Новый ген гликозилтрансферазы и его применение

Новый ген гликозилтрансферазы и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к полинуклеотиду, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

Уровень техники

Цветы, имеющие новые признаки, всегда ценятся в цветочной индустрии. В частности, в промышленном отношении считается важным развитие растений, у которых был изменен "цвет", который считается наиболее важным признаком цветка, и были разработаны различные окраски цветков путем селекции с использованием классического метода кроссбридинга. Хотя кроссбридинг является эффективным методом селекции, поскольку существуют уникальные для растений генетические ограничения, этот метод имеет недостаток, будучи в состоянии использовать только генетические ресурсы, которыми обладают родственные виды, обладающие способностью к кроссбридингу. Например, несмотря на многие годы селекции, до сих пор не получены сорта роз, гвоздик, хризантем и лилий, имеющие цвет от фиолетового до синего, яркие красные сорта горечавок, ирисов и желтые сорта ипомей (вьюнков пурпурных утренняя слава).

Окраска цветка образуется из четырех типов пигментов, представленных флавоноидами, каротиноидами, хлорофиллом и беталаином. Среди них флавоноиды обладают широким спектром цветов, например, желтого, красного, фиолетового и синего. Группа, которая проявляет красный, фиолетовый и синий цвет, в общем называется антоцианами, и разнообразная структура антоцианов является одной из причин широкого диапазона окраски цветка. В целом антоцианы могут быть разделены на три группы, согласно структуре их агликона, вследствие их (антоцианов) пути биосинтеза. Цветки, имеющие яркий красный цвет, наподобие гвоздик и гераней, содержат большое количество антоцианов на основе пеларгонидина, тогда как цветки, имеющие синий или фиолетовый цвет, содержат большое количество антоцианов на основе дельфинидина. Причина отсутствия синего или фиолетового цвета у сортов роз, гвоздик, хризантем и лилий состоит в том, что эти растения не обладают способностью синтезировать антоцианы на основе дельфинидина.

Считается, что в дополнение к накоплению дельфинидина, для возникновения синей окраски цветка требуется любое из: (i) модификации антоциана одной или несколькими ароматическими ацильными группами, (ii) присутствия копигмента, такого как флавон или флавонол вместе с антоцианом, (ш) присутствия ионов железа или ионов алюминия вместе с антоцианом, (iv) повышения рН вакуолей, где локализован антоциан, от нейтрального до слабощелочного, или (v) образования комплекса из антоциана, копигмента и ионов металлов (и этот тип антоциана называется металлоантоцианинами) (см. непатентный документ 1).

Было проведено значительное исследование по биосинтезу флавоноидов и антоцианов и были идентифицированы связанные с биосинтезом ферменты и гены, кодирующие эти ферменты (см. непатентный документ 2 и фиг. 1). Например, из множества растений получен ген флавоноид-3ʹ,5ʹ-гидроксилазы (F3ʹ5ʹH), которая гидроксилирует В-кольцо флавоноидов, необходимых для биосинтеза дельфинидина. Кроме того, были созданы трансгенные растения, которые накапливают дельфинидин в своих лепестках, вызывая изменение окраски цветка на синюю (см. непатентный документ 4) введением этих генов F3ʹ5ʹH в гвоздики (см. патентный документ 1), розы (см. непатентный документ 3 и патентные документы 2 и 3) и хризантемы (см. патентный документ 4). Такие гвоздики и розы доступны в продаже.

Флавон является типом органического соединения, которое является циклическим кетоном производных флавана, и в узком смысле, относится к соединению 2,3-дигидрофлаван-4-он, представленного химической формулой С₁₅Н₁₀О₂, и имеющего молекулярную массу 222.24. В широком смысле, производные, классифицированные как флавоны, в общем называют "флавонами". Флавон в широком смысле (флавоны) относится к категории флавоноидов, которые классифицируются как, имеющие флавоновую структуру основного скелета, но не имеющие гидроксильную группу в 3-положении. Примеры типичных флавонов включают апигенин (4ʹ,5,7-тригидроксифлавон) и лютеолин (3ʹ,4ʹ,5,7-тетрагидроксифлавон). В описании настоящей заявки термин "флавон" относится к флавонам в широком смысле, а именно производным, классифицированным как флавоны.

