Косметическое применение дедифференцированных растительных клеток

Косметическое применение дедифференцированных растительных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается области косметики и относится к применению дедифференцированных растительных клеток Rosa sp. в качестве активного агента для эстетического ухода за кожей и волосами.

Настоящее изобретение также относится к клеточной линии дедифференцированных растительных клеток, полученных из кустовой розы Lancôme, которые способны к восстановлению регенерационной способности кожи и эффективны для такого восстановления.

В частности, настоящее изобретение относится к клеточной линии дедифференцированных растительных клеток, полученных из кустовой розы сорта Lancôme, которые функциональны и эффективны в восстановлении регенерационной способности модели реконструированной кожи с низким регенеративным потенциалом, и способности к самообновлению резервуара кожных стволовых клеток, SKP (skin-derived precursors, предшественники, происходящие из кожи), полученного с помощью биопсий кожи человека (волосистая часть головы и крайняя плоть).

Кожа представляет собой ткань, которая постоянно самообновляется на протяжении всей жизни человека. Это возобновление поддерживается с помощью кератиноцитов, которые располагаются в базальном слое эпидермиса. Это популяция клеток содержит, с одной стороны, стволовые клетки, немногочисленные клетки, которые характеризуются весьма существенной способностью к долгосрочному росту, а также способностью к самообновлению, и, с другой стороны, клетки, называемые предшественниками, которые активно размножаются и, вероятно, дифференцируются при переходе к роговому слою.

Относительно волосяных фолликулов известно, что взаимодействие эпителиального и дермального слоя имеет важное значение для морфогенеза и повторного роста волос, а также для поддержания цикла волосяного фолликула. Поддержание функциональности этих двух слоев зависит от наличия и от активности различных резервуаров стволовых клеток. Первый резервуар эпителиальных стволовых клеток был идентифицирован в области, называемой «вздутие», у грызунов (Cotsarelis et al., Cell, 1990, 61:1329). После этого первого открытия были выявлены другие резервуары кератиноцитов стволовых клеток, и оказалось, что у людей несколько более или менее активных резервуаров встроены в наружное корневое влагалище (ORS, outer root sheath) волосяного фолликула (Rochat et al., Cell, 1994, 76:1063; Commo et al., Differentiation, 2000, 66:157; Jaks et al., Nature Genetics, 2008, 40:1291).

Что касается дермального слоя, клетки, называемые SKPs (skin-derived precursors предшественники, происходящие из кожи), которые находятся в кожных сосочках и в соединительной ткани влагалища, были идентифицированы как мультипотентные клетки, участвующие в индукции роста волос и в восстановлении кожи у мышей (Biernaskie et al., Cell Stem Cell, 2009, 5:310). Несколько групп продемонстрировали присутствие SKPs в тканях человека и, в частности, в кожных сосочках волосяных фолликулов (Toma et al., Stem Cells, 2005, 23:727; Hunt et al., Stem Cells, 2008, 26:163).

Старение кожных слоев выражается, в частности, в значительной модификации эпидермальной поверхности, затемнении и поверхностных неоднородностях (потеря гладкого вида), в потере эластичности, появлении морщин, в замедлении восстановления/выздоровления после повреждений, в утончении эпидермиса и/или в потере и/или побелении волос, в снижении густоты волос и т.д.

Все эти видимые изменения в коже и волосах указывают на изменение регенерационной способности кожных слоев. Они также позволяют предположить, что основные биологические функции, обеспечивающие гомеостаз и обновление этих тканей, ослабляются с возрастом.

Существующие данные позволяют предположить, что с возрастом количество регенеративных клеток эпидермиса не уменьшается (Giangreco et al., Aging Cell, 2008, 7:250), но что их функциональность, как представляется, сильно зависит от модификаций их микросреды, контролирующих регенеративную способность базального слоя. Таким образом, снижение качества кожи, связанное с возрастом, по-видимому, связано с измененной регенеративной способностью этих клеток. Среди основных компонентов микроокружения клеток могут быть упомянуты межклеточные взаимодействия, физические ограничения базального слоя, и паракринные факторы, секретируемые окружающими клетками и резидентными клетками дермального слоя.

