Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения

Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка притязает на приоритет согласно 35 U.S.C. § 119 на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 61/721072, поданной 1 ноября 2012 года, и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/787927, поданной 15 марта 2013 года, обе заявки включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

В настоящем описании раскрыты поливалентные и полиспецифичные связывающие белки, способы получения связывающих белков и их применения для диагностики, подавления, профилактики и/или лечения рака, опухолей и/или других зависимых от ангиогенеза заболеваний.

Сконструированные белки, такие как полиспецифичные связывающие белки, способные связывать два или больше антигенов, известны в данной области. Такие полиспецифичные связывающие белки могут быть созданы с использованием слияния клеток, химической конъюгации или методики получения рекомбинантной ДНК. Существует множество полиспецифичных связывающих белковых структур, известных в данной области; однако многие такие структуры и способы имеют явные недостатки.

Биспецифичные антитела были получены с использованием методики квадром. Однако присутствие ошибочно спаренных побочных продуктов и значимо сниженные выходы продукции при использовании такой методики означают, что требуются сложные способы очистки. Биспецифичные антитела также могут быть получены в результате химической конъюгации двух разных мАт. Однако такой способ не дает гомогенных препаратов.

Другие способы, применяемые ранее, включают связывание двух исходных антител с помощью гетеро-бифункицонального поперечносшивающего агента, получение тандемных одноцепочечных молекул Fv, диантител, биспецифичных диантител, одноцепочечных диантител и ди-диантител. Однако каждый из таких способов имеет недостатки. Кроме того, была описана конструкция поливалентного антитела, содержащего два повтора Fab в тяжелой цепи IgG и способная связывать четыре молекулы антигена (смотрите публикацию PCT № WO 0177342 и публикацию Miller с соавторами (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61).

Системы лиганд-рецептор эволюционировали совместно для поддержания специфичности. Их взаимодействия активируют специфичную передачу сигналов для конкретной биологической активности. Однако не являющиеся лигандами связывающие рецептор белки, такие как моноспецифичные антитела, би- или полиспецифичные связывающие белки, сочетания неконкурентных антител или другие связывающие рецептор белки, связывающиеся с внеклеточным доменом (ECD) рецептора, могут узнавать эпитопы, отличные от связывающего лиганд участка рецептора. Связывание с таким отличающимся эпитопом(ами) на ECD рецептора может передавать конформационные изменения внутриклеточному домену, что может приводить к новому неожиданному каскаду передачи сигнала.

В патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме) предлагается новое семейство связывающих белков, способных связывать два или больше антигенов с высокой аффинностью, которые названы связывающими белками с двойным вариабельным доменом (DVD-связывающий белок) или иммуноглобулинами с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig™). DVD-молекулы являются тетравалентными Ig-подобными белками с двойной специфичностью, способными связывать два разных эпитопа на одной и той же молекуле или две разных молекулы одновременно. DVD являются уникальными связывающими белками, состоящими из двух вариабельных доменов, слитых с N-концом бивалентного антитела. Вариабельные домены могут быть непосредственно слиты друг с другом или могут быть связаны через синтетические пептидные линкеры разной длины и аминокислотного состава. DVD могут быть сконструированы с интактными и функциональными Fc-доменами, позволяя им затем опосредовать соответствующие эффекторные функции. Форма DVD вследствие гибкости в отношении выбора пары антител, ориентации двух антигенсвязывающих доменов и длины линкера, который их связывает, может обеспечивать новые терапевтические возможности.

Хотя в данной области предлагается множество структур с некоторыми преимуществами и недостатками, необходимы специфичные конструкции для получения поливалентных связывающих белков со специфичными свойствами, которые связываются со специфичными мишенями. Кроме того, новые последовательности вариабельных доменов могут дополнительно улучшать свойства связывающих белков. В частности, улучшенные DVD, которые связываются с DLL4 и VEGF, могут оказаться полезными. Соответственно, в настоящем описании раскрыты иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами, получаемые с использованием каркаса связывающего белка, раскрытого в патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме), и содержащие конкретные первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая содержит первую и вторую последовательности вариабельных доменов (например, последовательности, перечисленные в таблице 2), которые образуют функциональные связывающие участки для VEGF и DLL4. В некоторых вариантах первая и вторая полипептидные цепи содержат первую и вторую последовательности вариабельного домена, каждая из которых содержит три CDR из одной из последовательностей, перечисленных в таблице 2, и образуют функциональные участки связывания для VEGF и DLL4.