Гены флавонсинтаз (FNS), требуемые для биосинтеза флавона, получены из множества растений. Известно, что флавоны, если присутствуют с антоцианами, обладают эффектом изменения цвета антоцианов в темно-синий цвет, и эти гены FNS привлекли внимание для модификации окраски цветка. Одновременно с накоплением дельфинидина, в цветочных лепестках также накапливались флавоны, и окраска цветка изменялась даже на еще более темный синий цвет в результате введения гена F3ʹ5ʹH и FNS в розы, не обладающие способностью синтезировать флавоны (см. патентный документ 5). Кроме того, поскольку флавоны также поглощают ультрафиолетовые лучи, в дополнение к тому, что являются причиной синей окраски цветка, флавоны защищают растения от ультрафиолетовых лучей или действуют в качестве визуального сигнала для насекомых в случае цветков, опыляемых насекомыми. Кроме того, флавоны также участвуют во взаимодействии между растениями и почвенными микроорганизмами. Кроме того, флавоны также используют в качестве ингредиента в пищевых продуктах и косметических средствах в качестве полезных для здоровья компонентов. Например, считается, что флавоны обладают противораковой активностью и употребление продуктов, содержащих большие количества флавонов, было показано для лечения и предотвращения рака.

Кроме того, из множества растений также были получены гены, которые модифицируют антоцианы и флавоны. Хотя они включают гены гликозилтрансфераз, ацилтрансфераз и метилтрансфераз, последующее обеспечивает описание гликозилтрансфераз (GT), которые катализируют реакции гликозилирования. Например, ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 3-положении антоциана, был выделен из растений, таких как, горечавка, перилла, петуния, роза и львиный зев (см. непатентные документы 4-6 и патентный документ 6). Ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 5-положении антоциана, был выделен из таких растений, как перилла, петуния, горечавка, вербена или торения (см. непатентные документы 5-7 и патентный документ 7). Ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 7-положении флавона, был выделен из Arabidopsis thaliana (thale cress) (см. непатентный документ 8). Ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 7-положении байкалеина, был выделен из шлемника байкальского, и сообщалось, что белок, экспрессируемый этим геном в Escherichia coli, катализирует реакцию, демонстрируя активность переноса глюкозы на гидроксильную группу в 7-положении флавоноидов (см. непатентный документ 9). Ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 3-положении антоциана, был выделен из горечавки, мотылькового горошка и цинерии (cineria) (см. патентный документ 8). Кроме того, ген, кодирующий белок, обладающий активностью последовательного переноса глюкозы на гидроксильные группы в двух различных положениях А-кольца и С-кольца антоциана, был выделен из розы (см. патентный документ 9). Ген, кодирующий белок, обладающий активностью последовательного переноса глюкозы на гидроксильные группы в двух различных положениях В-кольца антоциана, был выделен из мотылькового горошка (см. патентный документ 10).

Хотя вышеупомянутые гликозилтрансферазы используют УДФ-глюкозу в качестве донора сахара, недавно были идентифицированы гликозилтрансферазы, которые используют ацилглюкозу в качестве донора сахара. Ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 5-положении антоциан-3-глюкозида, был выделен из гвоздики, тогда как ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса глюкозы на гидроксильную группу в 7-положении, был выделен из дельфиниума (см. непатентный документ 10).

Таким образом, большое количество белков существует в качестве гликозилтрансфераз, обладающих активностью переноса глюкозы на различные гидроксильные группы.

Однако считается, что остается большое число гликозилтрансфераз, для которых функция еще должна быть установлена. Например, ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса сахара в 4-положение флавоноида, и ген, кодирующий белок, обладающий активностью последовательного переноса сахара на гидроксильные группы в двух различных положениях А-кольца и В-кольца флавоноида, еще должны быть идентифицированы. Хотя сообщалось, что ген гликозилтрансферазы, полученный из мезембриантемум Ливингстона, демонстрирует активность, в отношении переноса глюкозы на одну из гидроксильных групп в 4ʹ-положении или в 7-положении флавоноида in vitro, активность, присущая этой гликозилтрансферазе растений, обеспечивает перенос глюкозы на гидроксильную группу в 5-положении бетанидина (см. непатентный документ 11).

