Способ конъюгирования полимерной частицы

Способ конъюгирования полимерной частицы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие, в целом, относится к способам конъюгирования подложки и к подложкам, полученным посредством таких способов.

Уровень техники

Конъюгация полинуклеотидов с подложками вызывает интерес в различных отраслях промышленности. Подложки, включающие конъюгированные полинуклеотиды, пригодны для методик разделения, определения генетических маркеров и секвенирования.

Например, подложку, конъюгированную с полинуклеотидным зондом, можно применять с целью захвата генетических маркеров для определения. Иллюстративные генетические маркеры могут быть связаны с вариантами нарушения гена, заболеванием, вызванным бактериями или вирусами, или аллелями, пригодными для определения у людей. Подложки, включающие конъюгированные зонды, которые комплементарны генетическому маркеру, могут захватывать такой генетический маркер, а для определения наличия захваченного генетического маркера можно использовать различные методики.

Согласно другому примеру конъюгированная с полинуклеотидом подложка может быть пригодна при захвате и отделении генетического материала. Согласно примеру зонды на подложке могут быть комплементарны необходимому полинуклеотиду. Зонды могут быть способны к захвату необходимого полинуклеотида, а позднее высвобождению полинуклеотида, что дает возможность выделения полинуклеотида. Согласно другому примеру полимерные частицы, конъюгированные с полинуклеотидными зондами, которые комплементарны целевым полинуклеотидам, можно применять для захвата и отделения целевого полинуклеотида от раствора. В дальнейшем целевой полинуклеотид может высвобождаться из конъюгированной частицы в другом растворе.

Согласно следующему примеру конъюгированную с полинуклеотидом подложку можно применять в различных методиках секвенирования. Например, полимерную частицу, конъюгированную с полинуклеотидом или множественном копий полинуклеотида, можно применять в методиках секвенирования, таких как методики флуоресцентного секвенирования или методики ионного секвенирования.

В то время как каждое из описанных выше применений конъюгированных подложек представляет конкретный интерес для различных отраслей промышленности, надежная конъюгация полинуклеотида с такой подложкой, как полимерная подложка, часто является недостаточной. Такие недостатки приводят к более низким плотностям конъюгированного полинуклеотида или образованию случайных участков, лишенных необходимого полинуклеотида. Такие недостатки могут в результате привести к плохим результатам разделений, низкой точности в способах определения и низкому сигналу и высокому соотношению сигнал-шум в методиках секвенирования.

В связи с этим необходим усовершенствованный способ конъюгации.

Раскрытие изобретения

Согласно первому аспекту способ конъюгирования подложки предусматривает обмен связанного с биомолекулой противоиона с липофильным противоионом с получением биомолекулярного комплекса, диспергирование биомолекулярного комплекса в неводном растворителе и связывание биомолекулярного комплекса с подложкой в присутствии неводного растворителя.

Согласно второму аспекту способ конъюгирования полимерной частицы предусматривает обмен связанного с полинуклеотидом катионного противоиона с липофильным катионным противоионом с получением полинуклеотидного комплекса, причем полинуклеотид включает нуклеофильную или электрофильную реакционноспособную группу. Способ дополнительно предусматривает диспергирование полинуклеотидного комплекса в нереакционноспособном неводном растворителе и связывание полинуклеотида с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения, причем полимерная частица включает электрофильную группу или нуклеофильную группу.

Согласно третьему аспекту полимерная частица включает полимер, конъюгированный с полинуклеотидом при помощи способа по любому из описанных выше аспектов или примеров.

Согласно четвертому аспекту способ секвенирования предусматривает амплификацию целевого полинуклеотида в присутствии конъюгированной с олигонуклеотидом полимерной частицы с получением конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы. Олигонуклеотид является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированную с олигонуклеотидом полимерную частицу получают посредством способа по любому из описанных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает внесение конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частицы в устройство для секвенирования, внесение праймера к конъюгированной с полинуклеотидом полимерной частице, встраивание нуклеотида и детектирование встраивания.