DLL4 является лигандом, вовлеченным в передачу сигналов от клетки к клетке посредством пути рецептора Notch. Такая коммуникация между клетками необходима для многих биологических процессов, таких как дифференцировка, пролиферация и гомеостаз. Путь передачи сигнала Notch является одной из систем, которая используется широким кругом эукариот. Такой путь, особенно рецептор Notch, также важен для функционального опухолевого ангиогенеза. Таким образом, ингибирование функции рецептора Notch, блокирование рецептора Notch и/или блокирование пути передачи сигнала Notch являются возможными стратегиями создания противоопухолевых композиций и способов терапии. Было доказано, что низкомолекулярные ингибиторы рецептора Notch часто бывают токсичными, поскольку они подавляют экспрессию рецепторов Notch дикого типа (нормальную) в организме. Таким образом, разные представители пути передачи сигналов Notch можно рассматривать в качестве потенциальных мишеней для терапии. Лигандом рецептора Notch в сосудистой системе является Delta 4 или Delta-подобный 4 (DLL4). Широко экспрессируемый в сосудистой системе DLL4 важен для развития сосудов (Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)). У мышей, гетерозиготных по DLL4, наблюдают эмбриональную гибель вследствие крупных дефектов развития сосудов (Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)).

Экспрессия DLL4 может быть индуцирована VEGF (Liu et al., Mol. Cell Biol., 23(1): 14-25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007)). VEGF является сигнальным белком, продуцируемым клетками, вовлеченными в ангиогенез. Кроме того, DLL4 может негативно регулировать передачу сигнала VEGF, отчасти посредством репрессии VEGFR2 и индукции VEGR1 (Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)). Тонкая координация между DLL4 и VEGF важна для функционального ангиогенеза, что делает и DLL4 и VEGF потенциальными мишенями для терапевтического вмешательства.

Кроме своей физиологической роли DLL4 и VEGF также подвергаются повышающей регуляции в кровеносных сосудах в опухолях Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)). Было показано, что блокирование DLL4 ингибирует рост первичных опухолей во множестве моделей (Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006); Ridgway et al., Nature, 444(7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood, 109(11): 4753-4760 (2007)). Ингибирование DLL4 эффективно даже против опухолей, которые резистентны к анти-VEGF-терапии. Таким образом, комбинированное ингибирование и DLL4 и VEGF может приводить к усиленной противоопухолевой терапии. Интересно, что в отличие от ингибирования VEGF, которое снижает формирование сосудов в опухоли, блокирование DLL4 приводит к увеличению плотности сосудистой системы в опухоли, при этом сосуды являются аномальными, не могут поддерживать эффективный перенос крови и функционально неэффективными. Таким образом, разрушение обоих лигандов VEGF и DLL4 обеспечивает разные способы действия потенциальных противоопухолевых средств лечения.

Хотя в данной области известны антитела и различные связывающие конструкции, сохраняется необходимость в улучшенном целенаправленном действии и повышенной эффективности связывания с VEGF и DLL4, например, для лечения злокачественной опухоли и канцерогенеза. В данной области имеется потребность в улучшенных поливалентных связывающих белках, способных связывать DLL4 и VEGF. Соответственно предлагаются новые связывающие белки, при этом связывающие белки способны связывать DLL4 и VEGF. В некоторых вариантах связывающие белки способны, например, связываться с DLL4 и VEGF с улучшенной аффинностью связывания и/или эффективностью нейтрализации.

Предлагаются связывающие белки, способные целенаправленно действовать на два эпитопа, при этом связывающие белки способны связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте предлагаются связывающие белки, способные связывать эпитопы DLL4 и VEGF с высокой аффинностью. В одном варианте связывающие белки содержат каркас связывающего белка с двойным вариабельным доменом, который содержит последовательности CDR и вариабельных доменов, перечисленные в таблице 2. В одном варианте каркас связывающего белка с двойным вариабельным доменом содержит каркас, описанный в патенте США № 7612181 (включенном в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме).

