Обнаружение клеток, полученных из ткани пуповины человека

Обнаружение клеток, полученных из ткани пуповины человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США № 61/579710, поданной 23 декабря 2011 года, которая в полном объеме содержится в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как, например, клетки, полученные из ткани пуповины человека, в образце биологической жидкости пациента, который проходил клеточную терапию.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапия аллогенными клетками является многообещающей новой технологией для лечения множества нереализованных потребностей медицины. Однако клетки для клеточной терапии являются уникальными продуктами, процесс разработки которых связан с некоторыми проблемами. Одним из конкретных примеров данной технологии является развитие клеток, полученных из ткани пуповины человека («hUTC»), которые используются по различным клиническим показаниям. Последующее введение пациентам hUTC и определение наличия и/или количества клеток, обнаруженных в крови пациента, позволяют получить необходимую информацию, которая связана с фармакокинетикой hUTC с точки зрения продукта для клеточной терапии. Тем не менее, это представляет собой проблему, поскольку hUTC может иметь характеристики, которые аналогичны таковым для клеток, которые были получены из крови пациента. Таким образом, необходимо отличать hUTC от других клеток.

Клинические исследования во время разработки содержат исследования фармакокинетики для определения параметров абсорбции, распределения, метаболизирования и экскреции лекарственного препарата in vivo. Важным элементом исследований фармакокинетики является определение уровня воздействия лекарственного препарата на пациентов. Обычно это производится при помощи анализа концентрации лекарственного препарата в образцах крови; уровни воздействия оцениваются в связи с эффективностью и безопасностью препарата. В случае продукта для клеточной терапии, такого как hUTC, исследование биораспределения или фармакокинетики hUTC в рамках клинических исследований представляет собой проблему, поскольку не существует общепринятого способа различения hUTC (или других клеточных продуктов) и собственных клеток пациента. Таким образом, сложно определить биодоступность hUTC.

Принятый в настоящее время подход для определения наличия аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) в кровотоке требует использования аллогенных клеток для терапевтических целей, например, hUTC), которые были получены у донора мужского пола и введены путем внутривенного переливания крови пациенткам женского пола. См., например, Bader P. et al., «How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation?» Bone Marrow Transplantation, 2005; 35: 107-119; см. также Durnman, DM et al., «Analysis of the origin of marrow cells in bone marrow transplant recipients using a Y-chromosome-specific in situ hybridization assay,» Blood, 1989; 74: 2220-2226. ПЦР в режиме реального времени используется для обнаружения Y-хромосомы в образце крови пациента и получения результатов в виде количественного описания или двоичного сигнала для определения наличия или отсутствия аллогенных клеток для терапевтических целей (например, hUTC) в образце крови. См. Brader P. et al. Данный подход требует исключения использования клеток (например, hUTC) от доноров женского пола и пациентов мужского пола из анализов фармакокинетики hUTC в клинических исследованиях. Таким образом, сохраняется потребность в способе обнаружения аллогенных клеток, таких как, например, UTC, у пациентов после введения данных клеток.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает обнаружение наличия аллогенных клеток для терапевтических целей в образце мононуклеарных клеток периферической крови человека. Изобретение обеспечивает обнаружение подобных клеток для терапевтических целей без ограничения по кариотипу клеток для терапевтических целей (XY против XX) и полу реципиента (пациента).

Один вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в крови, содержащим: (a) проведение анализа аллогенных клеток для терапевтических целей и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) получение образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (c) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей; и (d) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и аллогенных клеток для терапевтических целей на основании обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей. В одном варианте осуществления один или более маркер, характерный для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, содержит CD45. В качестве альтернативы способ обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей содержит: (a) проведение анализа аллогенных клеток для терапевтических целей и мононуклеарных клеток периферической крови пациента для определения одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) сравнение одного или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, для определения одного или более уникальных маркеров, которые отличают аллогенные клетки для терапевтических целей от мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (c) получение образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (d) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более уникальных маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей; и (e) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и аллогенных клеток для терапевтических целей на основании обнаружения одного или более уникальных маркеров.

Способы могут подходить для обнаружения любых необходимых аллогенных клеток для терапевтических целей. Например, аллогенные клетки для терапевтических целей могут быть выбраны из группы, содержащей клетки, полученные из ткани пуповины человека, клетки, полученные из пуповинной крови человека, клетки, полученные из плаценты, клетки, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, клетки печени, клетки островков Лангерганса, кардиомиоциты и клетки нерастворимого коллагенового костного матрикса. Данные способы могут также использоваться для обнаружения двух или более различных типов аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови.