Согласно пятому аспекту способ выделения целевого полинуклеотида предусматривает приведение первого раствора, включающего целевой полинуклеотид, в контакт с конъюгированной с зондом подложкой. Зонд у конъюгированной с зондом подложки является по меньшей мере частично комплементарным целевому полинуклеотиду. Конъюгированную с зондом подложку получают посредством способа по любому из описанных выше аспектов или примеров. Способ дополнительно предусматривает промывание конъюгированной с зондом подложки пока целевой полинуклеотид связан с зондом и высвобождение целевого полинуклеотида во втором растворе.

Согласно дополнительному аспекту способ конъюгирования олигонуклеотида с полимером предусматривает обработку содержащего функциональную аминогруппу полимера сложным бис-NHS-эфиром или дисукцинимидилкарбонатом с получением функционализированного полимера и обработку функционализированного полимера олигонуклеотидом с концевой аминогруппой с получением конъюгированного полимера, включающего олигонуклеотид.

Краткое описание чертежей

Настоящее раскрытие можно понять лучше, а его многочисленные признаки и преимущества станут наглядными для специалистов в настоящей области техники, посредством обращения к прилагаемым чертежам.

Фиг. 1 представляет собой изображение иллюстративного способа обработки полинуклеотидов.

Фиг. 2 представляет собой изображение иллюстративного способа конъюгации.

Фиг. 3 представляет собой изображение иллюстративного способа секвенирования.

Фиг. 4 представляет собой изображение иллюстративного способа прямой конъюгации.

Фиг. 5 представляет собой изображение иллюстративного способа непрямой конъюгации.

Фиг. 6 представляет собой изображение иллюстративного способа конъюгации.

Применение одинаковых условных символов для различных чертежей указывает на одинаковые или идентичные элементы.

Осуществление изобретения

Согласно варианту осуществления, способ конъюгации предусматривает обмен связанных с биомолекулой противоионов с липофильными противоионами с получением биомолекулярного комплекса. Согласно примеру противоионы являются катионными. Биомолекулярный комплекс, такой как полинуклеотидный комплекс, можно диспергировать в неводном растворителе и конъюгировать с подложкой в присутствии неводного растворителя. Иллюстративная подложка характеризуется поверхностью, такой как керамическая, металлическая или полимерная поверхность. Согласно другому примеру подложка включает поддающуюся разбуханию полимерную частицу. В частности, биомолекулу можно конъюгировать с функциональными группами поддающегося разбуханию полимера по всей полимерной частице.

Согласно примеру конъюгированную подложку можно применять для захвата целевого полинуклеотида. Согласно конкретному примеру конъюгированный полинуклеотид можно удлинять согласно захваченному целевому полинуклеотиду. В случае полимерной частицы, включающей множественные копии конъюгированного полинуклеотида, копии конъюгированного полинуклеотида можно удлинять в соответствии с целевым полинуклеотидом с получением множественных копий комплементарной целевому полинуклеотиду цепи. Такая частица может быть пригодна в методиках секвенирования, таких как методики ионного секвенирования или секвенирования на основе регистрации изменения рН.

В частности, с помощью настоящего способа осуществляют конъюгацию в неводном растворе. Было обнаружено, что вода может конкурировать с различными химическими соединениями для конъюгации или препятствовать им, уменьшая эффективность конъюгации. Например, вода может препятствовать нуклеофильному или электрофильному замещению. Вода может конкурировать с нуклеофилом за электрофил посредством гидролиза электрофила в неактивный в отношении конъюгации фрагмент. Посредством конъюгации в неводном растворе или растворителе способы конъюгации, такие как нуклеофильное или электрофильное замещение, становятся более эффективными. Кроме того, в неводной среде можно использовать новые химические соединения для конъюгации.

Биомолекула может включать нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты (олигонуклеотиды и полинуклеотиды), полипептиды, сахариды, полисахариды, липиды и их производные или аналоги. Согласно конкретному примеру биомолекула является полипептидом или нуклеиновой кислотой, такой как полинуклеотид. Например, биомолекула может представлять собой полинуклеотид или его аналог.