В одном варианте предлагаются связывающие белки, содержащие полипептидную цепь, которая может связывать два эпитопа двух разных белков (VEGF и DLL4), при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает аминокислоту или полипептид, X2 означает Fc-область, и n равно 0 или 1. В некоторых вариантах VD1 и VD2 в связывающем белке представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи. В некоторых вариантах VD1 и VD2 способны связывать эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF. В некоторых вариантах C означает константный домен тяжелой цепи, такой как CH1. В некоторых вариантах X1 означает линкер при условии, что X1 не означает CH1.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, содержит полипептидную цепь, которая связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF, при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 содержит первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи, C содержит константный домен тяжелой цепи, X1 содержит линкер, и X2 содержит Fc-область. В одном варианте X1 означает линкер при условии, что он не является CH1. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR, выбранные из CDR в последовательностях SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте вариабельные домены тяжелой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:39.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, содержит полипептидную цепь, которая связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF, при этом полипептидная цепь содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 содержит первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 содержит второй вариабельный домен легкой цепи, C содержит константный домен легкой цепи, X1 содержит линкер, и X2 не содержит Fc-область. В одном варианте X1 означает линкер при условии, что он не является CH1 или CL. В одном варианте каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR, выбранные из CDR в последовательностях SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В другом варианте раскрыт связывающий белок, который связывает эпитоп DLL4 и эпитоп VEGF. В некоторых вариантах связывающий белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равно 0 или 1, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок, и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок. В одном варианте X2 содержит Fc-область, когда n=1, и X2 не содержит Fc-области, когда n=0. В некоторых вариантах последовательности X1 в первой и второй полипептидных цепях являются одинаковыми. В других вариантах последовательности X1 в первой и второй полипептидных цепях являются разными. В некоторых вариантах X1 в по меньшей мере одной из полипептидных цепей не является доменом CH1 и/или доменом CL. В одном варианте последовательность X1 является коротким линкером (например, 6, 5, 4, 3 или 2 аминокислот). В другом варианте последовательность X1 является длинным линкером (например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30 или больше аминокислот). В другом варианте последовательность X1 в одной из двух полипептидных цепей представляет собой короткий линкер, а последовательность X1 в другой полипептидной цепи представляет собой длинный линкер. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR из последовательностей SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39; и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат три CDR из последовательностей SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54 (т.е. CDR 1-3 из одной из таких последовательностей), при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте вариабельные домены тяжелой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39, и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, или 54, при этом, по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В различных вариантах раскрыт связывающий белок, который способен связывать VEGF и DLL4. В некоторых вариантах связывающий белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, при этом каждая из первой и второй полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равен 0 или 1, при этом домены VD1 в первой и второй полипептидных цепях образуют первый функциональный связывающий мишень участок и домены VD2 в первой и второй полипептидных цепях образуют второй функциональный связывающий мишень участок. В одном варианте вариабельные домены, которые образуют функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержат три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:41 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:42, присутствующие в отдельных цепях, при этом CDR в каждой цепи распределены в указанном порядке и разделены подходящими каркасными последовательностями с образованием функционального связывающего участка). В одном варианте вариабельные домены, которые образуют функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержат три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:39 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:40, присутствующие в отдельных цепях, при этом CDR в каждой цепи распределены в указанном порядке и разделены подходящими каркасными последовательностями с образованием функционального связывающего участка). В одном варианте связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:41 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:42), и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40 (например, CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:39 и CDR 1-3 из последовательности SEQ ID NO:40). В одном варианте связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий последовательности SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий последовательности SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:56, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:64. В одном варианте связывающий белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:73, и вторую полипептидную цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO:74. В некоторых вариантах вариабельные домены, которые образуют участок связывания для DLL4, включают домены, описанные в публикации заявки на выдачу патента США № 20110217237, и/или вариабельные домены, которые образуют участок связывания для VEGF, включают домены, описанные в публикации заявки на выдачу патента США № 20100076178, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. В одном варианте связывающий белок содержит h1A11.1-SL-Av. В одном варианте связывающий белок h1A11.1-SL-Av содержит Fc-область из мутанта LALA IgG1 человека.