Однако металлоантоцианины, представленные пигментами коммелины, василька, шалфея и немофилы, состоят из шести молекул антоцианов, шести молекул флавонов и двух атомов ионов металлов, и каждый компонент собран с образованием стабильного синего пигмента (см. фиг. 2 и непатентный документ 1). Например, металлоантоцианин немофилы образуется из немофилина (см. фиг. 3), малонил-апигенин 4ʹ,7ʹ-диглюкозида (см. фиг. 4), Mg²⁺ и Fe³⁺. Металлоантоцианин шалфея образуется из цианосальвианина (cyanosalvianin) (см. фиг. 5), апигенин-4,7ʹ-диглюкозида (см. фиг. 6) и Mg²⁺. Согласно предшествующему исследованию все голубые цветки, в которых образуются металлоантоцианины, биосинтезируют флавон, в котором сахар присоединяется к гидроксильным группам как в 4ʹ-положении, так и в 7-положении, и было установлено, что сахар, присоединенный к этому флавону играет важную роль в молекулярном узнавании на протяжении образования металлоантоцианина. Было показано, что сахар, скоординированный в 4ʹ-положении флавона, является важным в молекулярном распознавании в ходе образования, тогда как сахар в 7-положении участвует в стабильности флавона (см. непатентный документ 1). Только после добавления этих двух Сахаров к флавону образуется металлоантоцианин, который приводит к экспрессии привлекательного голубого цвета. Кроме того, лепестки голубого голландского ириса содержат флавон, в котором сахар был добавлен в 4-положение. Кроме того, поскольку в результате присоединения двух Сахаров к флавонам повышается их растворимость и изменяются физические свойства, то ожидается, что расширится применение флавонов в пищевых продуктах для здорового питания, лекарственных препаратах и в виде косметических ингредиентов.

Документы предыдущего уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: Международная публикация WO 2006/105598

Патентный документ 2: Международная публикация WO 2010/122849

Патентный документ 3: Международная публикация WO 2005/017147

Патентный документ 4: Международная публикация WO 2009/062253

Патентный документ 5: Международная публикация WO 2008/156211

Патентный документ 6: Международная публикация WO 2007/094521

Патентный документ 7: Международная публикация WO 99/05287

Патентный документ 8: Международная публикация WO 001/092509

Патентный документ 9: Японская нерассмотренная патентная публикация №2006-149293

Патентный документ 10: Японская нерассмотренная патентная публикация №2005-95005

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Natural Product Reports (2009), 26, 884-915

Непатентный документ 2: Biosci. Biotechnol. Biochem. (2010), 74(9), 1760-1769

Непатентный документ 3: Plant Cell Physiol. (2007), 48(11), 1589-1600

Непатентный документ 4: Plant Cell Physiol. (1996), 37(5), 711-716

Непатентный документ 5: J. Biol. Chem. (1999), 274(11), 7405-7411

Непатентный документ 6: Plant Molecular Biology (2002), 48,401-411

Непатентный документ 7: Journal of Experimental Botany (2008), 59(6), 1241-1252

Непатентный документ 8: Biosci. Biotechnol. Biochem. (2006), 70(6), 1471-1477

Непатентный документ 9: Planta (2010), 210,1006-1013

Непатентный документ 10: Plant Cell (2010), 22(10), 3374-89

Непатентный документ 11: The Plant Journal (1999), 19(5), 509-519

Раскрытие сущности изобретения

Проблемы, подлежащие разрешению данным изобретением

Изменение физических свойств флавонов необходимо для изменения окраски цветка и разработки материалов для пищевых продуктов, лекарственных и косметических препаратов. Например, хотя гвоздики, розы и хризантемы, которые накапливают дельфинидин, имеют синевато-фиолетовый цвет, проводятся исследования, чтобы сделать этот цвет еще более синим.

В соответствии с вышеизложенной целью, задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, и применение полинуклеотида.

Способы решения поставленных задач

В результате проведения обширных исследований и экспериментов для решения вышеупомянутых задач, авторы настоящего изобретения выделили полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, и подтвердили применимость полипептида, что приводит к созданию настоящего изобретения.

А именно, настоящее изобретение представляет собой как описано ниже.

[1] Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из следующих от (а) до (е):

(a) полинуклеотида, состоящего из последовательности оснований SEQ ID NO:1;

(b) полинуклеотида, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований SEQ ID NO:1, и который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона;

(c) полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;

(d) полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот были делетированы, замещены, встроены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона; и,

(e) полинуклеотида, кодирующего белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

[2] Полинуклеотид, описанный в [1] выше, который является (а) полинуклеотидом, состоящим из последовательности оснований SEQ ID NO:1.