Как проиллюстрировано на Фиг. 1, противоионы биомолекулы можно подвергнуть обмену на липофильные противоионы с получением биомолекулярного комплекса, который является более липофильным. Проиллюстрированной биомолекулой является полинуклеотид 102. Как проиллюстрировано, полинуклеотид 102 получают из множества полимеризированных нуклеотидов. Углеводный фрагмент (X) нуклеотида связан с фосфатной группой близлежащего нуклеотида. Каждая фосфатная группа связана с катионным противоионом (М). Согласно примеру катионный противоион (М) может представлять собой ион металла. Согласно другому примеру катионный противоион (М) может представлять собой аммоний или протон. Кроме того, полинуклеотид 102 может включать линкерную группу (L), связывающую реакционноспособную группу (W) с нуклеотидной цепью. Альтернативно, биомолекула может представлять собой аналог полинуклеотида, имеющий сходную структуру линкерной/реакционноспособной группы, и полинуклеотид может иметь реакционноспособную группу (W), удлиняющую внешнюю часть на одно или несколько оснований в дополнение к внешней части углевода (X) или вместо нее.

Согласно примеру линкерная группа (L) включает углеводородную, эфирную или полиэфирную группу или их комбинацию. Реакционноспособная группа (W) может функционировать, вступая в реакцию с функциональными группами, сформированными на подложке, такой как полимерная подложка. Согласно конкретному примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу, тиоловую, малеимидную, ацетиленовую, азидную или их комбинацию. Например, реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу или тиоловую группу. В частности, реакционноспособная группа (W) может представлять собой аминогруппу. Согласно примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой малеимидную группу. Согласно следующему примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой ацетиленовую группу. Согласно следующему примеру реакционноспособная группа (W) может представлять собой азидную группу

Полинуклеотид 102 подвергается воздействию липофильного противоиона 104. Липофильный противоион 104 может включать положительно заряженный элемент (Y), соединенный с одной или несколькими углеводородными группами (R1, R2, R3, R4) и связанный с противоионом (Z). Согласно примеру положительно заряженный элемент (Y) может представлять собой азот, фосфор, серу, мышьяк или любую их комбинацию. В частности, положительно заряженный элемент (Y) является азотом, фосфором, серой или их комбинацией. Например, положительно заряженный элемент (Y) может представлять собой азот или фосфор. В частности, положительно заряженный элемент (Y) является азотом, образующим аминогруппу с углеводородными группами (R1, R2, R3 или R4).

Положительно заряженный элемент (Y) включает одну или несколько углеводородных групп, например по меньшей мере две углеводородные группы, по меньшей мере три углеводородные группы или по меньшей мере четыре углеводородные группы. Как проиллюстрировано, положительно заряженный элемент (Y) включает четыре углеводородные группы (R1, R2, R3 или R4). Углеводородные группы (R1, R2, R3 или R4) независимо могут представлять собой алкильную группу, арильную группу, их эфирные производные или их комбинации. Согласно примеру алкильная углеводородная группа может включать метальную, этильную, пропильную или бутильную группу, их эфирное производное или их комбинацию. Например, пропильная группа может представлять собой н-пропильную, изопропильную или их комбинацию. Согласно примеру бутильная группа может представлять собой н-бутильную, изобутильную, втор-бутильную, трет-бутильную или любую их комбинацию. Иллюстративная арильная группа может включать фенильную, толильную, ксилильную или полиарильну, такую как нафтильную, их эфирные производные или любую их комбинацию.

В частности, липофильная группа [Y(R1)(R2)(R3)(R4)] может включать липофильный ион аммония, липофильный ион фосфония, липофильный ион арсония, липофильный ион сульфония или их комбинацию. Иллюстративный липофильный ион аммония включает тетраалкиламмоний, тетраариламмоний, смешаный алкил- и ариламмоний или их комбинацию. Например, иллюстративный липофильный ион аммония выбран из группы, состоящей из тетраметиламмония, тетраэтиламмония, тетрапропиламмония, тетрабутиламмония, тетрапентиламмония, тетрагексиламмония, тетрагептиламмония, тетраоктиламмония, их алкильных и арильных смесей и их комбинаций. Иллюстративный липофильный ион фосфония включает тетрафенилфосфоний. Иллюстративный липофильный ион арсония представляет собой тетраалкиларсоний, тетраариларсоний, ион смешаного алкил- и ариларсония или их комбинацию. Например, липофильный ион арсония представляет собой тетрафениларсоний. Иллюстративным липофильным ионом сульфония является ион триалкилсульфония. Ион (Z) может представлять собой ион с противоположным липофильной группе [Y(R1)(R2)(R3)(R4)] зарядом, такой как гидроксид, галоген, нитрат, карбонат, сульфат, перхлорат, фенолят, тетраалкилборат, тетраарилборат, фосфат-ион или любую их комбинацию.