В этих способах может использоваться множество различных аналитических методик, таких как, например, проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации. Кроме того, способы могут содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (b). Стадия обогащения может содержать методику магнитной сепарации. Стадия различения содержит установления различия между аллогенными клетками для терапевтических целей, которые были введены пациенту, и мононуклеарными клетками периферической крови пациента, которые были получены у пациента. Пациентом является человек, низший примат, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, собака или свинья.

Настоящее изобретение также предусматривает наборы, которые могут использоваться в способах обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови. Наборы могут содержать маркерный профиль, содержащий один или более маркеров, характерных для аллогенных клеток для терапевтических целей, и один или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, который состоит из следующего: (a) проведение анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови пациента для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека; (b) получение образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (c) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученные из ткани пуповины человека; и (d) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В качестве альтернативы способ обнаружения клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержит: (a) проведение анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (b) сравнение одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, для определения одного или более уникальных маркеров, которые отличают клетки, полученные из ткани пуповины человека, от мононуклеарных клеток периферической крови пациента; (c) получение образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (d) анализ образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более уникальных маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (e) различение мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения одного или более уникальных маркеров. Пациентом является человек, низший примат, мышь, крыса, хомяк, морская свинка, собака или свинья.

В одном варианте осуществления маркер, характерный для мононуклеарных клеток периферической крови пациента, содержит CD45, и маркер, характерный для клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержит CD10. В другом варианте осуществления маркеры для мононуклеарных клеток периферической крови пациента и клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержат один или более из CD10, CD13, NRP1, CD45, LAMP1, DKK3, NRP1 или LAMB1. В способе может использоваться множество аналитических методик, включая проточную цитометрию, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот, ПЦР и их комбинации. Одним или более уникальными маркерами, характерными для клеток, полученных из ткани пуповины человека, могут быть один или более из CD10, CD13, NRP1, LAMP1, DKK3, NRP1, LAMB1 и их комбинаций.

Способ может дополнительно содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (b). На стадии обогащения может использоваться методика магнитной сепарации. Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой набор, который может использоваться в способах обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, и содержать маркерный профиль, содержащий один или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и один или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека. Настоящее изобретение также предусматривает системы для использования со способами настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащим стадии: проведения анализа клеток, полученных из ткани пуповины человека, и мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, и одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека; получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркеров CD10 или CD13, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека, а также мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркеров CD10 или CD13, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека.

Стадия анализа может содержать анализ фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В качестве альтернативы стадия анализа может содержать анализ фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Способ может также дополнительно содержать стадию обогащения, на которой используется, например, методика магнитной сепарации, до анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, который содержит стадии: получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; удаления всей плазмы крови; анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека, а также мононуклеарных клеток периферической крови человека и клеток, полученных из ткани пуповины человека, на основании обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека. Способ может также дополнительно содержать стадию обогащения, на которой используется, например, методика магнитной сепарации, до анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови. Способ может также содержать обнаружение маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.

Клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, а также обладающими потенциалом к дифференцированию. В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и имеющими следующие характеристики: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117, а также (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы. В качестве альтернативы клетки, полученные из ткани пуповины человека, могут быть выделены из ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способными к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию и имеющими следующие характеристики: (1) экспрессия CD10, CD13, CD44, CD90 и HLA-ABC; (2) отсутствие экспрессии CD31, CD34, CD45, HLA-DR и CD117; (3) отсутствие экспрессии hTERT или теломеразы; (4) экспрессия рецептора окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулона, лиганда хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарного хемотаксического белка; и (4) экспрессия, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенных уровней интерлейкина-8 или ретикулона 1.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения является способом обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащим следующие стадии: (a) получения образца крови у пациента, которому были введены клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) анализа образца при помощи способа обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови человека, и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека; и (c) различения мононуклеарных клеток периферической крови человека и одного или более маркеров, характерных для клеток, полученных из ткани пуповины человека. В одном варианте осуществления маркером, характерным для мононуклеарных клеток периферической крови человека, является CD45, а маркером, характерным для клеток, полученных из ткани пуповины человека, является CD10. На стадии анализа могут использоваться проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ, иммуногистохимический анализ, обнаружение нуклеиновых кислот и/или ПЦР. Способ может дополнительно содержать стадию обогащения между стадиями (a) и (h). На стадии обогащения может использоваться методика магнитной сепарации.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащий следующие стадии: (a) получения образца крови, содержащего клетки, полученные из ткани пуповины человека; (b) выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/ мононуклеарных клеток периферической крови; и (c) анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD10, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.