Равным образом, уменьшение значений таких параметров, как количество и/или качество волос, которое связано с облысением или также с возрастным старением, позволяет предположить измененную регенеративную способность. Действительно, было показано, что фолликулы алопецильной кожи головы уменьшаются в длину и содержат меньше пролиферирующих кератиноцитов по сравнению с таковыми на неалопецильной коже головы (Ashrafussaman et al., Acta Hisflochem Cytochem, 2010, 43:9). Более того, недавние исследования показывают, что недостаток в превращении эпителиальных стволовых клеток в клетки-предшественники, играет важную роль в андрогенной алопеции (Garza et al., J Clin Invest, 2010). В дермальном слое клетки, произошедшие из кожных сосочков из алопецильной кожи головы, размножаются in vitro не так быстро и, как оказывается, подвержены влиянию преждевременного старения, если сравнивать их с клетками, полученными из неалопецильной кожи головы (Bahta et al., J Invest Dermatol, 2008, 128:1088), a в тканях человека наблюдается снижение числа SKPs с возрастом (Gago et al., Stem Cells, 2009, 27:1164). Все эти наблюдения позволяют предположить модификацию регенеративной способности частей волосяного фолликула в связи с алопецией и/или возрастным старением.

Таким образом, для того, чтобы найти решения для противодействия изменениям кожи и волос, связанных со старением, особое внимание следует обратить на регенеративные клетки, или даже на стволовые клетки кожи и волос.

Дедифференцированные растительные клетки возникли благодаря исследованиям Хаберланда в 1902 году. За последние 40 лет культуры растительных клеток использовали для производства нужных метаболитов или для размножения одинаковых растений (соматического эмбриогенеза). Такая биотехнология растений основана на концепции клеточной тотипотентности: «любая растительная клетка способна к дедифференцировке и к регенерации другой особи, идентичной той, от которой она произошла». Дедифференцированная растительная клетка является растительной клеткой, полученной из органа (лист, стебель, корень, лепесток, и т.д.), который был размещен в культуре и который снова принимает дедифференцированную форму, то есть теряет свою специфичность листа, стебля, корня или лепестка и снова становится, вероятно, способным дать начало целому растению.

Недифференцированная клетка растения является эквивалентом реальной растительной стволовой клетки, полученной из меристематических клеток растения, и не имеющей органспецифического биологического прошлого.

WO 2009/151302 и КР 2009-0118877 описывают противовозрастные или антиоксидантные композиции, содержащие недифференцированные клетки растений, полученные из камбия Panax ginseng или из растения рода Taxus.

ЕР 1985280 описывает применение дедифференцированных растительных клеток, полученных из растения семейства Rosaceae и, в частности, из яблони Malus domestica, для защиты стволовых клеток кожи, которая подвергается различным внутренним и внешним стрессовым воздействиям, в частности, для лечения повреждений кожи или волос, связанных с возрастом.

ЕР 1699423 описывает применение лиофилизата дедифференцированных растительных клеток, полученных из галофильного растения, для омоложения внешнего вида кожи.

DE-A-102009027361 и ЕР 2266529 описывают применение дедифференцированных растительных клеток, в частности, полученных из растения рода Malus, для лечения кератиновых волосяных волокон, в частности, для их защиты от УФ-излучения, или для лечения постаревшей кожи.

ЕР 0909556 описывает применение экстракта растения из семейства Rosaceae, в частности, розы, возможно, полученного из недифференцированных растительных клеток, в качестве антагониста брадикинина для лечения различных состояний, в частности, кожи.

WO 2011121051 описывает препарат, полученный из культуры дедифференцированных нестимулированных клеток дерева аргания, их применение для лечения старения кожи, воспаления и образования рубцов, и их производство.