У полинуклеотидного комплекса 106 в результате обмена наблюдают липофильные свойства, и его можно диспергировать в неводном растворителе. Согласно примеру неводный растворитель является полярным. Согласно следующему примеру неводный растворитель не вступает в реакцию со связывающими группами на подложке или функциональными группами полимера, такими как реакционноспособная группа (W) полинуклеотидного комплекса 106. Согласно примеру растворитель включает амид, мочевину, карбонат, простой эфир, сульфоксид, сульфон, стерически затрудненный спирт или их комбинацию. Иллюстративные амид или мочевина включают формамид, N,N-диметилформамид, ацетамид, N,N-диметилацетамид, гексаметилфосфорамид, пирролидон, N-метилпирролидон, N,N,N',N'-тетраметилмочевину, N,N'-диметил-N,N'-триметиленмочевину или их комбинацию. Иллюстративный карбонат включает диметилкарбонат, пропиленкарбонат или их комбинацию. Иллюстративный простой эфир включает тетрагидрофуран. Иллюстративный сульфоксид или сульфон включает диметилсульфоксид, диметилсульфон или их комбинацию. Иллюстративный стерически затрудненный спирт включает трет-бутиловый спирт.

После обмена или в ходе обмена полинуклеотидный комплекс 106 может быть диспергирован в неводном растворителе. Диспергированный полинуклеотидный комплекс 106 можно применять при конъюгации подложки.

Подложка может представлять собой твердую поверхность, частицу или их комбинацию. Согласно примеру подложка может представлять собой твердую поверхность. Подложка может включать плоские, вогнутые или выпуклые поверхности или любую их комбинацию. Подложка может иметь текстуру и особенности, включая следы от протравливания, пустоты или бугорки. Альтернативно, у подложки может отсутствовать какая-либо текстура или особенности. Подложка может включать капиллярные структуры, каналы, борозды, лунки или емкости. Согласно примеру подложка может представлять собой лунку. Подложка может быть пористой, полупористой или без пор. Согласно следующему примеру подложка может представлять собой фильтр или гель. Подложка может включать верхнюю часть иглы (например, массивов игл). Подложка может быть выполнена из материалов, таких как стекло, боросиликатное стекло, силикагель, кварц, плавленный кварц, слюда, полиакриламид и N-замещенные полиакриламиды, пластиковый полистирол, поликарбонат, полиметакрилат (РМА), полиметилметакрилат (РММА), полидиметилсилоксан (PDMS), кремний, германий, графит, керамика, кремний, полупроводник, диэлектрик с высоким показателем преломления, кристаллы, гели, полимеры или пленки (например, пленки из золота, серебра, алюминия или алмаза). В частности, подложка может включать твердую подложку, имеющую металлическую пленку или металлическое покрытие.

Согласно конкретному примеру подложка включает полимерные частицы, имеющие пористость, которая позволяет полинуклеотидному комплексу 106 диффундировать в полимерную частицу. В частности, полимерная частица может включать реакционноспособные функциональные группы, которые могут вступать в реакцию с реакционноспособной группой (W) полинуклеотидного комплекса 106. Согласно примеру полимерные частицы являются гидрофильными. Полимерная частица может поддаваться разбуханию. Например, полимерная частица может представлять собой гидрогель. Гидрофильная полимерная частица может иметь внешние функциональные группы, такие как гидроксильные группы или аминогруппы. Такие группы можно заменить другими функциональными группами для облегчения конъюгации с полинуклеотидным комплексом 106.