Для разработки и получения связывающего белка, подходящего для применения в качестве терапевтического средства для человека, например, в качестве противоракового/противоопухолевого средства, может требоваться больше, чем просто идентификация связывающего белка, способного связываться с требуемой мишенью или мишенями. Например, кандидат может связывать свою мишень(мишени), но проявлять пониженную способность ингибировать или нейтрализовать требуемую мишень, может создавать трудности при приготовлении стабильного препарата, может проявлять нежелательные фармакокинетические свойства или может быть связан с трудностями при получении в подходящей системе экспрессии (например, экспрессии в клетке-хозяине, такой как CHO). Таким образом, факторы, которые необходимо учитывать при разработке подходящего терапевтического средства включают, но без ограничения, (a) кинетику связывания (скорость образования комплекса, скорость распада комплекса и аффинность) как для внутреннего, так и для внешнего антигенсвязывающих доменов, (b) эффективности в различных биохимических и клеточных биологических анализах, (c) эффективности in vivo в соответствующих моделях опухолей, (d) фармакокинетические и фармакодинамические свойства, (e) возможность производства, включая уровень экспрессии белка в выбранных линиях клеток, масштабируемость, посттрансляционную модификацию, физико-химические свойства, такие как процентное содержание мономеров, растворимость и стабильность (собственная стабильность, стабильность при замораживании/размораживании, стабильность при хранении и т.д.), (f) свойства, связанные с приготовлением препарата, (g) потенциальный риск иммуногенности и (h) токсикологические свойства молекулы. Также можно оценивать способность к связыванию и валентность, так как они могут влиять на свойства связывания и эффективность молекулы в клетке. В случае некоторых связывающих белков даже небольшие изменения в аминокислотных последовательностях вариабельных доменов, константных доменов и/или линкеров потенциально могут влиять (позитивно или негативно) на один или несколько таких факторов, и таким образом, может быть проведена оценка сочетания факторов, чтобы выбрать лучшего кандидата. После идентификации лучшего кандидата проводят дополнительную оценку in vivo терапевтических свойств включая оценку безопасности, эффективности и активность у животных и человека.

В этой связи неожиданно было обнаружено, что связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64, или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74, имел превосходное сочетание свойств, таких как кинетика связывания (т.е. константа диссоциации), превышающая терапевтически применимый порог, улучшенная способность к нейтрализации, повышенная эффективность in vivo, превосходные свойства, обеспечивающие возможность получения препарата, требуемая картина гликозилирования, подходящий профиль фармакокинетики и эффективная экспрессия в клетках-хозяевах по сравнению с другими оцениваемыми связывающими белками, содержащими другие вариабельные домены и/или линкерные последовательности. Связывающие белки для сравнения могут включать белки, имеющие такие же последовательности вариабельных доменов и ориентации, но с другими линкерами, а также белки, имеющие измененные ориентации связывающих доменов и/или других последовательностей вариабельных доменов (например, последовательностей с созревшей аффинностью, полностью человеческие последовательности и т.д.). В некоторых вариантах такие превосходные свойства зависят от выбора конкретных последовательностей вариабельных доменов (например, SEQ ID NO:39-42), конкретной ориентации доменов, связывающих VEGF и DLL4, во внутренних и наружных положениях (например, ориентации, представленные в последовательностях SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64), конкретных линкерных последовательностей (например, вариабельные домены тяжелой цепи и короткая линкерная последовательность, используемые в последовательности SEQ ID NO:56, и вариабельные домены легкой цепи и длинная линкерная последовательность, используемые в последовательности SEQ ID NO:64), и/или конкретных последовательностей константных доменов (например, последовательности константного домена, используемые в последовательностях SEQ ID NO:73 и 74). В некоторых вариантах только изменение линкерной последовательности может иметь значимое влияние на функциональные свойства. Например, выбор линкерной последовательности, используемой в последовательности SEQ ID NO:73 и 74 (наряду с вариабельными и константными доменами, включенными в такие последовательности) может способствовать неожиданному улучшению терапевтических свойств связывающего белка для человека. Например, в таблице 9 показано влияние различных линкерных последовательностей на противоопухолевую эффективность in vivo, которую измеряли в моделях ксенотрансплантатов аденокарциномы прямой и ободочной кишки и глиобластомы. Таким образом, например, применение последовательностей SEQ ID NO:56 и 64 или SEQ ID NO:73 и 74 (включая входящие в них линкерные последовательности), может обеспечивать неожиданное повышение противоопухолевой эффективности in vivo.

