Химерные гены ospa, белки и способы их применения

Химерные гены ospa, белки и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение в общем относится к химерным полипептидам OspA, нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, композициям, содержащим такие молекулы, и способам их применения.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лаймская болезнь представляет собой переносимую клещами болезнь, вызываемую Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). Болезнь типично характеризуется появлением распространяющейся красной сыпи на месте укуса клеща, за которой могут последовать системные осложнения, включая менингит, кардит или артрит. Почти все случаи лаймской болезни вызываются одним из трех геновидов - Borrelia afzelii, Borrelia garinii и Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.). В Европе обнаружены все три вида, инфицирующие людей. Однако в Северной Америке найден только один вид - Borrelia burgdorferi sensu stricto. Borrelia burgdorferi представляет собой вид грамотрицательных бактерий класса спирохет рода Borrelia. Лечение лаймской болезни антибиотиками обычно является эффективным, но у некоторых пациентов развивается хроническая инвалидизирующая форма болезни, затрагивающая суставы или нервную систему, существенно не улучшающаяся даже после терапии парентеральными антибиотиками, что указывает на потребность в вакцине для популяций с высокой степенью риска.

Внешний поверхностный белок A (OspA) представляет собой 31-кДа антиген, экспрессируемый видом Borrelia burgdorferi s.l., присутствующим в средней кишке иксодовых клещей. Была продемонстрирована эффективность OspA для профилактики лаймской болезни в Северной Америке (Steere et al., N. Engl. J. Med. 339: 209-15,1998; Sigal et al., N. Engl. J. Med. 339:216-22, 1998; erratum in: N. Engl. J. Med. 339:571, 1998). Амино-конец полностью процессированного OspA представляет собой цистеиновый остаток, который посттрансляционно модифицируется тремя жирными ацильными цепями, закрепляющими белок на внешней поверхности бактериальной мембраны (Bouchon et al., Anal. Biochem. 246: 52-61, 1997). Сообщается, что липидирование OspA стабилизирует молекулу (Luft, личное сообщение) и является существенным для защиты в отсутствие сильного адъюванта (Erdile et al., Infect. Immun. 61: 81-90, 1993). Растворимая рекомбинантная форма белка, не имеющая амино-концевого липидного мембраносвязывающего фрагмента, была со-кристаллизована с фрагментом Fab агглютинирующего мышиного моноклонального антитела для определения структуры OspA, который, как было продемонстрировано, содержит 21 антипараллельную β-нить с последующей одной α-спиралью (Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3584-9, 1997).

Моновалентная вакцина на основе OspA (LYMErix^®) для профилактики лаймской болезни выпущена в продажу в США. Однако, в Европе гетерогенность последовательностей OspA у трех геновидов препятствует широкой защите вакциной на основе OspA от одного штамма (Gern et al., Vaccine 15:1551-7, 1997). В европейских изолятах были определены семь основных серотипов OspA (обозначенных как серотипы 1-7, Wilske et al., J. Clin. Microbiol. 31:340-50, 1993). Серотипы OspA коррелируют с видами; серотип 1 соответствует B. burgdorferi s.s., серотип 2 соответствует B. afzelii, и серотипы 3-7 соответствуют B. garinii.

Защитный иммунитет, приобретенный в результате иммунизации с помощью OspA, является исключительным, поскольку взаимодействие между иммунным ответом хозяина и патогеном происходит не в хозяине, а в средней кишке клеща-переносчика. В случае лаймской болезни, клещ выступает в роли переносчика или носителя при передаче лаймской болезни от животных людям. OspA-специфическое антитело, приобретенное во время кормления инфицированного клеща, препятствует переносу B. burgdorferi s.l. иммунизированному млекопитающему-хозяину (de Silva et al., J. Exp. Med. 183: 271-5, 1996). Защита является антитело-медиируемой и преимущественно обеспечивается бактерицидным антителом, хотя антитело, блокирующее прикрепление спирохеты к рецептору выстилки кишечного эпителия клеща, также может быть эффективным (Pal et al., J. Immunol. 166: 7398-403, 2001).