WO 200482643 описывает косметическую композицию, содержащую дедифференцированные, стимулированные растительные клетки Olibanum, Boswelia or Negundo и обладающие тонизирующим эффектом.

ЕР 2436759 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Solanaceae и обладающую антивозрастным эффектом.

ЕР 2436758 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Ginkgoaceae и обладающую усиленным антиоксидантным эффектом.

ЕР 2436757 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Asteraceae и обладающую усиленным противовоспалительным эффектом.

WO 2010137879 описывает линию недифференцированных клеток, полученную из камбия растений семейства Salicaceae и обладающую усиленным противовоспалительным эффектом.

ЕР 1064932 описывает применение дедифференцированных клеток, проявляющих дезодорирующий эффект.

ЕР 1244464 описывает применение экстрактов дедифференцированных клеток рода Leontopodium в качестве агента, защищающего от ультрафиолета.

Насколько известно заявителю, ни один документ, таким образом, не ссылается на получение линии дедифференцированных клеток кустовой розы, обладающей конкретными косметическими свойствами, описанными в данном описании.

Существует потребность идентифицировать технические решения для улучшения функциональности и/или активности регенеративных клеток, в том числе стволовых клеток кожи или волос, для сохранения качества и функциональности кожи, а также качества волос, их густоты и формы, в течение всей жизни человека, и, в частности, для профилактики и/или лечения эффектов, оказанных на внешний вид кожи или волос и связанных с возрастом.

В частности, существует потребность в создании новых активных агентов для противодействия недостаткам в обновлении ткани кожи или волос, в частности, для сокращения истончения эпидермиса, улучшения внешнего вида поверхности кожи, коррекции морщин, для замедления и/или подавления выпадения волос или для замедления и/или ингибирования побеления волос.

Целью настоящего изобретения является, в частности, удовлетворение этих потребностей.

В соответствии с одним из своих первых аспектов, настоящее изобретение относится к косметическому применению дедифференцированных растительных клеток растения рода Rosa sp. и, в частности, кустовой розы Lancôme или экстракта или лиофилизата указанных клеток в качестве активного агента для ухода за стареющей кожей или стареющими волосами.

Неожиданно изобретатели обнаружили, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток, оказались особенно функциональными и эффективными для восстановления in vitro регенеративной способности модели реконструированной кожи, полученной из популяции кератиноцитов с уменьшенной численностью эпидермальных стволовых клеток и клеток-предшественников. Увеличение толщины эпидермиса и весьма заметное улучшение морфологических качеств (организация базального слоя, стратификация и дифференциация и т.д.) были обнаружены после 3 недель культивирования, в том числе - 2 недель обработки.

Изобретателями было показано что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат из указанных клеток, оказывают про-регенерирующий эффект, по меньшей мере частично, посредством оптимизации сообщения между эпидермисом и дермой. В самом деле, авторы изобретения наблюдали, что лечение реконструированной кожи с уменьшенным регенеративным потенциалом с применением дедифференцированных растительных клеток розы из настоящего изобретения или экстракта или лиофилизата указанных клеток, индуцирует экспрессию многочисленных диффузабельных биологических факторов и, в частности, KGF (Keratinocyte Growth Factor, фактор роста кератиноцитов), известного своим благотворным влиянием на регенерацию эпидермиса. Таким образом, авторы изобретения наблюдали, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток, оказались особенно функциональными и эффективными для индукции производства кожей физиологических факторов, которые восстанавливают регенерационную способность в базальном слое, включающем в себя стволовые клетки и клетки-предшественники.

Опять же неожиданно, изобретатели обнаружили, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток оказались особенно эффективными для стимулирования способности к самообновлению резервуара стволовых клеток кожи, SKPs, полученных из биопсий человека (волосистая часть головы и крайняя плоть). Таким образом, можно было наблюдать увеличение способности к самообновлению SKPs примерно на 65% после лечения в течение 10 дней. Это оценочное исследование активного агента позволяет сделать вывод о том, что способность к самообновлению SKPs in vitro может подвергаться положительному влиянию обработки дедифференцированными клетками или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток.