[3] Полинуклеотид, описанный в [1] выше, который является (с) полинуклеотидом, кодирующим белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

[4] Полинуклеотид, описанный в [1] выше, который является (f) полинуклеотидом, кодирующим белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую 95% или большую идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

[5] Полинуклеотид, описанный в [4] выше, который является (g) полинуклеотидом, кодирующим белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую 97% или большую идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

[6] Полинуклеотид, описанный в [5] выше, который является (h) полинуклеотидом, кодирующим белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую 98% или большую идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

[7] Полинуклеотид, описанный в любом из с [1] по [6] выше, который является ДНК.

[8] Белок, кодируемый полинуклеотидом, описанным в любом из с [1] по [7] выше.

[9] Вектор, содержащий полинуклеотид, описанный в любом из с [1] по [7] выше.

[10] Не относящийся к человеку хозяин, со вставленным вектором, описанным в [9] выше.

[11] Способ добавления сахара к гидроксильной группе в 4ʹ-положении флавона с использованием полинуклеотида, описанного в любом из с [1] по [7] выше.

[12] Растение, потомство растения, или часть, или ткань растения, с введенным полинуклеотидом, описанным в любом из с [1] по [7] выше, и содержащие этот полинуклеотид.

[13] Часть растения, описанного в [12] выше, которая является срезанным цветком.

[14] Процессированный срезанный цветок, где использован срезанный цветок, описанный в [13] выше.

[15] Способ получения белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, содержащий следующие стадии:

культивирования или выращивания не относящегося к человеку хозяина, описанного в [10] выше, и

получения белка из не относящегося к человеку хозяина, белка, который обладает активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

[16] Способ получения флавона, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в его 4ʹ-положении, содержащий следующие стадии:

культивирования или выращивания не относящегося к человеку хозяина, описанного в [10] выше, и

получение флавона, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в его 4ʹ-положении, из не относящегося к человеку хозяина.

[17] Продукт питания, содержащий флавон, полученный согласно способу, описанному в [16] выше, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в его 4ʹ-положении.

[18] Фармацевтический препарат, содержащий флавон, полученный согласно способу, описанному в [16] выше, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в его 4ʹ-положении.

[19] Косметическое средство, содержащие флавон, полученный согласно способу, описанному в [16] выше, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в его 4ʹ-положении.

Эффекты изобретения

Полинуклеотид настоящего изобретения обеспечивает возможность получения белка, обладающего активностью специфического переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, экспрессируемого в подходящих клетках хозяина. По изобретению, настоящее изобретение может быть использовано для изменения окраски цветка путем конститутивной или тканеспецифической экспрессии в растении белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

Флавон, у которого сахар был добавлен к гидроксильным группам как в 4ʹ-положении, так и в 7-положении, образуется введением белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, в растение, заведомо обладающее активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 7-положении флавона, например, наподобие розы. Альтернативно, флавон, у которого сахар был добавлен к гидроксильным группам как в 4ʹ-положении, так и в 7-положении, образуется экспрессией в растении белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, вместе с белком, обладающим активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 7-положении флавона.

Кроме того, по изобретению также обеспечивают способ получения флавона, у которого сахар был добавлен к гидроксильной группе в 4ʹ-положении, и продукт питания, фармацевтический препарат или косметическое средство и т.п., полученное согласно этому способу получения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является чертежом для объяснения пути биосинтеза антоцианов.

Фиг. 2 является схематическим чертежом структуры металлоантоцианина.

Фиг. 3 демонстрирует структурную формулу антоциана, полученного из немофилы (немофилина).

Фиг. 4 демонстрирует структурную формулу флавона, полученного из немофилы (малонилапигенин-4ʹ,7ʹ-диглюкозида).

Фиг. 5 демонстрирует структурную формулу флавона, полученного из шалфея (цианосальвианина) (cyanosalvianin).

Фиг. 6 демонстрирует структурную формулу флавона, полученного из шалфея (апигенин-4ʹ,7-диглюкозида).

Фиг. 7 является хроматограммой, полученной после ферментативной реакции между экстрактом из лепестка цветка и апигенином с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Фиг. 8 является чертежом для объяснения пути биосинтеза апигенин-4ʹ,7-диглюкозида.

Фиг. 9 является хроматограммой, полученной после ферментативной реакции между раствором белка NmGT8 и апигенином с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фиг. 10 является хроматограммой, полученной после ферментативной реакции между раствором белка NmGT8 и апигенин-7-глюкозидом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фиг. 11 является чертежом, суммирующим реакционные способности раствора белка NmGT8 и фермента, в который был добавлен сахар в 5-положении байкалеина, при различных субстратах флавоноидов.