Рациональная разработка эффективных вакцин OspA требует идентификации защитных эпитопов, таких как определяемых защитным моноклональным антителом LA-2 (Golde et al., Infect. Immun. 65: 882-9, 1997). Анализ способами рентгеновской кристаллографии и ЯМР был использован для идентификации иммунологически важных гипервариабельных доменов OspA и локализации эпитопа LA-2 путем картирования на аминокислотах 203-257 (Ding et al., J. Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000; Luft et al. J Infect Dis. 185 (Suppl. 1): S46-51, 2002).

В данной области техники существует потребность в разработке вакцины OspA, обеспечивающей широкую защиту против различных видов Borrelia, встречающихся в США, Европе и других регионах. Приведенное далее описание содержит характеристики такой вакцины.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение направлено на удовлетворение одной или более потребностей в данной области техники, касающихся профилактики и лечения лаймской болезни или лайм-боррелиоза.

Изобретение включает химерный полипептид, содержащий первый полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 3 Borrelia garinii и второй полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 5 Borrelia garinii, обладающий способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 3 и белка OspA серотипа 5. В некоторых аспектах, химерный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 5 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 3. В других аспектах, химерный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 3 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 5. В определенных аспектах, химерный полипептид дополнительно содержит N-концевой полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia, причем полипептидный фрагмент OspB содержит лидерную последовательность OspB. В конкретных аспектах, химерный полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 173. В различных аспектах, химерный полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173. В других аспектах, химерный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 173.

Изобретение включает композиции, содержащие химерный полипептид по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах, такие композиции дополнительно содержат дополнительный полипептид внешнего поверхностного белка A (OspA) Borrelia. В некоторых аспектах, такие композиции дополнительно содержат дополнительный полипептид внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia, причем полипептидный фрагмент OspB содержит лидерную последовательность OspB. В различных аспектах, Borrelia представляет собой Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia japonica, Borrelia andersonii, Borrelia bissettii, Borrelia sinica, Borrelia turdi, Borrelia tanukii, Borrelia valaisiana, Borrelia lusitaniae, Borrelia spielmanii, Borrelia miyamotoi или Borrelia lonestar.

В некоторых аспектах, дополнительный полипептид представляет собой химерный полипептид, содержащий первый полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 4 Borrelia garinii и второй полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 6 Borrelia garinii, обладающий способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 4 и белка OspA серотипа 6. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 6 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 4. В других аспектах, дополнительный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 4 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 6. В определенных аспектах, дополнительный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 171. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171. В дополнительных аспектах, дополнительный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 171.

В некоторых аспектах, дополнительный полипептид представляет собой химерный полипептид, содержащий первый полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 1 Borrelia burgdorferi sensu stricto и второй полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 2 Borrelia afzelii, обладающий способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 1 и белка OspA серотипа 2. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 1 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 2. В других аспектах, дополнительный полипептид содержит N-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 2 и C-концевой полипептидный фрагмент белка OspA серотипа 1. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид дополнительно содержит N-концевой полипептидный фрагмент внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia, причем полипептидный фрагмент OspB содержит лидерную последовательность OspB. В определенных аспектах, дополнительный полипептид содержит аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере 200 аминокислотных остатков, с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 169. В конкретных аспектах, дополнительный полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169. В дополнительных аспектах, дополнительный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 169.

Изобретение включает композиции, содержащие по меньшей мере три химерных полипептида OspA, причем полипептиды имеют разные последовательности. В некоторых аспектах, химерные полипептиды OspA индивидуально содержат аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 169, 171 и 173. В других аспектах, химерные полипептиды OspA индуцируют иммунный ответ против по меньшей мере белков OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