Согласно примеру полимерную частицу можно получить из стироловых полимеров, акрилатных полимеров, полиакриламидов или их комбинации. Например, полимерную частицу можно получить из полимеризированных мономеров. Мономер может представлять собой способный к радикальной полимеризации мономер, такой как виниловый мономер. В частности, мономер может включать гидрофильный мономер. Согласно примеру гидрофильный мономер может включать акриламид, винилацетат, гидроксиалкилметакрилат или любую их комбинацию. Согласно конкретному примеру гидрофильный мономер является акриламидом, таким как акриламид, включающий гидроксильные группы, аминогруппы или их комбинацию.Согласно примеру гидрофильный мономер представляет собой аминоалкилакриламид. Согласно другому примеру акриламид может представлять собой гидроксиалкилакриламид, такой как гидроксиэтилакриламид. В частности, гидроксиалкилакриламид может включать N-[трис(гидроксиметил)метил] акриламид, М-(гидроксиметил)акриламид или их комбинацию. Согласно конкретному примеру мономер включает гидроксильные группы. Согласно следующему примеру можно включить сомономер, такой как аминоакриламид, например, акриламид, функционализированный полиэтиленгликолем с концевой аминогруппой, или акрилопиперазин.

Согласно примеру полимер полимерной частицы можно получить в результате полимеризации мономера и сшивателя. Согласно примеру сшиватель включают в массовом соотношении мономер к сшивателю в диапазоне от 15:1 до 1:2, например, в диапазоне от 10:1 до 1:1, в диапазоне от 6:1 до 1:1 или даже в диапазоне от 4:1 до 1:1. В частности, сшиватель может представлять собой дивиниловый сшиватель. Например, дивиниловый сшиватель может включать диакриламид, такой как N,N'-(этан-1,2-диил)бис(2-гидроксил этил)акриламид, N,N'-(2-гидроксипропан-1,3-диил)диакриламид или их комбинация. Согласно другому примеру дивиниловый сшиватель включает этиленгликоль диметакрилат, дивинилбензол, гексаметиленбисакриламид, триметилолпропантриметакрилат, этилендиметакрилат или их комбинацию.

Согласно примеру полимерная частица может представлять собой гидрофильную частицу, такую как частица гидрогеля. Гидрогель является полимером, который может абсорбировать по меньшей мере 20% от своей массы воды, например, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 1000%, по меньшей мере 1500% или даже по меньшей мере 2000% от своей массы воды.

Полимерные частицы могут иметь необходимый размер частиц, например размер частицы, составляющий не более 100 мкм, не более 30 мкм или не более 3 мкм. Средний размер частиц представляет собой средний диаметр частицы. Например, средний размер частицы может составлять не более 2 мкм, например не более 1,5 мкм, не более 1,1 мкм, не более 0,8 мкм, не более 0,6 мкм, не более 0,5 мкм или даже не более 0,3 мкм. Согласно конкретному примеру средний размер частицы может находиться в диапазоне от 0,1 мкм до 100 мкм, например, в диапазоне от 0,1 мкм до 50 мкм или в диапазоне от 0,1 мкм до 1,1 мкм.

Согласно следующему примеру множество частиц является монодисперсным и может иметь необходимый низкий коэффициент вариации, например коэффициент вариации, составляющий не более 20%. Коэффициент вариации (CV) определяют как 100-кратное стандартное среднеквадратическое отклонение, деленное на среднее, причем "среднее" представляет собой средний диаметр частицы, а стандартное отклонение представляет собой стандартное отклонение размера частицы. Альтернативно, "среднее" может представлять собой либо z-средний, либо модовый диаметр частицы. В соответствии с обычной практикой CV рассчитывают по основной моде, т.е. основному пику, таким образом исключая неосновные пики, относящиеся к агрегатам. Таким образом, некоторые частицы с более низким или превышающим моду размером можно исключить при расчете, который, например, может быть основан на приблизительно 90% от общего числа детектируемых частиц. Такое определение CV можно осуществить на дисковой центрифуге CPS или счетчике Культера. Например, коэффициент вариации (CV) полимерных частиц может составлять не более 15%, например, не более 10%, не более 5%, не более 4,5%, не более 4,0%, не более 3,5% или даже не более 3,0%.

Согласно следующему примеру гидрофильная полимерная частица в воде может составлять не более 50 мас.% полимера, например, не более 30 мас.% полимера, не более 20 мас.% полимера, не более 10 мас.% полимера, не более 5 мас.% полимера или даже не более 2 мас.% полимера.