Неожиданно, авторы изобретения также показали, что дедифференцированные растительные клетки розы или экстракт или лиофилизат указанных клеток обладают способностью стимулировать или восстанавливать регенеративную способность кожи, в то время как соединения, описанные на предшествующем уровне техники как имеющие кожно-регенерирующие свойства, такие как ретинол, не оказали заметного эффекта при тех же условиях тестирования.

Стимуляция самообновления регенеративных клеток кожи, дермы и волосяного фолликула делает возможным улучшение их функциональности с пользой для кожи и для волос. Это стимулирующее влияние на этот резервуар кожных стволовых клеток, предпочтительно, делает возможным сохранение или даже восстановление биологических функций этих клеток с косметической пользой для кожи и для волос.

Применительно к настоящему изобретению термин «кожа» означает всю кожную поверхность индивида, в том числе волосистую часть головы.

Применительно к настоящему изобретению термин «волос» предназначен для обозначения комплекса, содержащего волосяной стержень и волосяной фолликул.

Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к косметическому применению дедифференцированных растительных клеткок из растения рода Rosa sp., в частности, кустовой розы Lancôme или экстракта или лиофилизата указанных клеток в качестве активного агента для лечения и/или профилактики эстетического дефекта, следующего за недостатком в тканевом обновлении стареющей кожи или стареющих волос.

Применительно к настоящему изобретению термин «предотвращение» означает снижение риска проявления рассматриваемого явления.

Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение направлено на противодействие недостатку в тканевом обновлении стареющей кожи или волос, в частности, на сокращение истончения эпидермиса или кожи, улучшение внешнего вида поверхности кожи, коррекцию морщин, замедление и/или ингибирование потери волос или замедление и/или ингибирование побеления волос.

В соответствии с еще одной из его целей, настоящее изобретение относится к косметической композиции, включающей в качестве активного агента по меньшей мере одну дедифференцированную растительную клетку растения рода Rosa sp. или экстракт или лиофилизат из указанных клеток, при этом указанные дедифференцированные растительные клетки получают путем размещения клеток растения рода Rosa sp. в культуре в культуральной среде, содержащей по меньшей мере NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂⋅2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄⋅H₂O; ZnSO₄⋅7H₂O; Na₂MoO₄⋅2H₂O; CuSO₄⋅5H₂O; FeSO₄⋅7H₂O; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl и сахарозу; и, возможно, кинетин, Kl, Na₂EDTA⋅2H₂O и/или нафталинуксусную кислоту.

Согласно другому его предмету, настоящее изобретение относится к косметической композиции, включающей в качестве активного агента по меньшей мере одну дедифференцированную растительную клетку, полученную из кустовой розы Lancôme, или экстракт или лиофилизат указанной клетки. Согласно другому его предмету, настоящее изобретение относится к косметическому способу ухода за стареющей кожей или стареющими волосами, содержащему по меньшей мере одну стадию, состоящую во введении в качестве активного агента по меньшей мере, одной дедифференцированной растительной клетки растения рода Rosa sp. или экстракта или лиофилизата указанной клетки индивиду, нуждающемуся в этом.

Согласно еще одному варианту реализации, дедифференцированные растительные клетки растения рода Rosa sp, или экстракт или лиофилизат указанных клеток, в соответствии с изобретением, могут быть введены перорально или местно. Согласно одному предпочтительному варианту реализации изобретение применяется наружно.

В соответствии с одним предпочтением настоящего изобретения, активный агент из настоящего изобретения делает возможным стимулирование дермальных клеток волосяного фолликула.