Фиг. 12-1 является диаграммой выравнивания для сравнения аминокислотных последовательностей NmGT8 и NmG13.

Фиг. 12-2 является диаграммой выравнивания для сравнения аминокислотных последовательностей NmGT8 и NmGT4.

Фиг. 12-3 является диаграммой выравнивания для сравнения аминокислотных последовательностей NmGT8, NmGT3 и NmGT4.

Фиг. 13 является диаграммой выравнивания для сравнения аминокислотных последовательностей NmGT8 и фермента, у которого сахар был добавлен в 4ʹ-положение, халкона львиного зева.

Фиг. 14 является диаграммой выравнивания для сравнения аминокислотных последовательностей NmGT8 и фермента, у которого сахара были добавлены в 3-положение и 5-положение, антоцианидина розы.

Фиг. 15 является филогенетическим древом, указывающим на родство между NmGT8 настоящего изобретения и указанных выше ферментов.

Фиг. 16 демонстрирует конструкцию, содержащую NmGT8, введенную в торению (pSPB-4583).

Фиг. 17 демонстрирует конструкции, содержащие NmGT8, введенную в петунию (pSPB5424 и pSPB5428).

Фиг. 18 является высокоэффективной жидкостной хроматограммой экстракта пестиков цветка рекомбинантной петунии со вставленным NmGT8.

Фиг. 19 является хроматограммой экстрагированных положительных ионов (с отношением масса/заряд (m/z) от 250 m/z до 1250 m/z) из экстракта лепестков цветков рекомбинантной петунии с введенным NmGT8.

Фиг. 20 демонстрирует конструкцию, содержащую NmGT8, введенную в гвоздику (pSPB5433).

Фиг. 21 демонстрирует конструкции, содержащие NmGT8, введенные в розу (pSPB4577, pSPB4578, pSPB5437 и pSPB5440).

Фиг. 22 является высокоэффективной жидкостной хроматограммой экстракта пестиков цветка рекомбинантной розы со вставленным NmGT8.

Фиг. 23 является масс-спектром экстрагированных положительных ионов (с отношением масса/заряд (m/z) от 250 m/z до 1250 m/z) из экстракта лепестков цветков рекомбинантной розы с введенным NmGT8.

Лучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение имеет отношение к полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из следующих от (а) до (е):

(a) полинуклеотида, состоящего из последовательности оснований SEQ ID NO:1;

(b) полинуклеотида, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований SEQ ID NO:1, и который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона;

(c) полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;

(d) полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот были делегированы, замещены, встроены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона; и,

(e) полинуклеотида, кодирующего белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

В настоящем описании термин "полинуклеотид" относится к ДНК или РНК.

В настоящем описании термин "жесткие условия" относится к условиям, при которых полинуклеотид или олигонуклеотид и геномная ДНК связываются избирательно и специфически, чтобы иметь возможность быть обнаруженными. Жесткие условия определяют подходящей комбинацией концентрации соли, концентрации органического растворителя (такого как формальдегид), температуры и других известных условий. А именно, жесткость повышают снижением концентрации соли, увеличением концентрации органического растворителя или повышением температуры гибридизации. Кроме того, условия отмывки после гибридизации также влияют на жесткость. Эти условия отмывки также определяются концентрацией соли и температурой, и жесткость отмывки повышают снижением концентрации соли или повышением температуры. Таким образом, термин "жесткие условия" относится к условиям, при которых специфическая гибридизация происходит только между последовательностями оснований, имеющими высокую гомологию, так что степень идентичности или гомология между каждой последовательностью оснований составляет, например, в среднем около 80% или более, предпочтительно около 90% или более, более предпочтительно около 95% или более, даже более предпочтительно около 97% или более и наиболее предпочтительно 98%) или более. Пример "жестких условий" состоит из концентрации натрия от 150 мМ до 900 мМ, и предпочтительно от 600 мМ до 900 мМ и рН от 6 до 8 при температуре от 60°С до 68°С, и в частности, состоит из выполнения гибридизации в условиях, состоящих из 5 × SSC (750 мМ NaCl, 75 мМ натрия лимоннокислого трехзамещенного), 1% SDS (додецилсульфата натрия (ДСН)), 5 × раствора Денхардта, 50% формальдегида и 42°С, с последующей отмывкой в условиях, состоящих из 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 тМ натрия лимоннокислого трехзамещенного), 0,1 × SDS и 55°С.