Согласно дополнительному примеру полимерная частица может иметь пористость, позволяющую диффузию полинуклеотидов, белков или ферментов. Согласно примеру полимерные частицы могут иметь пористость, позволяющую проникновение белков, имеющих размер, составляющий по меньшей мере 50 килодальтон, например, по меньшей мере 100 килодальтон, по меньшей мере 200 килодальтон, по меньшей мере 250 килодальтон или даже по меньшей мере 350 килодальтон.

Независимо от того твердая поверхность или полимерная частица, такие как описанные выше полимерные частицы, полинуклеотидный комплекс 106, проиллюстрированный на Фиг. 1, можно конъюгировать с подложкой в присутствии неводного растворителя. Например, полимер подложки может включать гидроксильные группы. Часть гидроксильных групп можно заменить на альтернативные функциональные группы для облегчения конъюгации с полинуклеотидным комплексом, таким как полинуклеотидный комплекс 106, проиллюстрированный на Фиг. 1.

Подложку можно подвергнуть прямой конъюгации или непрямой конъюгации. Согласно конкретному примеру функциональные группы полимера, такие как гидроксильная группа, могут подвергаться нуклеофильному или электрофильному замещению для конъюгации полимера с полинуклеотидом. Например, связывающая группа подложки может включать один нуклеофил или электрофил, а концевая реакционноспособная группа полинуклеотида может включать другой нуклеофил или электрофил. Полинуклеотид можно связать с полимерной частицей посредством нуклеофильного или электрофильного замещения. Согласно примеру прямая конъюгация полимера, включающего гидроксильную группу, может включать замену гидроксильной группы на сульфоэфирную, которую затем конъюгируют с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, включающим реакционноспособную аминогруппу или тиоловую группу. Например, гидроксильные группы на полимерной частице можно активировать посредством замены по меньшей мере части гидроксильных групп на сульфоэфирную группу. Иллюстративные сульфоэфирные группы могут быть получены от трезил-, метилсульфонил-, тозил- или фторбензолсульфонилхлорида или любой их комбинации, с получением функциональной сульфоэфирной группы вместо по меньшей мере части гидроксильных групп. Сульфоэфиры могут содействовать замене нуклеофиллами сульфоэфира. Сульфоэфир дополнительно может вступать в реакцию с высвобожденным хлором с образованием хлор-содержащих групп, которые можно применять в процессе конъюгации частиц. В соответствии с другим вариантом, гидроксильные группы можно заменить на галогеновые группы, которые могут вступать в реакцию с реакционноспособными группами полинуклеотидного комплекса. Согласно следующему примеру аминогруппы сомономеров полимерного полимера могут вступать в реакцию с реакционноспособными группами полинуклеотидного комплекса.

В соответствии с другим вариантом, конъюгация может быть непрямой, при которой функциональные группы полимера, такие как гидроксильные группы, заменяют посредством серии замещений, что в результате приводит к образованию функциональной группы (связывающей группы), которая может вступать в реакцию с реакционноспособной группой полинуклеотидного комплекса. Например, на Фиг. 2 проиллюстрирован полимер 202, который включает гидроксильные группы, которые могут быть замещены функциональными группами посредством серии из одного или нескольких замещений.

Например, в 204 по меньшей мере часть гидроксильных групп может быть заменена функциональной группой (А), такой как сульфоэфирная, отличный от фтора галоген или их комбинация. Такие функциональные группы (А) затем можно заменить, как проиллюстрировано на 206, на функциональную группу (В), такую как азидная, фталимидная, тиоэфирная, диаминогруппа с защищенным N, аминотиоэфирная группа с защищенным N, группа амино(олигонуклеотида) или их комбинация. Необязательно, такие функциональные группы (В) затем можно активировать, как проиллюстрировано на 208, при помощи функциональной группы (С), такой как аминогруппа, тиоловая или их комбинация. Кроме того, такие проиллюстрированные на 208 функциональные группы (С) можно заменить на функциональные группы (D), которые проиллюстрированы на 210, такие как группа моноамид-моно(сложный NHS-эфир)дикарбоновой кислоты, сукцинимидтиоэфир(олигонуклеотида) или их комбинация. Более того, проиллюстрированную на 210 функциональную группу (D) можно заменить, как проиллюстрировано на 212, на функциональную группу (Е), такую как группа моноамид-(амино-олигонуклеотид)-моноамиддикарбоновой кислоты. В связи с этим, функциональные группы исходного полимера можно подвергнуть одной или нескольким сериям замещений, что делает реакционные центры пригодными для вступления в реакцию с полинуклеотидным комплексом.