Опять же предпочтительно, активный агент из настоящего изобретения делает возможным стимулировать самообновление стволовых клеток или клеток-предшественников кожи или волос, а также улучшить их функциональность с целью оказания благотворного влияния в отношении кожи и волос, в частности, стареющих кожи и волос.

В соответствии с другим предпочтением, активный агент из настоящего изобретения делает возможным сохранить или даже восстановить биологические функции резервуара стволовых клеток кожи и волос.

Дедифференцированные растительные клетки и способ их получения Применительно к настоящему изобретению термин «дедифференцированная клетка растения» предназначен для обозначения любой клеточной линии, полученной из органов кустовой розы рода Rosa sp. и полученной посредством конкретных условий культуры in vitro, которая больше не проявляет какого-либо характера специализации и которая способна, под действием индукции, к любой дифференциации в соответствии с ее геномом и к созданию из себя самой целого растения, сходного с растением, из которого она берет свое начало. Такие клетки способны жить сами по себе, не находясь в зависимых отношениях с другими клетками.

Дедифференцированные растительные клетки отличаются от недифференцированных клеток растений, которые естественным образом существуют в растениях.

Применительно к настоящему изобретению термин «дедифференцированная клетка растения» обозначает штамм, полученный с помощью культуры in vitro или in vivo, полученного из органов кустовой розы Lancôme, способный дифференцироваться, и/или приобретать новые характеристики специализированной клетки, под действием индукции в любой тип клеток (тотипотентных) или в несколько типов клеток (плюрипотентных), в частности, в эмбриогенные или меристематические клетки. В нормальных условиях растительные клетки экспрессируют примерно 20% их генома, при этом остальные 80% экспрессируются только в ответ на особые условия окружающей среды. Культивирование этих клеток in vitro при определенных условиях культивирования делает возможным «перепрограммировать» клетки и, таким образом, получить доступ к этой части генома, не экспрессирующейся в целом растении. Некоторые соединения, которые трудно получить с помощью экстракции из растений, становятся более доступными в клеточных культурах.

Таким образом, в качестве преимущества, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению позволяют получить доступ к новым соединениям, не присутствующим в целом растении, или значительно увеличить экспрессию молекул, которые известны, но редки в целом растении.

Дедифференцированные растительные клетки из настоящего изобретения могут быть получены из любого растения рода Rosa sp. Эти клетки могут быть получены из растительного материала, полученного из целых растений или из частей растений, таких как листья, стебли, цветы, лепестки, чашелистики или корни, культивируемые in vivo или in vitro.

Термин «культура in vivo» предназначен для обозначения любого культивирования обычного типа, то есть в грунте на открытом воздухе или в теплице, либо еще где-то вне грунта.

Термин «культура in vitro» предназначен для обозначения всех техник, известных специалистам в данной области, для искусственного получения растения или части растения. Давление отбора, налагаемое физико-химическими условиями во время роста растительных клеток in vitro, позволяет получить стандартизированный растительный материал, который доступен в течение всего года, в отличие от растений, выращиваемых in vivo.

Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, используемое растение получают из культуры in vivo.

Предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из по меньшей мере одного листа растения рода Rosa sp.

Род Rosa насчитывает более 200 видов, среди которых можно упомянуть Rosa alba, Rosa alpina, Rosa canina, Rosa cinnamonea, Rosa gallica, Rosa repens, Rosa rubrifolia, Rosa rubiginosa, Rosa sempervirens, Rosa spinosissima, Rosa stylosa, Rosa domendosa, или Rosa villosa Более предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из кустовой розы Lancôme, а более конкретно - из кустовой розы, называемой роза Lancome delboip. Такой куст является коммерчески доступным, например, в компании DELBARD (Франция).

Наиболее предпочтительно, дедифференцированные растительные клетки в соответствии с настоящим изобретением получают с применением в качестве исходного продукта листьев кустовой розы Lancôme delboip или клеток, полученных из указанных листьев.

