Новое антитело к cxcr4 и его применение для выявления и диагностики рака

Новое антитело к cxcr4 и его применение для выявления и диагностики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования и/или диагностики и/или мониторинга терапии пролиферативных заболеваний у пациента. Конкретнее, изобретение относится к антителу, способному к специфическому связыванию с CXCR4, как к аминокислотной последовательности, так и к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело. Аналогичным образом, изобретение включает в себя применение указанного антитела и соответствующие способы выявления и диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных нарушений, связанных с гиперэкспрессией CXCR4. В определенных вариантах осуществления изобретения, нарушения представляют собой онкогенные нарушения, связанные с повышенной по сравнению с нормой экспрессией CXCR4, или любую другую патологию, связанную с гиперэкспрессией CXCR4. Изобретение, наконец, включает продукты, и/или композиции, или наборы, включающие по меньшей мере такое антитело для прогнозирования, или диагностики, или мониторинга терапии определенных раков.

Хемокины представляют собой небольшие секретируемые пептиды, которые контролируют миграцию лейкоцитов по химическому градиенту лиганда, известному как хемокиновый градиент, особенно в ходе иммунных реакций (Zlotnick А. и соавт., 2000). Они разделяются на два больших подсемейства, СС и СХС, на основании положения их NH₂-концевых цистеиновых остатков, и связываются с рецепторами, сопряженными с G-белком, два больших подсемейства которых называются CCR и CXCR. К настоящему времени открыто более 50 хемокинов человека и 18 хемокиновых рецепторов.

Многие раки имеют сложную хемокиновую сеть, которая влияет как на инфильтрацию опухоли иммунными клетками, так и на рост опухолевых клеток, выживаемость, миграцию и ангиогенез. Иммунные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки сами по себе экспрессируют хемокиновые рецепторы и могут отвечать на градиент хемокинов. Исследования биоптатов человеческого рака и мышиных моделей рака показывают, что экспрессия хемокиновых рецепторов раковыми клетками связана с повышением способности к метастазированию. Злокачественные клетки раков различных типов имеют различные профили экспрессии хемокиновых рецепторов, однако хемокиновый рецептор 4 является наиболее часто обнаруживаемым. Рецептор CXCR4 экспрессируют клетки 23 различных типов раков человека эпителиального, мезентериального и гемопоэтического происхождения (Balkwill Р. и соавт., 2004).

Хемокиновый рецептор 4 (также известный как фузин, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в двух изоформах, включающих 352 или 360 аминокислот. Изоформа А имеет аминокислотную последовательность, описанную под номером доступа Genbank NP_001008540, тогда как изоформа В имеет аминокислотную последовательность, описанную под номером доступа Genbank NP_003458. Остаток Asn¹¹ является гликозилированным, остаток Tyr²¹ является модифицированным путем добавления сульфатной группы и Cys¹⁰⁹ и Cys¹⁸⁶ представляют собой связь (дисульфидный мостик) с экстрацеллюлярной частью рецептора (Juarez J. и соавт., 2004). Данный рецептор экспрессируется различными видами нормальных тканей, наивными, не имеющими памяти Т-клетками, регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендроцитами, N-киллерами, CD34⁺-гемопоэтическими стволовыми клетками и, в меньших количествах, - в сердце, толстой кишке, печени, почках и головном мозге. CXCR4 играет ключевую роль в миграции лейкоцитов, В-клеточном лимфопоэзе и миелопоэзе.

Рецептор CXCR4 гиперэкспрессируется в большом числе раков, включая (без ограничения) лимфому, лейкемию, множественную миелому, рак толстой кишки (Ottaiano А. и соавт., 2004), рак груди (Kato М. и соавт., 2003), рак предстательной железы (Sun Y.X. и соавт., 2003), рак легких [мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома (Phillips R.J. и соавт., 2003)], рак яичника (Scotton C.J. и соавт., 2002), рак поджелудочной железы (Koshiba Т. и соавт., 2000), рак почек, рак головного мозга (Barbero S. и соавт., 2002), глиобластомы и лимфомы. Уникальный лиганд рецептора CXCR4, описанный к настоящему времени, представляет собой фактор стромальных клеток-1 (SDF-1) или CXCL12. SDF-1 секретируется в больших количествах в лимфоузлах, костном мозге, печени, легких и, в меньших количествах, в почках, головном мозге и в коже. CXCR4 также распознается антагонистическим хемокином, вирусным макрофагальным воспалительным белком II (vMIP-II), кодируемым человеческим вирусом герпеса III типа.