Альтернативным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ обнаружения в крови клеток, полученных из ткани пуповины человека, содержащий стадии: получения образца крови, в котором содержатся клетки, полученные из ткани пуповины человека; выделения из образца крови фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови; удаления всей плазмы крови; и анализа фракции клеток, полученных из ткани пуповины человека/мононуклеарных клеток периферической крови при помощи проточной цитометрии для обнаружения маркера CD45, характерного для мононуклеарных клеток периферической крови, и маркера CD13, характерного для клеток, полученных из ткани пуповины человека.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут понятны после изучения следующего подробного описания и примеров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Приведенное выше краткое описание, а также приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будут более понятны при изучении вместе приложенными фигурами. Для целей иллюстрирования настоящего изобретения на фигурах представлены варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами.

На Фиг. 1 перечислены 24 образца и возраст клеточной культуры каждого образца, использованного в Исследовании 1 в Примере 1. В частности, в Таблице на Фиг. 1A перечислены 24 образца, которые были использованы в микроматричном анализе, а на схеме на Фиг. 1B показан возраст клеточной культуры для каждого из этих 24 образцов.

На Фиг. 2A показана сравнительная экспрессия гена PTPRC (CD45) в клетках, полученных из ткани пуповины человека (hUTC), и различных видах клеток крови, которые входят в состав мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека.

На Фиг. 2B показана сравнительная экспрессия гена MME (CD10) в hUTC и различных видах клеток крови, которые входят в состав мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека.

На Фиг. 2C показана сравнительная экспрессия гена ANPEP (CD13) в hUTC и различных видах клеток крови, которые входят в состав МКПК человека.

На Фиг.3 показан анализ ПЦР в реальном времени для отбора генов, экспрессия которых в hUTC превышает таковую в МКПК человека.

На Фиг. 4A показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения маркеров на поверхности клеток hUTC. В соответствии с Фиг. 4A на панелях A1, B1, C1, D1 и E1 изображены неокрашенные контрольные препараты. Панель A2 изображает CD13 и 7AAD. Панель B2 изображает CD10 и 7AAD. Панель C2 изображает NRP1 и 7AAD. Панель D2 изображает CD45 и 7AAD. Панель E2 изображает LAMP1 и 7AAD.

На Фиг. 4B показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения маркеров на клеточной поверхности МКПК человека. В соответствии с Фиг. 4B на панелях A1, B1, C1, D1 и E1 изображены неокрашенные контрольные препараты. Панель A2 изображает CD13 и 7AAD. Панель B2 изображает CD10 и 7AAD. Панель C2 изображает NRP1 и 7AAD. Панель D2 изображает CD45 и 7AAD. Панель E2 изображает LAMP1 и 7AAD.

На Фиг. 4C показаны результаты анализа проточной цитометрии для обнаружения внутренних маркеров DKK3 и LAMP1 в МКПК и hUTC.

На Фиг. 5A показано обнаружение hUTC в смеси, содержащей hUTC (в диапазоне 1500-1700 клеток/мл) и МКПК человека (1 миллион клеток/мл), в присутствии 1 мл человеческой сыворотки при помощи проточной цитометрии.

На Фиг. 5B показано обнаружение hUTC в смеси, содержащей hUTC (в диапазоне от 1700 до 110000 клеток/мл) и МКПК человека (1 миллион клеток/мл), в присутствии 1 мл человеческой сыворотки при помощи проточной цитометрии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Данная заявка посвящена способам обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей, таких как клетки-предшественники, которые циркулируют в крови пациента (например, человека). Клетки-предшественники или другие генно-инженерные клетки, которые являются компонентами продукта для клеточной терапии, разрабатываются для множества клинических показаний. Подобные клетки, такие как, например, hUTC, вводятся пациенту, например, внутривенным путем. Распределение этих клеток в кровотоке необходимо определять для проведения фармакокинетического анализа подобных клеток в качестве продукта для клеточной терапии, а также более точного определения благоприятных исходов данной терапии. Однако человеческая кровь содержит множество видов клеток крови, один или более виды которых экспрессируют одинаковые белки, которые также могут экспрессироваться клетками-предшественниками или генно-инженерными клетками. Более того, сложно разработать достаточно чувствительную аналитическую методику, которая бы позволила обнаружить малое количество этих клеток (таких как, например, hUTC) при значительном избытке клеток в крови реципиента. Поэтому обнаружение этих клеток в присутствии крови человека представляет собой проблему, для решения которой требуется достижение достаточной чувствительности и специфичности методики. Таким образом, существует потребность в аналитической методике, при помощи которой можно определить и отличить клетки-предшественники или генно-инженерные клетки от клеток крови человека.