Кустовая роза Lancôme является чайным гибридом, женские корни которого являются гибридом, полученным путем скрещивания Dr. Albert Schweitzer×[Michèle Meilland×Bayadère], который был опылен сортом Melmet.

В зависимости от выбранного способа культивирования и, в частности, в зависимости от выбранной культуральной среды, можно получить, из одного и того же растения дедифференцированные растительные клетки, имеющие разные характеристики.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению получают из растительного материала, полученного из листьев кустовой розы Lancôme.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации, культуральная среда, подходящая для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению, включает в себя гормоны, которые в природе присутствуют в растениях.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации, дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme получают с помощью способа, включающего в себя следующие стадии:

a) получение листьев розы Lancôme или клеток, полученных из указанных листьев,

b) культивирование листьев или клеток, полученных на стадии а), в присутствии по меньшей мере одного растительного гормона, таким образом, чтобы получить дедифференцированные клетки, и

c) выделение дедифференцированных клеток, полученных в конце стадии b).

На стадии а) термин «листья» охватывает целые листья и фрагменты листьев. На стадии а) клетки, происходящие из листьев, могут быть получены в соответствии с любым способом, хорошо известным специалистам в данной области.

Предпочтительно, листья или клетки, полученные из листьев, предоставляются в аксеничной форме (освобожденные от любого биологического загрязнителя).

На стадии b) данного способа листья или клетки, полученные из листьев, культивируют в подходящей культуральной среде, которая содержит по меньшей мере один растительный гормон. В некоторых вариантах реализации указанная культуральная среда содержит множество растительных гормонов, например, два или три растительных гормона.

Предпочтительно, культуральная среда содержит по меньшей мере один гормон, и полностью предпочтительно - по меньшей мере один фитогормон. Фитогормоны включают в себя, в частности, ауксины, цитокинины и гиббереллины.

Ауксины, которые особенно подходят для изобретения, представляют собой в основном IAA (indole-3-acetic acid, индол-3-уксусная кислота), IBA (indolebutyric acid, индолилмасляная кислота), фенилуксусную кислоту и NAA (naphthaleneacetic acid, нафталинуксусная кислота). Предпочтительно, 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) исключается из ауксинов, которые подходят для настоящего изобретения, так как является неприродным соединением.

Наиболее важные цитокинины, вовлеченные в удлинение клеток, которые особенно подходят для настоящего изобретения, представляют собой кинетин (N-(фуран-2-илметил)-7Н-пурин-6-амин; CAS Ref n° 525-79-1), зеатин (2-метил-4-(7Н-пурин-6-иламино) бут-2-ен-1-ол; CAS Ref n° 1637-39-4) и бензиладенин (N-бензил-7Н-пурин-6-амин; CAS Ref n° 1214-39-7). Гиббереллины образуют семейство растительных гормонов или фитогормонов, которое охватывает более ста соединений или примерно около того; эти соединения перечислены согласно их порядковому номеру GA1, GA2, …/… GA126. Различные гиббереллины очень близки друг к другу по структуре. Гиббереллины, которые особенно подходят для настоящего изобретения, в основном получают из корней и включают в себя очень большое число производных, наиболее важными из которых являются гибберелловая кислота, называемая также гиббереллин A3, и гиббереллины А1 и А12.

На стадии b) настоящего способа растительный(ые) гормон(ы) предпочтительно выбирают из индол-3-уксусной кислоты, индолилмасляной кислоты, фенилуксусной кислоты, нафталинуксусной кислоты, кинетина, зеатина, бензиладенина, гибберелловой кислоты и гиббереллинов А1, A3 и GA3. На стадии b) может быть использована комбинация растительных гормонов, например комбинация нафталинуксусной кислоты и кинетина.

