором сходятся все три пути, был определен как концевой путь комплемента. C5a представляет собой исключительно сильный анафилотоксин, индуцирующий изменение тонуса гладких мышц и сосудов, а также сосудистой проницаемости. Он также является сильным хемотаксином и активатором нейтрофилов и моноцитов. C5a-опосредуемая клеточная активация может значительно усиливать воспалительные ответы посредством индуцирования высвобождения множества дополнительных медиаторов воспаления, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и молекулы активного кислорода. Расщепление C5 приводит к образованию C5b-9, также известного как мембраноатакующий комплекс (MAC). В настоящее время существуют убедительные доказательства того, что осаждение сублитического MAC, помимо его роли как литического порообразующего комплекса, может играть важную роль в воспалительном процессе.
Система комплемента, помимо ее важной роли в иммунной защите, также вносит свой вклад в поражение ткани, наблюдаемое при многих клинических состояниях. Поэтому крайне необходимо разработать терапевтически эффективные ингибиторы комплемента, которые могли бы предупреждать указанные побочные эффекты.
Сущность изобретения
Сущность изобретения заключается в выборе концепций в упрощенной форме, описанных ниже в разделе «Подробное описание изобретения». Такая сущность изобретения не рассматривается ни как способ идентификации ключевых признаков заявленного предмета изобретения, ни как средство, используемое для облегчения определения объема заявленного предмета изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с человеческим MASP-2, и включают: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3; и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где последовательность CDR-H3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:38 или SEQ ID NO:90, и консервативные модификации в их последовательности, где последовательность CDR-L3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:94, и консервативные модификации в их последовательности, и где выделенное антитело ингибирует MASP-2-зависимую активацию комплемента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к человеческому антителу, которое связывается с человеческим MASP-2, где указанное антитело включает: I) a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: i) CDR-H1 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 31-35 SEQ ID NO:21; и ii) CDR-H2 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 50-65 SEQ ID NO:21; и iii) CDR-H3 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 95-102 SEQ ID NO:21; и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую: i) CDR-L1 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 24-34 SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27; и ii) CDR-L2 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 50-56 SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27; и iii) CDR-L3 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 89-97 SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27; или II) их вариант, который идентичен указанным вариабельным доменам, за исключением тех вариантов, которые содержат все 10 аминокислотных замен в указанных CDR-областях указанной вариабельной области тяжелой цепи и все 10 аминокислотных замен в указанных CDR-областях указанной вариабельной области легкой цепи, где указанное антитело или его вариант ингибируют MASP-2-зависимую активацию комплемента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с человеческим MASP-2, где указанное антитело включает: I) a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: i) CDR-H1 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 31-35 SEQ ID NO:20; и ii) CDR-H2 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 50-65 SEQ ID NO:20; и iii) CDR-H3 тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность 95-102 SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20; и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую: i) CDR-L1 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 24-34 SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:24; и ii) CDR-L2 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 50-56 SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:24; и iii) CDR-L3 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность 89-97 SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:24; или II) их вариант, который идентичен указанным вариабельным доменам, за исключением тех вариантов, которые содержат все 10 аминокислотных замен в указанных CDR-областях указанной вариабельной области тяжелой цепи и все 10 аминокислотных замен в указанных CDR-областях указанной вариабельной области легкой цепи, где указанное антитело или его вариант ингибируют MASP-2-зависимую активацию комплемента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с человеческим MASP-2 и включают вариабельную область тяжелой цепи, содержащую любую из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с человеческим MASP-2 и включают вариабельную область легкой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим аминокислотные последовательности анти-MASP-2 антител или их фрагментов согласно изобретению, представленные в таблице 2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотные последовательности анти-MASP-2 антител или их фрагментов согласно изобретению, представленные в таблице 2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения выделенного анти-MASP-2 антитела, где указанный способ включает культивирование клеток, содержащих по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотные последовательности анти-MASP-2 антител согласно изобретению, в условиях, благоприятствующих экспрессии молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих анти-MASP-2 антитело, и выделение указанного анти-MASP-2 антитела.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полностью человеческому моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которые диссоциируют из человеческого MASP-2 с KD=10 нМ или менее, как было определено методом поверхностного плазмонного резонанса, и ингибируют активацию C4 на покрытом маннаном субстрате с IC50=10 нМ или менее в 1% сыворотке. В некоторых вариантах изобретения указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически распознает по меньшей мере часть эпитопа, распознаваемого эталонным антителом, где указанное эталонное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:20, и вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:24.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим полностью человеческие моноклональные анти-MASP-2 антитела согласно изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у индивидуума, где указанные способы включают введение индивидууму человеческого моноклонального антитела согласно изобретению в количестве, достаточном для ингибирования MASP-2-зависимой активации комплемента у указанного индивидуума.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему унифицированную дозу человеческого моноклонального анти-MASP-2 антитела согласно изобретению, подходящую для терапевтического введения индивидууму, где указанная унифицированная доза составляет в пределах от 1 мг до 1000 мг.