Изобретение включает молекулу химерной нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 3 Borrelia garinii и второй фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области белка OspA серотипа 5 Borrelia garinii, причем молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, обладает способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 3 и белка OspA серотипа 5. В некоторых аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 5 и 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 3. В других аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 5 и 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 3. В различных аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 5’-концевой фрагмент нуклеотидной последовательности внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia, причем фрагмент нуклеотидной последовательности OspB содержит лидерную последовательность OspB. В определенных аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности с по меньшей мере примерно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, приведенной в SEQ ID NO: 172; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В других аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с по меньшей мере примерно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 173; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В конкретных аспектах изобретения, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173, причем полипептид содержит замещение от одной до 25 консервативных аминокислот; (б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173, причем полипептид содержит инсерцию от одной до 25 консервативных аминокислот; (в) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173, причем полипептид содержит внутреннюю делецию от одной до 25 консервативных аминокислот; (г) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173, причем полипептид содержит C- и/или N-терминальное усечение от одной до 25 аминокислот; (д) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 173, причем полипептид содержит модификацию от одной до 25 аминокислот, выбранную из аминокислотных замещений, аминокислотных инсерций, аминокислотных делеций, C-терминального усечения, или N-терминального усечения; и (е) нуклеотидной последовательности, комплементарной к любой из (а)-(д). В различных аспектах, такие замещения, инсерции, делеции или модификации находятся в любых из положений аминокислотных остатков 1-4, 6, 8, 9, 11, 16, 18, 20-28, 47, 49, 50, 81, 82, 83, 100, 139, 155, 160, 176, 189, 190 и 250 SEQ ID NO: 173. В некоторых аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 172. В других аспектах, молекула химерной нуклеиновой кислоты состоит из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 172.

Изобретение включает векторы, клетки-хозяева и способы получения полипептидов путем культивации клеток-хозяев, описанных тут. В некоторых аспектах, изобретение включает вектор, содержащий любые молекулы нуклеиновой кислоты, описанные тут. В других аспектах, изобретение включает клетку-хозяина, которая содержит такие векторы. В некоторых аспектах, клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В других аспектах, клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В различных аспектах, способ получения полипептида включает культивацию клеток-хозяев, описанных тут, в условиях, пригодных для экспрессии полипептида и, необязательно, выделение полипептида из культуры. В различных аспектах, изобретение включает композиции, содержащие любые из таких химерных молекул нуклеиновой кислоты или любые векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель или носители.

Как описано выше, изобретение включает композицию, содержащую молекулу химерной нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 3 Borrelia garinii и второй фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области белка OspA серотипа 5 Borrelia garinii, причем молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, обладает способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 3 и белка OspA серотипа 5. В некоторых аспектах, композиция дополнительно содержит дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внешний поверхностный белок A (OspA) Borrelia. В других аспектах, композиция дополнительно содержит дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую внешний поверхностный белок B (OspB) Borrelia. В конкретных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит 5’-концевой фрагмент нуклеотидной последовательности внешнего поверхностного белка B (OspB) Borrelia, причем фрагмент нуклеотидной последовательности OspB содержит лидерную последовательность OspB. В различных аспектах, Borrelia представляет собой Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia japonica, Borrelia andersonii, Borrelia bissettii, Borrelia sinica, Borrelia turdi, Borrelia tanukii, Borrelia valaisiana, Borrelia lusitaniae, Borrelia spielmanii, Borrelia miyamotoi или Borrelia lonestar.

В некоторых аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 6 Borrelia garinii и второй фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области белка OspA серотипа 4 Borrelia garinii, причем молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, обладает способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 6 и белка OspA серотипа 4. В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 6 и 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 4. В различных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент белка OspA серотипа 4, и 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент белка OspA серотипа 6. В некоторых аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 170; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В конкретных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171, причем полипептид содержит замещение от одной до 25 консервативных аминокислот; (б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171, причем полипептид содержит инсерцию от одной до 25 консервативных аминокислот; (в) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171, причем полипептид содержит внутреннюю делецию от одной до 25 консервативных аминокислот; (г) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171, причем полипептид содержит C- и/или N-терминальное усечение от одной до 25 аминокислот; (д) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 171, причем полипептид содержит модификацию от одной до 25 аминокислот, выбранную из аминокислотных замещений, аминокислотных инсерций, аминокислотных делеций, C-терминального усечения, или N-терминального усечения; и (е) нуклеотидной последовательности, комплементарной к любой из (а)-(д). В различных аспектах, замещения, инсерции, делеции или модификации находятся в любых из положений аминокислотных остатков 1-4, 6, 8, 9, 11, 16, 18, 20-28, 47, 49, 50, 81, 82, 83, 100, 139, 155, 160, 176, 189, 190 и 250 SEQ ID NO: 171. В некоторых аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 170. В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты состоит из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 170.