Ось CXCR4/SDF-1 играет ключевую роль в раке и непосредственно влечет за собой миграцию и инвазию, приводящие к метастазам. Действительно, раковые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, мигрируют и поступают в системный кровоток. Затем раковые клетки задерживаются в сосудистом ложе органов, продуцирующих высокие уровни SDF-1, где они пролиферируют, индуцируют ангиогенез и образуют метастатические опухоли (Murphy PM., 2001). Эта ось также участвует в клеточной пролиферации через активацию киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (Barbero S. и соавт., 2003), и в ангиогенезе (Romagnani P., 2004). Действительно, рецептор CXCR4 и его лиганд SDF-1 отчетливо стимулируют экспрессию VEGF-A, который, в свою очередь, усиливает экспрессию CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. и соавт., 2002). Также известно, что опухоль-связанные макрофаги (ТАМ) аккумулируются в гипоксических областях опухоли и стимулируются к взаимодействию с опухолевыми клетками, что стимулирует ангиогенез. Обнаружили, что гипоксия активировала селективную экспрессию CXCR4 в различных типах клеток, включая опухоль-связанные макрофаги (Mantovani А. и соавт., 2004). Недавно продемонстрировали, что ось CXCR4/SDF-1 регулирует миграцию и хоуминг CXCR4⁺-гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSC) и может играть роль в неоваскуляризации. Фактические данные показывают, что, помимо гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, функциональный CXCR4 также экспрессируется в стволовых клетках из других тканей (тканевые стволовые клетки, TCSC), таким образом, SDF-1 может играть решающую роль в хемоаттракции CXCR4-позитивных тканевых стволовых клеток, необходимых для регенерации органов/тканей, однако эти тканевые стволовые клетки также могут быть исходной точкой развития рака (теория раковых стволовых клеток). Происхождение рака из стволовых клеток продемонстрировали для человеческой лейкемии и недавно для некоторых солидных опухолей, таких как опухоли головного мозга и груди. Есть несколько примеров позитивных по CXCR4 опухолей, которые могут происходить из нормальных CXCR4-позитивных ткане- или органоспецифичных стволовых клеток, такие как лейкемии, опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак груди, гепатобластома, рак яичника и рак шейки матки (Kucia М. и соавт., 2005).

Направленное действие на раковые метастазы путем блокирования рецепторов CXCR4 было продемонстрировано in vivo с применением моноклональных антител, направленных против рецептора CXCR4 (Muller А. и соавт., 2001). Коротко говоря, показали, что моноклональное антитело, направленное против рецептора CXCR4 (Mab 173 R&D Systems), существенно уменьшало число метастазов в лимфатические узлы в ортотопической модели рака груди (MDA-MB231) у мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью. Другое исследование (Phillips R.J и соавт., 2003) также показало критическую роль оси SDF-1/CXCR4 в метастазах на ортотопической модели карциномы легких (А549) с применением поликлональных антител против SDF-1, однако в этом исследовании не проявлялся ни эффект опухолевого роста, ни ангиогенез. Некоторые другие исследования также описывают ингибирование как метастазирования in vivo с применением миРНК-дуплексов CXCR4 (Liang Z. и соавт., 2005), биостабильных пептидных антагонистов CXCR4 (Tamamura H. и соавт., 2003), так и опухолевого роста in vivo с применением малых молекул-антагонистов CXCR4, таких как AMD 3100 (Rubin J.B. и соавт., 2003; De Faico V. и соавт., 2007) или моноклональных антител (патент WO 2004/059285 A2). Таким образом, CXCR4 представляет собой признанную терапевтическую мишень для рака.