Описание графического материала
Вышеупомянутые аспекты изобретения и многие из описанных здесь преимуществ изобретения будут более очевидными и более понятными для специалиста из нижеследующего подробного описания, которое сопровождается прилагаемым графическим материалом, где:
на фиг.1A представлена диаграмма, иллюстрирующая геномную структуру человеческого MASP-2;
на фиг.1B представлена диаграмма, иллюстрирующая доменную структуру человеческого белка MASP-2;
на фиг.2 графически проиллюстрированы результаты ELISA-анализа, осуществляемого на популяциях поликлональных антител, выбранных из scFcv-фаговых библиотек, подвергнутых пэннингу на различные антигены MASP-2, как описано в примере 2;
на фиг.3A и 3B представлены результаты тестирования 45 scFv-клонов-кандидатов на функциональную активность в анализе комплемента, как описано в примере 3;
на фиг.4 графически проиллюстрированы результаты эксперимента, который был осуществлен в целях сравнения уровней C3c в трех сыворотках (в человеческой сыворотке, крысиной сыворотке и в сыворотке примата, не являющегося человеком (NHP)), как описано в примере 4;
на фиг.5A проиллюстрировано выравнивание аминокислотных последовательностей области тяжелой цепи (остатки 1-120) наиболее активных клонов, которое выявило две отдельные группы, принадлежащие к семейству генов VH2 и VH6, соответственно, как описано в примере 4;
на фиг.5B проиллюстрировано выравнивание аминокислотных последовательностей scFv-клонов 17D20, 17N16, 18L16 и 4D9, как описано в примере 4;
на фиг.6 графически проиллюстрированы ингибирующие активности препаратов конвертированных материнских клонов IgG4 в анализе на осаждение C3b с использованием 90% человеческой плазмы, как описано в примере 5;
на фиг.7A графически проиллюстрированы результаты ELISA-анализа на материнском клоне 17N16 и на дочерних клонах, оттитрованных на huMASP2A, как описано в примере 6;
на фиг.7B графически проиллюстрированы результаты ELISA-анализа на материнском клоне 17D20 и на дочерних клонах, оттитрованных на huMASP2A, как описано в примере 6;
на фиг.8 проиллюстрировано выравнивание последовательностей белка материнского клона 17N16 и дочернего клона 17N9, указывающее на то, что легкие цепи (начиная с SYE) имеют 17 аминокислотных остатков, которые отличались у этих двух клонов, как описано в примере 6;
на фиг.9 проиллюстрировано выравнивание области CDR-H3 последовательностей белка клонов #35, #59 и #90, полученных в результате мутагенеза, и последовательностей материнского клона 17D20, как описано в примере 7;
на фиг.10A проиллюстрировано выравнивание области CDR3 последовательностей белка материнского клона 17D20 с последовательностью клона 17D20md21N11, полученных путем перестановки цепей, и с последовательностью CDR-H3 мутированного клона #35, представленной на фиг.9, в комбинации с последовательностью VL клона 17D20md21N11 (VH35-VL21N11), как описано в примере 7;
на фиг.10B проиллюстрировано выравнивание последовательностей областей VL и областей VH материнского клона 17D20 и дочернего клона 17D20md21N11, как описано в примере 7;
на фиг.11A графически проиллюстрированы результаты анализа на осаждение C3b, осуществляемого на вариантах изотипа дочернего клона (MoAb#1-3), полученных из материнского клона 17N16 человеческого моноклонального анти-MASP-2 антитела, как описано в примере 8;
на фиг.11B графически проиллюстрированы результаты анализа на осаждение C3b, осуществляемого на вариантах изотипа дочернего клона (MoAb#4-6), полученных из материнского клона 17D20 человеческого моноклонального анти-MASP-2 антитела, как описано в примере 8;
на фиг.12A и 12B графически проиллюстрировано тестирование материнских клонов и MoAb#1-6 в анализе на осаждение C3b в 95% сыворотке, как описано в примере 8;
на фиг.13 графически проиллюстрировано ингибирование осаждения C4b в 95% нормальной человеческой сыворотке, как описано в примере 8;
на фиг.14 графически проиллюстрировано ингибирование осаждения C3b в 95% сыворотке африканской зеленой мартышки, как описано в примере 8;
на фиг.15 графически проиллюстрировано ингибирование активности предварительно собранного комплекса MBL-MASP2 в расщеплении C4 под действием MoAb#2-6, как описано в примере 8;
на фиг.16 графически проиллюстрировано преимущественное связывание MoAb#6 с человеческим MASP2 по сравнению с C1s, как описано в примере 8;
на фиг.17 графически продемонстрировано, что лектиновый путь полностью ингибировался после внутривенного введения античеловеческого антитела MoAb#OMS646 африканским зеленым мартышкам, как описано в примере 10;
на фиг.18A представлен график выживаемости по Каплану-Мейеру, который представляет собой кривую зависимости процента выживаемости от времени после облучения контрольных мышей и мышей, обработанных антителом против мышиных MASP-2 (mAbM11) или антителом против человеческих MASP-2 (mAbOMS646), дозой радиоактивного излучения 7,0 Грей, как описано в примере 11;
на фиг.18В представлен график выживаемости по Каплану-Мейеру, который представляет собой кривую зависимости процента выживаемости от времени после облучения контрольных мышей и мышей, обработанных антителом против мышиных MASP-2 (mAbM11) или антителом против человеческих MASP-2 (mAbOMS646), дозой радиоактивного излучения 6,5 Грей, как описано в примере 11;
на фиг.18С представлен график выживаемости по Каплану-Мейеру, который представляет собой кривую зависимости процента выживаемости от времени после облучения контрольных мышей и мышей, обработанных антителом против человеческих MASP-2 (mAbOMS646), дозой радиоактивного излучения 8,0 Грей, как описано в примере 11;
на фиг.19 графически проиллюстрированы результаты анализа, проводимого методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore), на анти-MASP-2 антителе OMS646 (единицы отклика (связывания) в зависимости от времени в секундах), где указанные результаты показали, что иммобилизованное антитело OMS646 связывается с рекомбинантным MASP-2 с константой Koff приблизительно 1-3×10-4 с-1 и с константой Kon приблизительно 1,6-3×106 М-1·с-1, как описано в примере 12;
на фиг.20 графически проиллюстрированы результаты ELISA-анали