Альтернативно, вместо полимера, включающего гидроксильные группы, можно применять полиакриламид, имеющий функциональную аминогруппу. Например, проиллюстрированные гидроксильные группы можно заменить на группу простого полиэфира с концевой аминогруппой (например, PEG с концевой аминогруппой). Вместе с функциональной аминогруппой иллюстрированный способ можно начинать, например, на (С).

Согласно конкретному примеру функциональная группа (А) на 204 может представлять собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию. В частности, галогеном является отличный от фтора галоген, такой как хлор. Функциональная группа (А) может вступать в реакцию с полинуклеотидным комплексом 106, где линкерная группа (L) представляет собой углеводородную или полиэфирную группу, а реакционноспособная группа (Р) представляет собой аминогруппу в неводном растворителе, с получением функциональной группы (В) в 206, такой как группа амино(олигонуклеотида). Согласно другому примеру, в котором функциональную группу (А) в 204 заменяют функциональной группой (В) в 206, функциональная группа (А) может представлять собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию, функциональная группа (В) может представлять собой азидную, фталимидную, диаминогруппу с одним защищенным N или аминотиоэфирную группу с защищенным N. Функциональную группу (В) дополнительно можно активировать до функциональной группы (С), такой как аминогруппа. Функциональную аминогруппу (C) можно дополнительно активировать при помощи функциональной группы (D), такой как (моно-амид)-(моно-NHS-эфир)дикарбоновая кислота. Функциональную группу (D) можно дополнительно заместить на функциональную группу (Е), такую как группа (амино(олигонуклеотид))-дикарбоновой кислоты, посредством реакции с полинуклеотидным комплексом 106, который включает линкерную группу (L), представляющую собой углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную функциональную группу (Р), представляющую собой аминогруппу в неводном растворителе. Альтернативно, полимерная частица может представлять собой сополимер, включающий сомономер, который включает функциональные аминогруппы. Такие функциональные аминогруппы могут вступать в реакцию с

Согласно следующему примеру функциональная группа (А) представляет собой сульфоэфирную группу, галоген или их комбинацию. Функциональной группой (В) является азидная группа. В этом случае функциональную группу (В) можно заместить на функциональную группу (С), такую как группу (олигонуклеотид)триазола. Полинуклеотидный комплекс включает линкерную группу (L), представляющую собой углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную функциональную группу (Р), представляющую собой ацетиленовую группу.

Согласно дополнительному примеру функциональная группа (А) может представлять собой сульфоэфир, галоген или их комбинацию. Функциональную группу (А) замещают на функциональную группу (В), такую как тиоэфирная группа. Тиоэфирную функциональную группу (В) можно заместить на функциональную группу (С), такую как тиоловая, которую затем замещают функциональной группой (D), такой как группа сукцинимидтиоэфир(олигонуклеотида). Согласно такому примеру полинуклеотидный комплекс может включать линкер (L), такой как углеводород или простой полиэфир, и реакционноспособную группу (Р), такую как малеимидная.