I. Определения

Используемый в настоящем документе термин «образец» относится к любому веществу, которое содержит необходимый аналит. Образец может быть биологической жидкостью, такой как цельная кровь или компоненты цельной крови, включая эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, сыворотку и плазму, асцитическая жидкость, моча, спинно-мозговая жидкость и другие компоненты организма.

Клетки, которые могут быть определены в образце крови, содержащем мононуклеарные клетки периферической крови, при помощи способов настоящего изобретения, обычно относятся к постнатальным клеткам или клеткам, полученным после родов (PPDC). Более конкретно, данные клетки являются «клетками, полученными из пупка», «клетками, полученными из пуповины» (UDC), «клетками, полученными из ткани пуповины» (UTC) или «клетками, полученными из ткани пуповины человека» (hUTC). Кроме того, клетки могут быть описаны как являющиеся стволовыми клетками или клетками-предшественниками, причем последний термин используется в широком смысле. Термин «полученный из» используется для указания того, что клетки были получены из их биологического источника и были выращены или иным образом обработаны in vitro (например, культивированы в ростовой среде для размножения популяции и/или получения клеточной линии). Манипуляции in vitro над пуповинными стволовыми клетками и уникальные характеристики клеток, полученных из пуповины, которые составляют предмет настоящего изобретения, более подробно описаны ниже.

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяющиеся по способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться для получения клеток-потомков, включая самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцирования in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и способствовать образованию по существу большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По своему потенциалу развития стволовые клетки разделяются на: (1) тотипотентные; (2) плюрипотентные; (3) мультипотентные; (4) олигопотентные; и (5) унипотентные. Тотипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных и внеэмбриональных клеток. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток. Мультипотентные клетки содержат клетки, способные преобразовываться в подмножество клеточных линий дифференцировки, но только в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы. Например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать потомство, которое содержит ГСК (самообновление), рестриктированные олигопотентные клетки-предшественники клеток крови и все виды и элементы клеток (например, тромбоциты), представляющие собой стандартные компоненты крови. Клетки, которые являются олигопотентными, способны преобразовываться в более ограниченное подмножество клеточных линий дифференцировки, чем мультипотентные стволовые клетки. Клетки, которые являются унипотентными, способны преобразовываться в единственную клеточную линию дифференцировки (например, сперматогенные стволовые клетки).

Стволовые клетки также классифицируются на основании источника их получения. Взрослая стволовая клетка по существу представляет собой мультипотентную недифференцированную клетку, присутствующую в ткани, содержащей множество дифференцированных видов клеток. Взрослая стволовая клетка способна к самообновлению. В нормальных условиях они также могут дифференцироваться для получения специализированных типов клеток той ткани, в которой они находятся, а также, возможно, тканей других типов. Эмбриональная стволовая клетка представляет собой плюрипотентную клетку из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты. Фетальная стволовая клетка представляет собой клетку, происходящую из тканей или мембран плода. Постнатальная стволовая клетка является мультипотентной или плюрипотентной клеткой, которая по существу происходит из внеэмбриональной ткани, доступной после родов, а именно - из пуповины. Известно, что данные клетки обладают признаками, характерными для плюрипотентных стволовых клеток, включая быструю пролиферацию и потенциал дифференцирования в клетки многих клеточных линий дифференцировки. Постнатальные стволовые клетки можно получить из крови (например, клетки, полученные из пуповинной крови) или не из крови (например, из отличных от крови тканей пуповины).

Для описания клеток в культуре используются различные термины. «Культура клеток» по существу обозначает клетки, взятые из живого организма и выращенные в контролируемых условиях («в культуре» или «культивированные»). «Первичная культура клеток» обозначает культуру клеток, тканей или органов, взятых непосредственно из организма(ов) до первого пересева. Клетки «размножают» в культуре, когда их помещают в ростовую среду в условиях, облегчающих рост и/или деление клеток, что приводит к большей популяции клеток. При размножении клеток в культуре скорость пролиферации клеток иногда измеряют по количеству времени, которое необходимо клеткам для удвоения численности. Данное время называют «временем удвоения».