Хемокиновый рецептор 2 (CXCR2), другой хемокиновый рецептор, также описан как целевая мишень в онкологии. Действительно, CXCR2 передает аутокринный сигнал клеточного роста в некоторых типах опухолевых клеток, а также может действовать на рост опухоли опосредованно, стимулируя ангиогенез (Tanaka Т. и соавт., 2005).

Хемокиновый рецептор CXCR2 содержит 360 аминокислот. Он экспрессируется преимущественно в эндотелиальных клетках и особенно при неоваскуляризации. Несколько хемокинов связывают рецептор CXCR2, а именно, CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α, -β и γ. которые принадлежат к ERL⁺-проангиогенным хемокинам. Рецептор CXCR2 обладает гомологией последовательности с рецептором CXCR4 (37% идентичность последовательности и 48% гомология последовательности). Ось CXCR2/лиганды вовлечена в некоторые механизмы опухолевого роста, такие как метастазирование (Singh RK. и соавт., 199), клеточная пролиферация (Owen J.D. и соавт., 1997) и ERL⁺-хемокин-опосредованный ангиогенез (Stricter R.M. и соавт., 2004; Romagnani и соавт., 2004). Наконец, опухоль-связанные макрофаги и нейтрофилы являются ключевыми элементами индуцированного воспалением опухолевого роста, а хемокины, такие как CXCL5, интерлейкин-8 и GRO-α, инициируют рекрутинг нейтрофилов.

Димеризация стала универсальным механизмом регуляции функции рецепторов, сопряженных с G-белком, к которым относятся хемокиновые рецепторы (Wang J. и Norcross M., 2008). Гомо- и гетеродимеризация в ответ на связывание хемокинов, как было показано, требуются для инициации и изменения передачи сигналов многими хемокиновыми рецепторами. Растущее число фактов подтверждает гипотезу о том, что димеры или олигомеры рецепторов, возможно, являются основной функциональной единицей хемокиновых рецепторов. Димеры хемокиновых рецепторов, как обнаружили, свободны от лигандов, и хемокины индуцируют конформационные изменения димеров рецепторов. Как известно, CXCR4 образует гомодимеры, но также и гетеродимеры, например, с 5-опиоидным рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) или с CCR2 (Percherancier Y. и соавт., 2005). В последнем примере пептиды, являющиеся производными трансмембранных доменов CXCR4, ингибировали активацию, блокируя лиганд-индуцированные конформационные переходы димеров (Percherancier Y. и соавт., 2005). Другое исследование показало, что пептид CXCR4-TM4, синтетический пептид трансмембранного региона CXCR4, уменьшает энергию перехода между промоторами гомодимеров CXCR4 и ингибирует SDF-1-индуцированную миграцию и полимеризацию актина в злокачественных клетках (Wang J. и соавт., 2006). Совсем недавно также было описано, что CXCR7 образует функциональные гетеродимеры с CXCR4 и усиливает SDF-1-индуцированную передачу сигналов (Sierro F. и соавт., 2007). Другие примеры конститутивных гетеродимеров включают исследования, показывающие, что CXCR1 и CXCR2 взаимодействуют, также образуя соответствующие гомодимеры. Ни для одного из них не было отмечено взаимодействия с другим GPCR (α1А-адренорецептор), что показывает специфичность взаимодействия CXCR1 и CXCR2 (Wilson S. и соавт., 2005).

Как указывалось ранее, рецепторы CXCR4 и CXCR2 представляют собой интересные опухолевые мишени. Блокирование этих рецепторов позволяет ингибировать рост опухоли и метастазирование очень эффективным образом, с уменьшением пролиферации опухолевых клеток, ангиогенеза, миграции и инвазии опухолевых клеток, рекрутинга нейтрофилов и макрофагов опухолями и с ингибированием CXCR4-позитивных раковых стволовых клеток.