Другие химические способы активации предусматривают включение множества этапов для преобразования определенной функциональной группы с целью образования конкретных необходимых связей. Например, модифицированную сульфонатом гидроксильную группу можно преобразовывать в нуклеофильную группу посредством нескольких способов. Согласно примеру реакция сульфоэфира с азидным анионом дает в результате замещенный азидом гидрофильный полимер. Азид можно непосредственно использовать для конъюгации с замещенной ацетиленом биомолекулой посредством "клик-химии", такую реакцию можно осуществить с медным катализом или без него. Необязательно, азид можно преобразовать до амина посредством, например, каталитического восстановления при помощи водорода или восстановления при помощи органического фосфина. Полученный в результате амин можно затем преобразовать в электрофильную группу при помощи различных реагентов, таких как диизоцианаты, сложные бис-NHS-эфиры, хлорангидрид циануровой кислоты или их комбинация. Согласно примеру применение диизоцианатов приводит к образованию группировки мочевины между полимером и линкером, что приводит в результате к образованию остаточной изоцианатной группы, которая может вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием группировки мочевины между линкером и биомолекулой. Согласно другому примеру применение сложных бис-NHS-эфиров приводит к образованию амидной связи между полимером и линкером и остаточной группы сложного NHS-эфира, которая способна вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием амидной связи между линкером и биомолекулой. Иллюстративный сложный бис-NHS-эфир включает сложные бис-сукцинимидил-С2-С12-алкиловые эфиры, такие как бис-сукцинимидилсуберат или бис-сукцинимидилглутарат. Согласно следующему примеру применение хлорангидрида циануровой кислоты приводит к образованию аминотриазинового мостика между полимером и линкером и двух остаточных хлортриазиновых групп, одна из которых способна вступать в реакцию с замещенной амином биомолекулой с образованием аминотриазинового мостика между линкером и биомолекулой. Другие нуклеофильные группы можно включить в частицу посредством сульфонатной активации. Например, с помощью реакции сульфированных частиц с анионом тиобензойной кислоты и гидролиза последующего тиобензоата включают тиол в частицу, который может в дальнейшем вступать в реакцию с замещенной малеимидом биомолекулой с образованием тиосукцинимидного мостика с биомолекулой. Тиол также может вступать в реакцию с бромацетильной группой.

Согласно следующему примеру полимерную частицу можно обработать с получением функциональной аминогруппы, которую можно конъюгировать посредством применения сложного бис-NHS-эфира или дисукцинимидилкарбоната. Иллюстративный сложный бис-NHS-эфир включает сложные бис-сукцинимидил-С2-С12-алкиловые эфиры, такие как бис-сукцинимидилсуберат или бис-сукцинимидилглутарат. Например, полимерную частицу, такую как частица, включающая доступные гидроксильные группы, можно обработать с заменой гидроксильных групп на галоген, такой как хлор. Частицу дополнительно можно обработать в кислотных условиях посредством полиэфира с концевой аминогруппой, защищенной tBOC (N-трет-бутоксикарбонилом), таким как полиэтиленгликоль (PEG), с получением функциональной аминогруппы, которую можно в дальнейшем использовать для конъюгации полимерной частицы. В соответствии с другим вариантом, полимерную частицу можно полимеризировать с использованием мономеров, которые обеспечивают функциональную аминогруппу. Полимерную частицу, включающую аминогруппу можно дополнительно обработать с применением бис-NHS-эфира или дисукцинимидилкарбоната, который дополнительно подвергают воздействию олигонуклеотида с концевой аминогруппой, с получением в результате конъюгированной с олигонуклеотидом полимерной частицы.

После конъюгации полимерная частица может иметь плотность полинуклеотидов, называемую нуклеотидной плотностью, составляющую по меньшей мере 7×10⁴ на мкм³. Например, нуклеотидная плотность может составлять по меньшей мере 10⁵ на мкм³, например, по меньшей мере 10⁶ на мкм³, по меньшей мере 2×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 5×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 8×10⁶ на мкм³, по меньшей мере 1×10⁷ на мкм³ или даже по меньшей мере 3×107 на мкм³.

Согласно конкретному примеру конъюгированные частицы можно применять в методиках разделения или методиках секвенирования. Например, конъюгированные частицы можно применять для захвата целевых полинуклеотидов. Согласно примеру конъюгированные с полимером полинуклеотиды можно удлинять согласно захваченным целевым полинуклеотидам. Такие конъюгированные частицы можно применять в методиках секвенирования, таких как методики ионного секвенированния или секвенирования на основе регистрации изменения рН. Как проиллюстрировано на Фиг. 3, множество конъюгированных полимерных частиц 304 может быть расположено в растворе одновременно со множеством целевых полинуклеотидов 302. Множество частиц 304 можно конъюгировать с полинуклеотидами-зондами, связывающимися с целевыми полинуклеотидами 302. Например, конъюгированные частицы 304 могут включать олигонуклеотидную цепь, комплементарную части целевых полинуклеотидов 302.

Согласно конкретному варианту осуществления, частицы 304 и полинуклеотиды 302 подвергают амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). Например, капли 306 или 308 дисперсной фазы получают как часть эмульсии, и они могут вк