Гибридизация может быть выполнена в соответствии с методом известным в данной области, или методом, удовлетворяющим требованиям, таким как метод, описанный в Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel, et al, 1987). Кроме того, в случае использования коммерчески доступной библиотеки, гибридизация может быть выполнена в соответствии с методом, описанным в руководстве, предоставленном вместе с ней (библиотекой). Гены, выбранные с использованием такой гибридизации, могут быть природными генами, такими как гены, произведенные из растений, или гены, не произведенные из растений. Кроме того, гены, отобранные гибридизацией, могут быть кДНК, геномной ДНК или химически синтезированной ДНК.

Вышеупомянутая "аминокислотная последовательность, у которой одна или множество аминокислот были делегированы, заменены, встроены и/или добавлены" относится к аминокислотной последовательности, у которой было делегировано, заменено, вставлено и/или добавлено произвольное число аминокислот, такое как от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 5 и даже более предпочтительно от 1 до 3. Может оказаться полезной такая генно-инженерная технология, как сайт-специфический мутагенез, поскольку он позволяет вводить специфическую мутацию в специфический сайт, и может быть выполнен в соответствии с методом, таким как описанный в Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Экспрессией этой мутантной ДНК с использованием подходящей экспрессирующей системы, может быть получен белок, который состоит из аминокислотной последовательности, у которой одна или множество аминокислот были делегированы, заменены, встроены и/или добавлены.

Кроме того, ДНК по изобретению может быть получена методом, известным среднему специалисту в данной области техники, таким как метод, состоящий из химического синтеза согласно фосфоамидному методу, или методом амплификации нуклеиновых кислот с использованием пробы нуклеиновой кислоты из растения в качестве матрицы, и с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена-мишени.

В настоящем описании термины "идентичность" и "гомология" относятся к количеству (числу), которое дает возможность определить, что соответствующие аминокислотные остатки или основания, образующие две цепи в полипептидной последовательности (или аминокислотной последовательности) или полинуклеотидной последовательности (или последовательности оснований), идентичны исходя из отношения взаимной совместимости между двумя цепями, и "идентичность" и "гомология" могут быть легко вычислены. Известны многочисленные методы для измерения гомологии между двумя полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями, и термины "идентичность" и "гомология" широко известны обычным специалистам в данной области (см., например, Lesk, A.M. (ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York (1988); Smith, D.W. (ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York (1993); Grifin, A.M. & Grifin, H.G. (ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York (1987); и Gribskov, M. & Devereux, J. (ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York (1991)).

Кроме того, хотя описанные в настоящем описании значения "идентичности" и "гомологии" могут быть значениями, вычисленными с использованием программы поиска гомологий, известной специалистам с обычной квалификацией в данной области техники, если специально не указано иное, они предпочтительно являются значениями, рассчитанными с использованием программы Clustal W Program с приложением MacVector (версия 9.5, Oxford Molecular Ltd., Оксфорд, Англия)

Полинуклеотид (нуклеиновая кислота или ген) настоящего изобретения это тот, который "кодирует" представляющий интерес белок. Здесь, "кодирует" относится к экспрессии представляющего интерес белка в состоянии сохранения его (белка) активности. Кроме того, "кодирует" включает как значение кодирующий в виде непосредственных составляющих последовательности (экзонов), где представляющий интерес белок является сплошным, так и кодирующий с использованием промежуточных последовательностей (интронов).

Как будет описано в примерах, которые впоследствии будут описаны, ген, имеющий природную последовательность оснований получают, например, анализом с использованием секвенатора ДНК. Кроме того, ДНК, кодирующая фермент, имеющий модифицированную аминокислотную последовательность, может быть синтезирована с использованием обычного сайт-специфического мутагенеза или ПЦР, с использованием ДНК, имеющей природную последовательность в качестве основы. Например, после получения необходимого фрагмента ДНК, подлежащего модификации обработкой кДНК рестриктазой или рестриктазой для геномной ДНК, сайт-специфический мутагенез или ПЦР выполняют с использованием фрагмента ДНК в качестве матрицы и с использованием праймеров, введенных необходимой мутацией для получения необходимого модифицированного фрагмента ДНК. Затем фрагмент ДНК, введенный этой мутацией, связывают с фрагментом ДНК, кодирующим другой сегмент фермента-мишени.