Заявитель уже раскрывал моноклональные антитела, обозначаемые как 515H7 и 414Н5, которые связывают и индуцируют конформационные изменения как гомодимеров CXCR4/CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2 и обладают высокой противоопухолевой активностью (см. WO 2010/037831).

Настоящее изобретение ставит своей целью обеспечить по меньшей мере один реагент, который может применяться как диагностический и прогностический инструмент для выявления и/или мониторинга онкогенных нарушений, особенно тех, которые отличаются экспрессией CXCR4 или опосредованы аномальной экспрессией CXCR4. В особенности изобретение обеспечивает новое выделенное антитело, способное к связыванию с CXCR4, которое может применяться для диагностических или прогностических целей.

Неожиданно, в отличие от антител из предшествующего уровня техники, заявитель синтезировал настоящее антитело, способное специфически связываться с CXCR4, экспрессируемым как мономер CXCR4 или как гомодимер CXCR4/CXCR4. С другой стороны, антитело согласно изобретению существенно не связывается с каким-либо из известных гетеродимеров CXCR4/X и, конкретнее, не связывается, в частности, с гетеродимером CXCR4/CXCR2. Как будет обсуждаться ниже в настоящем описании, это свойство представляет большой интерес для целей диагностики. Другие особенности и преимущества изобретения будут видны из подробного описания и примеров, которые приводятся ниже.

В первом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, или производному, которые с высокой аффинностью связываются с CXCR4, предпочтительно, с человеческим CXCR4, и таким образом могут быть полезны для диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных нарушений, опосредованных экспрессией CXCR4.

Другие особенности и преимущества изобретения будут видны из подробного описания и примеров, которые приводятся ниже.

Предпочтительно, изобретение включает антитела, их производные соединения и их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению, полученные геннорекомбинантным способом или путем химического синтеза.

В первом варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело.

Под "моноклональным антителом" понимают антитело, происходящее из практически однородной популяции антител. Конкретнее, индивидуальные антитела в популяции являются идентичными, за исключением некоторых возможных природных мутаций, которые могут обнаруживаться в минимальных пропорциях. Иными словами, моноклональные антитела включают в себя однородные антитела, возникающие в результате размножения одного клона клеток (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, и. т.д.), и в целом отличаются тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высоко специфичными и направленными против одного антигена. Вдобавок, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые, в типичном случае, включают различные антитела против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное тело направлено против одного эпитопа антигена. Типичное антитело IgG образовано двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями, которые соединены с помощью дисульфидных связей. Каждая тяжелая и легкая цепь содержат константный регион и вариабельный регион. Каждый вариабельный регион содержит три сегмента, называющиеся "регионы, определяющие комплементарность" ("CDRs") или "гипервариабельные регионы", которые в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Они обычно обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3 (нумеруются последовательно с N-конца). Более высоко консервативные части вариабельных регионов называются "каркасные области".

Существуют три региона, определяющих комплементарность тяжелой цепи и три региона, определяющих комплементарность легкой цепи. Термин "регион, определяющий комплементарность" или "регионы, определяющие комплементарность" используется здесь с целью указать, в зависимости от случая, один, или несколько, или даже все эти регионы, которые содержат большую часть аминокислотных остатков, ответственных за связывание аффинностью антитела с антигеном или эпитопом, которые оно распознает.

Согласно изобретению, регионы, определяющие комплементарность антитела, определяют согласно нумерации IMGT. Для человека, квалифицированного в данной области, очевидно, как вывести из определяющих комплементарность регионов по IMGT определяющие комплементарность регионы согласно Кэбботу. Определяющие комплементарность регионы согласно Кэбботу должны рассматриваться как часть объема изобретения.

Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов вне зависимости от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, С., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одну и ту же позицию, например, цистеин - 23 (1-й Cys), триптофан - 41 (консервативный Trp), гидрофобная аминокислота - 89, цистеин - 104 (2-й Cys), фенилаланин или триптофан - 118 (J-Phe или J-Trp). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизованное разграничение каркасных регионов (FR1-IMGT: позиции с 1 по 26, FR2-IMGT: с 39 по 55, FR3-IMGT: с 66 по 104 и FR4-IMGT: с 118 по 128) и регионов, определяющих комплементарность (CDR1-IMGT: с 27 по 38, CDR2-IMGT: с 56 по 65 и CDR3-IMGT: с 105 по 117). Поскольку разрывы [гэпы] представляют собой незанятые позиции, длина регионов, определяющих комплементарность по IMGT (показанная в квадратных скобках и разделенная точками, например, [8.8.13]), становится ключевой информацией. Уникальная нумерация IMGT применяется в двухмерных графических представлениях, называемых "жемчужные нити" [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в трехмерных структурах IMGT/базах данных трехмерных структур [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Т cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность (CDR), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs. 1-6, или по меньшей мере один CDR, последовательность которого после оптимального выравнивания имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность последовательностям SEQ ID NOs 1-6.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению включает: i) тяжелую цепь, включающую по меньшей мере один из следующих: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как определено согласно нумерационной системе IMGT, где CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2 и CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3; и/или ii) легкую цепь, включающую по меньшей мере один из следующих: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как определено согласно нумерационной системе IMGT, где CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5 и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2 и CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5 и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его функциональный фрагмент или производное включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его функциональный фрамент или производное включает легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где: CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания; CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, антитело, или его функциональный фрагмент, или производное включают: тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность последовательностям SEQ ID Nos. 1, 2 или 3, соответственно (после оптимального выравнивания),

и легкую цепь, включающую три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности последовательностям SEQ ID Nos. 4, 5 или 6, соответственно. В смысле настоящего изобретения, "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает, что процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученными после оптимального выравнивания, является исключительно статистическим, и различия между двумя последовательностями распределены случайным образом по их длине. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или двух аминокислотных последовательностей традиционно выполняется сравнением последовательностей после их оптимального выравнивания, где указанное сравнение выполняется посегментно или с использованием "окна выравнивания". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено, в дополнение к сравнению вручную, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Ниддлмана и Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 4:443], с помощью метода поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или с помощью компьютерного программного обеспечения, использующего такие алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения, разработанного Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или с помощью программного обеспечения для сравнения последовательностей BLAST NR или BLAST Р).

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, в которых последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, подлежащая сравнению, может иметь добавления или делеции по сравнению с референтной последовательностью для оптимального выравнивания между двумя последовательностями. Процент идентичности вычисляется определением числа позиций, в которых аминокислотные или нуклеотидные остатки в двух последовательностях идентичны, делением числа идентичных позиций на общее число позиций в окне выравнивания и умножением результата на 100, чтобы получить идентичность между двумя последовательностями, выраженную в процентах. Например, программа BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova и соавт., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250) доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, может использоваться с параметрами, заданными по умолчанию (особенно для параметеров: "штраф за открытие делеции": 5 и "штраф за расширение/продолжение делеции": 2; выбранная матрица (являющаяся, например, матрицей "BLOSUM 62", предложенная программой); выраженная в процентах идентичность между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, вычисляется непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, проявляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность с референтной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают те, что содержат референтную последовательность, определенные модификации, особенно делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или расширение. В случае замены одной или нескольких последовательных или непоследовательных аминокислот предпочтительными являются те замены, в которых заменяемые аминокислоты заменяются "эквивалентными" аминокислотами. Здесь выражение "эквивалентные аминокислоты" предназначено для указания любых аминокислот, которые, вероятно, могут быть замещены одной из структурных аминокислот, однако без модификации биологической активности соответствующих антител, и из которых определенные примеры приведены ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены и через их структурную гомологию с аминокислотами, которые они заменяют, через результаты сравнительных испытаний биологической активности различными антителами, которые, вероятно, будут получены. В качестве неограничивающего примера, таблица 1 ниже суммирует возможные замены, которые, вероятно, осуществляются без результирующих существенных изменений биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Таблица 1:
Оригинальный остаток:	Замена(ы):
Ala (А)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (С)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
Ile (I)	Leu
Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

Как известно тем, кто квалифицирован в данной области, наибольшая вариабельность (длина и состав) среди шести регионов, определяющих комплементарность, обнаружена в трех регионах, определяющих комплементарность тяжелой цепи и, конкретнее, в CDR-H3 этой тяжелой цепи.

В частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к мышиному антителу, или к его производным соединениям или функциональным фрагментам.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение раскрывает антитело, а также его антигенсвязывающие фрагменты и производные, где указанное антитело включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, основанные на определении регионов, определяющих комплементарность, по IGMT: CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 1 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания; CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 2 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 3 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания, и легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность: CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 4 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания; CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 5 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и

CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 6 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, изобретение относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или производному, включающему: i) тяжелую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и ii) легкую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное выбраны из:

a) антитела с тяжелой цепью, включающей три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-Н3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3, и с вариабельным доменом легкой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 8;

b) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и с легкой цепью, включающей следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; и

c) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и с вариабельным доменом легкой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 8.

Согласно еще одному другому варианту осуществления изобретения, изобретение относится к антителу 427аВ1 или к одному из его антигенсвязывающих фрагментов или производных, где указанное антитело включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7 или последовательность, по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 7 после оптимального выравнивания; и/или отличающемуся тем, что оно включает последовательность вариабельного домена легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 8 или последовательность, по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 8 после оптимального выравнивания.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, изобретение предоставляет антитело 427аВ1, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, где указанное антитело 427аВ1 включает:

a) тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает:

- следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-Н3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID No. 8, и

- вариабельный домен тяжелой цепи, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 7; и

b) легкую цепь, где указанная легкая цепь включает:

- следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; и

- вариабельный домен легкой цепи, где указанный вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 8.

Изобретение также относится к любому соединению, являющемуся производным антитела, как описано в изобретении. "Антигенсвязывающее производное" или "производное" антитела означает, в частности, антитело, образованное пептидным каркасом и по меньшей мере одним из регионов, определяющих комплементарность оригинального антитела, с целью сохранить его способность быть распознаваемым. Такие производные соединения хорошо известны лицу, квалифицированному в данной области.

В частности, антитело по изобретению, его производное соединение или антигенсвязывающий фрагмент отличаются тем, что указанное производное соединение состоит из связывающего белка, включающего пептидный каркас, на который привит по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность, где указанный регион, определяющий комплементарность, привит таким образом, чтобы сохранить, полностью или частично, свойства распознавания паратопа исходного антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный антигенсвязывающий белок представляет собой белок слияния пептидного каркаса и по меньшей мере одного из указанных регионов, определяющих комплементарность.

Одна или несколько последовательностей из шести последовательностей регионов, определяющих комплементарность, описанных в настоящем изобретении, может быть также представлена в различных иммуноглобулиновых белковых каркасах. В этом случае белковая последовательность позволяет воссоздать пептидный скелет, подходящий для корректного фолдинга привитых регионов, определяющих комплементарность, что позволяет их паратопам сохранить антигенраспознающие свойства.

Лицо, квалифицированное в данной области, осведомлено о способах выбора типа белкового каркаса для прививки CDR. Конкретнее, известно, что для того, чтобы быть выбранными, такие каркасы должны удовлетворять как можно большему числу критериев (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187):

- удовлетворительный филогенетический консерватизм;

- известная трехмерная структура (определенная, например, кристаллографически, ЯМР-спектроскопически или с помощью любых других техник, известных лицу, квалифицированному в данной области); малый размер, малое число или отсутствие посттранскрипционных модификаций; и/или

- простота получения, экспрессии и очистки.

Наконец, как описано выше, такие пептидные каркасы включают от одного до шести регионов, определяющих комплементарность, из оригинального антитела. Предпочтительно, но не обязательно, лицо, квалифицированное в данной области, выберет по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность, из тяжелой цепи - как известно, она в первую очередь ответственна за специфичность антитела. Выбор одного или более регионов, определяющих комплементарность, является очевидным для лица, квалифицированного в данной области, которое затем выберет подходящие известные техники (Bes и соавт., FE