В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 1 Borrelia burgdorferi sensu stricto и второй фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области белка OspA серотипа 2 Borrelia afzelii, причем молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, обладает способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 1 и белка OspA серотипа 2. В определенных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 1 и 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 2. В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит 5’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 2 и 3’-концевую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент кодирующей области белка OspA серотипа 1. В различных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 168; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В дополнительных аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с по меньшей мере или приблизительно 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентами идентичности последовательности с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169; и (б) нуклеотидной последовательности, комплементарной к (а). В некоторых аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169, причем полипептид содержит замещение от одной до 25 консервативных аминокислот; (б) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169, причем полипептид содержит инсерцию от одной до 25 консервативных аминокислот; (в) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169, причем полипептид содержит внутреннюю делецию от одной до 25 консервативных аминокислот; (г) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169, причем полипептид содержит C- и/или N-терминальное усечение от одной до 25 аминокислот; (д) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 169, причем полипептид содержит модификацию от одной до 25 аминокислот, выбранных из аминокислотных замещений, аминокислотных инсерций, аминокислотных делеций, C-терминального усечения, или N-терминального усечения; и (е) нуклеотидной последовательности, комплементарной к любой из (а)-(д). В различных аспектах, замещения, инсерции, делеции или модификации находятся в любых из положений аминокислотных остатков 1-4, 6, 8, 9, 11, 16, 18, 20-28, 47, 49, 50, 81, 82, 83, 100, 139, 155, 160, 176, 189, 190 и 250 SEQ ID NO: 169. В некоторых аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 168. В других аспектах, дополнительная молекула нуклеиновой кислоты состоит из нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 168.

Как описано выше, изобретение включает композицию, содержащую молекулу химерной нуклеиновой кислоты, содержащую первый фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области внешнего поверхностного белка A (OspA) серотипа 3 Borrelia garinii и второй фрагмент нуклеотидной последовательности кодирующей области белка OspA серотипа 5 Borrelia garinii, причем молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, обладает способностью индуцировать иммунный ответ против белка OspA серотипа 3 и белка OspA серотипа 5. В некоторых аспектах, композиция дополнительно содержит по меньшей мере две дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие внешний поверхностный белок A (OspA) Borrelia. В различных аспектах, такие дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты имеют разные нуклеотидные последовательности. В определенных аспектах, композиция по изобретению содержит по меньшей мере три молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие внешний поверхностный белок A (OspA) Borrelia, причем молекулы нуклеиновой кислоты имеют разные нуклеотидные последовательности. В конкретных аспектах, композиция по изобретению содержит молекулы нуклеиновой кислоты, причем молекулы нуклеиновой кислоты индивидуально содержат нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 168, 170 и 172. В некоторых аспектах, композиция по изобретению содержит химерные молекулы нуклеиновой кислоты, причем молекулы нуклеиновой кислоты кодируют полипептиды, индуцирующие иммунный ответ против по меньшей мере белков OspA серотипов 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

Изобретение также включает иммуногенные композиции. В некоторых аспектах, иммуногенная композиция по изобретению содержит любую из описанных тут композиций и фармацевтически приемлемый носитель. В различных аспектах, иммуногенная композиция обладает способностью индуцировать продуцирование антитела, которое специфически связывается с внешним поверхностным белком A (OspA). В определенных аспектах, иммуногенная композиция обладает способностью индуцировать продуцирование антитела, которое специфически связывается с Borrelia. В конкретных аспектах, иммуногенная композиция обладает способностью индуцировать продуцирование антитела, нейтрализующего Borrelia. В некоторых аспектах, антитело продуцируется животным. В дополнительных аспектах, животное представляет собой млекопитающее. В других аспектах, млекопитающее является человеком.

Изобретение дополнительно включает композиции вакцины. В некоторых аспектах, композиция вакцины по изобретению содержит любую иммуногенную композицию, описанную тут, и фармацевтически приемлемый носитель. В различных аспектах, изобретение включает комбинированную вакцину. В определенных аспектах, комбинированная вакцина по изобретению содержит любую композицию вакцины, описанную тут, в сочетании с по меньшей мере второй композицией вакцины. В некоторых аспектах, вторая композиция вакцины защищает от переносимой клещами болезни. В различных аспектах, переносимая клещами болезнь представляет собой пятнистую лихорадку Скалистых гор, бабезиоз, возвратную лихорадку, колорадскую клещевую лихорадку, моноцитарный эрлихиоз человека (HME), гранулоцитарный эрлихиоз человека (HGE), клещевую сыпную лихорадку STARI (Southern Tick-Associated Rash Illness), туляремию, клещевой паралич, энцефалит Повассан, ку-лихорадку, конго-крымскую геморрагическую лихорадку, цитауксзооноз (cytauxzoonosis), марсельскую лихорадку или клещевой энцефалит. В других аспектах, вторая композиция вакцины представляет собой вакцину, выбранную из группы, состоящей из: вакцины клещевого энцефалита, вакцины японского энцефалита и вакцины пятнистой лихорадки Скалистых гор. В различных аспектах, вторая композиция вакцины имеет сезонный график иммунизации, совместимый с иммунизацией против инфекции Borrelia или лаймской болезни.