Альтернативно, для получения ДНК, кодирующей фермент, состоящий из укороченной аминокислотной последовательности, ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность более длинную, чем аминокислотная последовательность-мишень, такую как ДНК, кодирующую полноразмерную аминокислотную последовательность, расщепляют рестриктазой, и в случае, если полученный фрагмент ДНК не кодирует всю аминокислотную последовательность-мишень, то синтезируют фрагмент ДНК, состоящий из неполного участка последовательности, и связывают с ним.

Кроме того, измерением ферментативной активности после экспрессии полученного полинуклеотида в Escherichia coli или дрожжах с использованием системы экспрессии генов, может быть подтверждено, что полученный полинуклеотид пригоден для кодирования белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона. Кроме того, полинуклеотидный продукт в форме белка, обладающего активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, может быть получен экспрессией этого полинуклеотида. Альтернативно, белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, также может быть получен с использованием антитела к полипептиду, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO:2, и происходящий из другого организма полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, также может быть клонирован с использованием этого антитела.

Настоящее изобретение также имеет отношение к (рекомбинантному) вектору, содержащему указанный выше полинуклеотид, и в частности к экспрессирующему вектору, а также хозяину, трансформированному этим вектором.

Прокариоты или эукариоты могут быть использованы в качестве хозяина. Примеры прокариот включают обычно используемые прокариоты-хозяева, такие как бактерии, в том числе бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Escherichia coli, и бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, такие как Bacillus subtilis. Примеры эукариот, которые могут быть использованы, включают низшие эукариоты, такие как эукариотические организмы наподобие грибов, такие как дрожжи или мицелиальные грибы.

Примеры дрожжей включают виды Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae, и примеры мицелиальных грибов включают виды Aspergillus, такие как Aspergillus oryzae или Aspergillus niger, и виды Penicillium. Животные клетки или растительные клетки также могут быть использованы в качестве хозяина, примеры используемых систем животных клеток включают клетки мыши, хомяка, обезьяны или человека и клетки насекомых, такие как клетки тутового шелкопряда или взрослых особей тутового шелкопряда в чистом виде, также используют в качестве хозяев.

Экспрессирующий вектор по изобретению содержит регуляторную область экспрессии, такую как промотор, терминатор или репликативную точку, зависящую от типа хозяина, в который вводят экспрессирующий вектор. Обычно используемый промотор, такой как trc-промотор, tac-промотор или lac-промотор, используют в качестве промотора бактериального экспрессирующего вектора, промотор глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы или промотор РН05, например, используют в качестве дрожжевого промотора, и амилазный промотор или trpC-промотор, например, используют в качестве промотора мицелиальных грибов. Кроме того, примеры промоторов клеток-хозяев животного включают вирусные промоторы, такие как ранний промотор SV40 поздний промотор SV40.

Примеры промоторов, которые конститутивно экспрессируют полинуклеотид в растительных клетках, включают промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена rd29A, промотор rbcS и промотор тас-1. Кроме того, промотор гена, который специфически экспрессируется в этой ткани, может быть использован для тканеспецифической экспрессии гена.

Экспрессирующий вектор может быть получен в соответствии с обычными методами с использованием рестриктаз, лигаз и т.п. Кроме того, трансформация хозяина экспрессирующим вектором также может быть выполнена в соответствии с обычными методами.

Белок-мишень может быть получен культивированием, культивированием или выращиванием хозяина, трансформированного вышеуказанным экспрессирующим вектором, и извлечением и очисткой из культуры или среды в соответствии с обычными методами, такими как фильтрация, разделение центрифугированием, разрушение клеток, гель-фильтрационная хроматография или ионообменная хроматография.

Хотя настоящее описание описывает полученный из немофилы ген, кодирующий белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, полинуклеотид по изобретению не ограничивается геном, полученным из немофилы, но скорее может быть применен для изменения окраски цветка растения независимо от того, источником гена, кодирующего белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, является ли растение, животное или микроорганизм, при условии, что источник гена обладает активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

Настоящее изобретение также относится к растению, его потомству или его части или ткани, полученными введением экзогенного полинуклеотида, кодирующего белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона, приводящее к тому, что экзогенный полинуклеотид должен содержаться в растении. Примером формы части ткани является срезанный цветок. 4ʹ-положение флавона может быть гликозилированным, или