В различных вариантах связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, имеет требуемую аффинность связывания, способность к блокированию и/или активность в нейтрализации VEGF и/или DLL4, например, на уровнях, примерно сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в случае антител против VEGF (например, AVASTIN®) или DLL4 (например, антитело h1A11.1). В некоторых вариантах связывающий белок имеет повышенную аффинность, способность к блокированию и/или активность в нейтрализации VEGF и/или DLL4 по сравнению сл связывающими белками DVD-Ig, содержащими другие последовательности вариабельных доменов или линкеры. В некоторых вариантах связывающий белок содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:41 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий три CDR из последовательности SEQ ID NO:39 и три CDR из последовательности SEQ ID NO:40; или содержит функциональный связывающий мишень участок для VEGF, содержащий последовательности SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42, и функциональный связывающий мишень участок для DLL4, содержащий последовательности SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:40; или содержит последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64; или содержит последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74. Например, связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) может обладать способностью связываться с VEGF с константой диссоциации (K_D) не более чем приблизительно 7,0×10^-10 М, которую измеряют, используя резонанс поверхностного плазмона, и/или блокирующей VEGF активностью с IC50 не более чем приблизительно 3,8 нМ, которую измеряют в конкурентном ELISA VEGFR1; и/или способен связываться с DLL4 с константой диссоциации (K_D) не более чем приблизительно 1,0×10^-8 M, которую измеряют с использованием резонанса поверхностного плазмона, и/или может обладать блокирующей DLL4 активностью с IC50 не более чем приблизительно 1,09 нМ, которую измеряют в конкурентном ELISA Notch.

В некоторых вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) может иметь повышенную активность в нейтрализации DLL4, в том числе и в случае присутствия VEGF, по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (например, исходных антител, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). В некоторых вариантах связывающий белок может иметь повышение на порядок активности в нейтрализации DLL4, также и в случае присутствия VEGF, по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (например, исходных антител, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). Например, в таблице 24 показано, что связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74, повышение на порядок активности в нейтрализации DLL4, в том числе и в присутствии по меньшей мере приблизительно 1,2 нМ VEGF (например, по меньшей мере приблизительно 1,2, 1,5, 2, 2,5, 5, 10, 50, 150 или больше), по сравнению со смесью антител к VEGF и DLL4 (исходных антитела, используемых для получения вариабельных доменов для связывающего белка). Такое свойство нейтрализовать DLL4 может быть полезным, поскольку в ситуации лечения опухоли in vivo уровни VEGF обычно более высокие вблизи опухоли, чем в общей циркуляции, что обеспечивает как улучшенное направление к мишени, так и повышенную активность в нейтрализации функционального DLL4 в месте опухоли.

В различных вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74) проявляет улучшенные свойства, например, повышенную безопасность, повышенную стабильность, более высокую активность, пониженные воспалительные и иммунные ответы или другие полезные для терапии человека in vivo свойства, по сравнению с другими средствами лечения злокачественных опухолей и/или васкуляризированных опухолей. Средства лечения, подходящие для сравнения, могут включать введение низкомолекулярного противоопухолевого средства или антитела против VEGF (например, авастина®) и/или DLL4 (например, антитела h1A11.1), или связывающего белка DVD-Ig, содержащего другие последовательности вариабельного домена и/или линкеры. В некоторых вариантах связывающий белок проявляет улучшенные свойства по сравнению с современным стандартом лечения злокачественной опухоли и/или васкуляризированной опухоли. Например, связывающий белок может иметь улучшенную кинетику связывания, превосходную терапевтическую эффективность in vivo, улучшенную способность подвергаться обработке при приготовлении препарата (включая уменьшенную агрегацию и повышенную стабильность при хранении), улучшенную фармакокинетику, пониженный воспалительный или иммунный ответ и/или повышенные уровни экспрессии в клетке-хозяине.

В некоторых вариантах связывающий белок (например, связывающий белок, содержащий последовательности SEQ ID NO:56 и SEQ ID NO:64 или содержащий последовательности SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO:74), вызывает превосходящие (например, аддитивные и/или сверхаддитивные) эффекты в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, по сравнению с анти-VEGF-антителом или анти-DLL4-антителом в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами или по сравнению со связывающим белком DVD-Ig, содержащим другие последовательности вариабельных доменов и/или линкеры, в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами. Например, превосходящими связывающими свойствами могут быть свойства, указанные в таблицах 27-30 и 34. Например, связывающий белок может вызывать по меньшей мере приблизительно 50% или большее (например, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150% или большее) ингибирование роста опухоли или задержку роста опухоли после введения отдельно или в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, по сравнению с необработанной опухолью. Противоопухолевым средством может быть, например, один или несколько из следующих средств; иринотекан, FOLFIRI, темозоломид, гемцитабин, паклитаксел, 5-FU и капецитабин или любое другое низкомолекулярное или биологическое средство, применяемое при лечении конкретной злокачественной опухоли. Связывающий белок отдельно или в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми средствами можно применять в качестве лекарственного средства для лечения, например, рака ободочной кишки, глиобластомы, рака поджелудочной железы или рака молочной железы.