Изобретение также включает способы индуцирования иммунологического ответа у субъекта. В различных аспектах, такие способы включают стадию введения субъекту любой из иммуногенных композиций или композиций вакцины, описанных тут, в количестве, эффективно индуцирующем иммунологический ответ. В определенных аспектах, иммунологический ответ включает продуцирование анти-OspA антитела.

Изобретение включает способы профилактики или лечения инфекции Borrelia или лаймской болезни у субъекта. В различных аспектах, такие способы включают стадию введения субъекту любой из композиций вакцины, описанных тут, или любой из комбинированных вакцин, описанных тут, в количестве, обеспечивающем эффективную профилактику или лечение инфекции Borrelia или лаймской болезни.

Изобретение включает использование композиций по изобретению для изготовления лекарственных препаратов. Настоящее изобретение также предусматривает другие родственные аспекты.

Изложенная выше сущность изобретения не предназначена для описания всех аспектов изобретения, и дополнительные аспекты описаны в других разделах, таких как приведенное далее детальное описание. Весь документ должен рассматриваться как единое раскрытие изобретения, и следует понимать, что предусматриваются все комбинации признаков, описанных тут, даже если комбинация признаков не встречается вместе в одном и том же предложении, или абзаце, или разделе данного документа. Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны из приведенного далее детального описания. Следует понимать, однако, что детальное описание и конкретные примеры, указывающие конкретные варианты воплощения изобретения, приводятся только с целью иллюстрации, потому что различные изменения и модификации сущности и объема изобретения будут понятны квалифицированным специалистам в данной области техники из данного детального описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой общую схему получения липидированных химерных конструктов OspA.

Фигура 2 представляет собой аминокислотную последовательность lipB sOspA 1/2²⁵¹ (SEQ ID NO: 2).

Фигура 3 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO: 1) и расшифрованные аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 2) lipB sOspA 1/2²⁵¹.

Фигура 4 представляет собой аминокислотную последовательность lipB sOspA 6/4 (SEQ ID NO: 4).

Фигура 5 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO: 3) и расшифрованные аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 4) lipB sOspA 6/4.

Фигура 6 представляет собой аминокислотную последовательность lipB sOspA 5/3 (SEQ ID NO: 6).

Фигура 7 изображает нуклеотидную (SEQ ID NO: 5) и расшифрованные аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 6) lipB sOspA 5/3.

Фигура 8 изображает оптимизацию использования кодонов для высокого уровня экспрессии.

Фигура 9 изображает различия между последовательностями липидированных и нелипидированных конструктов.

Фигура 10 представляет собой описание системы экспрессии T7.

Фигура 11 представляет собой результаты анализа способом ДСН-ПААГ, показывающие экспрессию новых рекомбинантных белков OspA индуцированными и неиндуцированными культурами.

Фигура 12 представляет собой карту плазмиды pUC18.

Фигура 13 представляет собой карту плазмиды pET30a.

Фигура 14 изображает стратегию создания фрагмента Kpn I - Bam HI lipB sOspA 5/3.

Фигура 15 изображает выравнивание с указанием аминокислотной замены (SEQ ID NO: 39) в lipB sOspA 1/2²⁵¹ и праймерные последовательности PCR (SEQ ID NO: 21 и 41), используемые для введения замены (lipB OspA 1/2 mod (SEQ ID NO: 38); консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 40)).

Фигура 16 изображает выравнивание OspA-последовательности Blip OspA BPBP/A1 с модифицированной молекулой lipB sOspA 1/2²⁵¹. Верхняя нить представляет собой исходную последовательность (SEQ ID NO: 42), и нижняя нить представляет собой оптимизированную последовательность (SEQ ID NO: 43). Примечание: три основания (CAT) в начале последовательности не показаны; они образуют часть сайта Nde I CATATG.