Термин «клеточная линия» по существу относится к популяции клеток, полученной в результате одного или более пересевов первичной клеточной культуры. Каждый цикл пересева называют пассажем. Клетки, которые пересеивают, называются клетками, которые «пассированы». Конкретная популяция клеток или клеточная линия иногда описывается или характеризуется числом выполненных с ней пассажей. Например, пассированная 10 раз культивируемая популяция клеток может описываться как культура десятого пассажа, или культура P10. Первичная культура, т.е. первая культура после выделения клеток из ткани, обозначается P0. После первого пересева клетки описываются как вторичная культура (P1, или культура первого пассажа). После второго пересева клетки превращаются в третичную культуру (P2, или культура второго пассажа) и т.п. Специалистам в данной области будет понятно, что за период пассирования популяция клеток может многократно удваиваться; следовательно, количество удвоений популяции в культуре больше номера пассажа. Степень размножения клеток (то есть число удваиваний популяции) за промежуток времени между последовательными пассированиями зависит от многих факторов, включая, помимо прочего, плотность посева, тип подложки, тип среды, условия роста и продолжительность времени между пересевами.

«Дифференцировка» представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или малоспециализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированную («коммитированную») позицию в пределах клеточной линии дифференцировки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного вида клеток или набора видов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной вид клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному виду. Термин «дедифференцировка» относится к процессу, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в клеточной линии дифференцировки. Используемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» определяет наследственность клетки, т.е. определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки.

В широком смысле, «клетка-предшественник» представляет собой клетку, которая обладает возможностью давать начало потомству, которое более дифференцировано, чем она сама, а также сохраняет возможность пополнения пула клеток-предшественников. По данному определению, сами стволовые клетки также являются прогениторными клетками, поскольку являются ближайшими предшественниками окончательно дифференцированных клеток. В отношении клеток из настоящего изобретения, которые более подробно описываются ниже, может использоваться такое широкое значение клеток-предшественников. В более узком смысле клетку-предшественника часто определяют как клетку, которая является промежуточным предшественником в процессе дифференцирования, т.е. она происходит из стволовой клетки и является промежуточным звеном в получении зрелого вида клеток или подмножества видов клеток. Клетки-предшественники данного типа по существу не способны к самообновлению. Таким образом, при отсылке к клетке этого типа в настоящем документе она будет называться «необновляющейся клеткой-предшественником» или «промежуточной клеткой-предшественником».

В целом, «трофический фактор» определяют как вещество, способствующее выживанию, росту, пролиферации, и/или созреванию клетки, или стимулирующее повышенную активность клетки.

Используемый в настоящем документе термин «стандартные условия роста» относится к культивированию клеток при 37°C в стандартной атмосфере, содержащей 5% CO2, и поддержании относительной влажности около 100%. Хотя описанные выше условия можно использовать при культивировании клеток, следует понимать, что специалист в данной области, принимая во внимание возможности культивирования клеток, известные в данной области, вполне может варьировать такие условия.

Используемый в настоящем документе термин «выделенная» по существу относится к клетке, которая была отделена от ее естественной среды. Данный термин содержит грубое физическое отделение от естественной среды, например, путем удаления у животного-донора. В предпочтительных вариантах осуществления выделенная клетка не находится в ткани, т.е. клетка отделена или разобщена с соседними клетками, с которыми она контактирует в нормальных условиях. Предпочтительно, чтобы клетки вводились в виде клеточной суспензии. Используемый в настоящем документе термин «клеточная суспензия» содержит клетки, которые контактируют со средой и были разобщены, например, путем осторожного измельчения фрагмента ткани.

Используемый в настоящем документе термин мононуклеарная клетка периферической крови («МКПК») относится к любой клетке крови, которая имеет круглое ядро. Примерные мононуклеарные клетки периферической крови неограниченно содержат лимфоциты, моноциты и макрофаги.

II. Способы обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови пациента

Данная заявка предусматривает способы обнаружения аллогенных клеток для терапевтических целей в образце крови пациента после введения этих клеток пациенту. Способы содержат стадии (a) получения образца крови у пациента, который прошел терапию аллогенными клетками; (b) анализа образца при помощи аналитической методики обнаружения одного или более маркеров, характерных для мононуклеарных клеток периферической крови пациента («МКПК») (например, любой клетки кр