В одном варианте связывающий белок с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig) содержит две первых и две вторых полипептидных цепи, которые описаны в предыдущем абзаце (т.е. содержит четыре полипептидных цепи), при этом каждая из полипептидных цепей независимо содержит VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 означает первый вариабельный домен, VD2 означает второй вариабельный домен, C означает константный домен, X1 означает линкер, X2 означает Fc-область, и n равен 0 или 1. В некоторых вариантах первая цепь представляет собой тяжелую цепь и спарена со второй цепью, которая представляет собой легкую цепь. Такой связывающий белок DVD-Ig содержит четыре функциональных связывающих мишень участка. В некоторых вариантах линкеры X1 в первой и второй полипептидных цепях являются одинаковыми или разными. В некоторых вариантах связывающие белки DVD-Ig содержат по меньшей мере две последовательности вариабельных доменов (например, VD1 и VD2), способных связывать два или больше эпитопов (например, два, три или четыре) одного и того же или разных белков в любой ориентации. В некоторых вариантах VD1 и VD2 выбирают независимо. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит три CDR из последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:39, и вариабельные домены легкой цепи VD1 и VD2 содержат три CDR в последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит три CDR в последовательности SEQ ID NO:40. В другом варианте связывающий белок способен связывать DLL4 и VEGF. В одном варианте каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 или 53, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39, и каждый из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и VD2 содержит последовательности SEQ ID NO:40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 или 54, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В другом варианте связывающий белок с двойным вариабельным доменом содержит последовательность тяжелой цепи и легкой цепи, которая показана в таблице 2, при этом по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:39 и/или по меньшей мере один из вариабельных доменов легкой цепи VD1 и/или VD2 содержит последовательность SEQ ID NO:40.

В следующем варианте любой из вариантов из тяжелой цепи, легкой цепи, двух цепей или четырех цепей содержит по меньшей мере один линкер X1, включающий линкеры, выбранные из последовательностей SEQ ID NO:1-38. В одном варианте X2 означает Fc-область. В другом варианте X2 означает вариант Fc-области.

В еще одном варианте Fc-область, если она присутствует в первом полипептиде, представляет собой Fc-область с нативной последовательностью или Fc-область с вариантом последовательности. В еще одном варианте Fc-область представляет собой Fc-область из IgG1, Fc-область из IgG2, Fc-область из IgG3, Fc-область из IgG4, Fc-область из IgA, Fc-область из IgM, Fc-область из IgE или Fc-область из IgD. В некоторых вариантах Fc-область представляет собой Fc-область из мутанта LALA IgG1 человека, который является мутантом антитела b12, которое обеспечивает защиту от вируса ВИЧ.

Предлагается способ получения связывающего белка, который связывает два разных белка-мишени. В одном варианте способ получения связывающего белка включает в себя стадии: a) получения первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которая связывает первый эпитоп; b) получения второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части, которая связывает второй эпитоп; c) получения конструкции(ий), кодирующей любой из связывающих белков, описанных в настоящей публикации; и d) экспрессии полипептидных цепей так, чтобы был создан связывающий белок, который связывает первый и второй эпитопы.

В любом из описанных в настоящей публикации вариантов вариабельный домен тяжелой цепи VD1, ели он присутствует, и вариабельный домен легкой цепи, если он присутствует, могут быть из первого исходного антитела или его антигенсвязывающей части; вариабельный домен тяжелой цепи VD2, если он присутствует, и вариабельный домен легкой цепи, если он присутствует, могут быть из второго исходного антитела или его антигенсвязывающей части. Первое и второе исходные антитела могут быть одинаковыми или разными.

В одном варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген, и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В одном варианте первый и второй антигены являются разными антигенами. В другом варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с другой эффективностью, отличной от эффективности, с которой второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген. В еще одном варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает первый антиген с аффинностью, отличной от аффинности, с которой второй исходное антитело или его антигенсвязывающая часть связывает второй антиген.

В другом варианте первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть являются антителами человека, CDR-привитыми антителами, гуманизированными антителами и/или антителами с созревшей аффинностью.

В другом варианте связывающий белок обладает по меньшей мере одним требуемым свойством, которым обладает первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть или второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть. Альтернативно первое исходное антитело или его антигенсвязывающая часть и второе исходное антитело или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере одним требуемым свойством, которое проявляется связывающим белком. В одном варианте требуемым свойством является один или несколько параметров антитела. В другом варианте параметрами антитела являются специфичность по отношению к антигену, аффинно