Фигура 17 изображает выравнивание OspA-последовательности Blip OspA KT с модифицированной молекулой lipB sOspA 6/4. Верхняя нить представляет собой исходную последовательность (SEQ ID NO: 44), и нижняя нить представляет собой оптимизированную последовательность (SEQ ID NO: 45). Примечание: Одно основание (C) в начале последовательности не показано; оно входит в состав сайта Nde I CATATG.

Фигура 18 изображает выравнивание OspA-последовательности Blip OspA 5/3 с модифицированной молекулой lipB sOspA 5/3. Верхняя нить представляет собой исходную последовательность (SEQ ID NO: 46), и нижняя нить представляет собой оптимизированную последовательность (SEQ ID NO: 47).

Фигура 19 изображает распределение функциональных анти-OspA ответов по результатам проведения анализов на поверхностное связывание антител и ингибирование роста у защищенных и инфицированных животных, иммунизированных 3 нг OspA 1/2 перед контрольным заражением штаммом B. burgdorferi s.s. B31. p-Значения Манна-Уитни продемонстрировали высокозначимые различия по содержанию функциональных антител между защищенными и инфицированными животными.

Фигура 20 изображает распределение функциональных анти-OspA ответов по результатам проведения анализов на поверхностное связывание антител и ингибирование роста у защищенных и инфицированных животных, иммунизированных 3 нг OspA 1/2 перед контрольным заражением природными клещами. p-Значения Манна-Уитни продемонстрировали высокозначимые различия по содержанию функциональных антител между защищенными и инфицированными животными.

Фигура 21 изображает поверхностное связывание (средние интенсивности флуоресценции (MFI)) и ингибирование роста (титры GI-50) в пуле мышиной сыворотки после иммунизации тремя дозами 3-компонентной вакцины химерного OspA. Эффективное поверхностное связывание и ингибирование роста наблюдалось для всех шести штаммов Borrelia, экспрессирующих типы OspA, гомологичные типам OspA в вакцине (типы 1-6).

Фигура 22 изображает титры средней интенсивности флуоресценции (MFI), которые были получены с использованием сывороток дня 42 индивидуальных мышей, иммунизированных комбинациями вакцин rOspA путем проведения анализа на поверхностное связывание (SBA). Результаты показали, что все три компонента rOspA (1/2, 6/4 и 5/3) являются необходимыми в мультивалентной вакцине для индуцирования высоких титров поверхностного связывания IgG-антител против всех 6 штаммов у C3H-мышей. Двухкомпонентные вакцины не покрывают полностью 2 отсутствующие штамма.

Фигура 23 изображает ингибирование роста Borreliae с использованием сыворотки дня 42 индивидуальных мышей (в группах по 10), иммунизированных комбинациями вакцин rOspA. Только мультивалентная вакцина (вакцина, содержащая все три штамма) давала >50% ингибирования роста у >90% животных (n=10). Черные столбики (со сплошной заливкой) указывают штаммы, гомологичные использованной вакцине.

Фигура 24 изображает покрытие Borreliae, экспрессирующих внутритиповые варианты OspA. Поверхностное связывание было классифицировано на сильное (усиление флуоресценции >10-кратного) или более слабое (2-10-кратное усиление флуоресценции).

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение предусматривает химерные молекулы OspA, пригодные для использования в качестве антигенов, которые могут быть введены как иммуногенная композиция или композиция вакцины при лаймской болезни или инфекции Borrelia. Перед детальным пояснением каких-либо вариантов воплощения изобретения укажем, что изобретение не должно рассматриваться как ограниченное в его применении деталями конструкции и конфигурацией компонентов, указанных в приведенном ниже описании, или проиллюстрированных на фигурах и в примерах. Используемые тут заголовки разделов приводятся только в организационных целях и не должны пониматься как ограничивающие описываемый предмет. Все упоминаемые в данной заявке первоисточники явным образом включены сюда в качестве ссылок.

Изобретение охватывает другие варианты воплощения и практикуется или осуществляется различными способами. Также, следует понимать, что фразеология и терминология, используемые тут, предназначены для описания и не должны рассматриваться как ограничивающие. Термины "включающий", "содержащий" или "имеющий" и их варианты следует понимать