Согласно одному варианту реализации, культуральная среда, которая подходит для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению содержит по меньшей мере NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂⋅2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄⋅4H₂O; ZnSO₄⋅7H₂O; Na₂MoO₄⋅2H₂O; CuSO₄⋅5H₂O; FeSO₄⋅7H₂O; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl и сахарозу; и, возможно, Kl; кинетин, Na₂EDTA⋅2H₂O, и/или нафталинуксусную кислоту. Согласно другому варианту реализации, культуральная среда, которая подходит для получения дедифференцированных растительных клеток по настоящему изобретению содержит по меньшей мере NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂⋅2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄⋅4H₂O; ZnSO₄⋅7H₂O; Kl; Na₂MoO₄⋅2H₂O; CuSO₄⋅5H₂O; Na₂EDTA⋅2H₂O; FeSO₄⋅7H₂O; миоинозитол; никотиновую кислоту; пиридоксин HCl; тиамин HCl; нафталинуксусную кислоту; кинетин и сахарозу.

Преимущественно, культуральная среда может содержать от 1200 до 2000 мг/л NH₄NO₃; от 1500 до 2100 мг/л KNO₃; от 300 до 500 мг/л CaCl₂⋅2H₂O; от 150 до 200 мг/л MgSO₄; от 153 до 187 мг/л KH₂PO₄; от 10 до 30 мг/л MnSO₄⋅4H₂O; от 5 до 10 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O; от 0 до 0.91 мг/л Kl; от 0 до 0.30 мг/л Na₂MoO₄⋅2H₂O; от 0.01 до 0.05 мг/л CuSO₄⋅5H₂O; от 10.5 до 50 мг/л Na₂EDTA⋅2H₂O; от 10 до 30 мг/л FeSO₄⋅7H₂O; от 70 до 150 мг/л мио-инозитол; от 0,3 до 0,6 мг/л никотиновой кислоты; от 0,4 до 0,6 мг/л пиридоксина; от 0,08 до 0,15 мг/л тиамина; от 0 до 11 мг/л нафталинуксусной кислоты; от 0 до 0,066 мг/л кинетина; и от 10 до 35 г/л сахарозы.

Культивирование на стадии b) предпочтительно проводят при температуре в диапазоне от 24 до 30°C, предпочтительно от 26 до 27°C. Культивирование на стадии b) предпочтительно проводят в атмосфере с парциальным давлением O₂, составляющим примерно 10%.

Способ предпочтительно осуществляют партиями в течение 6-10 дней. Способ может быть осуществлен в соответствии с подпитываемым периодическим выращиванием или с непрерывной техникой выращивания. После культивирования в подходящей среде дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению собирают на стадии с), например, путем фильтрации, и могут лиофилизировать или подвергнуть процессу экстракции.

Согласно одному конкретному варианту реализации, стадию культивирования b) осуществляют в течение периода от 6 до 14 дней, и предпочтительно, от 6 до 10 дней.

Настоящее изобретение также относится к дедифференцированным клеткам кустовой розы Lancôme, в частности к этим дедифференцированным клеткам кустовой розы Lancôme delboip, при этом указанные дедифференцированные клетки получают с помощью способа, подробно изложенного в настоящем описании, в том числе в примерах.

Авторы настоящего изобретения показали, что способ в соответствии с настоящим изобретением дает возможность получить клеточные линии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme, причем клетки клеточных линий могут культивироваться в виде дедифференцированных клеток в течение очень длительного периода времени или даже бессрочно без обнаруживаемого изменения их морфологии и без обнаруживаемой модификации их свойств, в частности без обнаруживаемого изменения их кожно-регенерирующих свойств.

Клеточные линии дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme, согласно настоящему изобретению, характеризуются, в частности, следующими характеристиками:

- Размер редких изолированных клеток (<5%) не превышает диаметр от 10 до 30 мкм,

- Наиболее сильно преобладающие агрегаты клеток имеют диаметр от 50 до 300 мкм,

- Клетки имеют шарообразную морфологию и белый цвет,

- По сравнению с другими клеточными линиями кустовой розы культура включает в себя очень мало клеточного детрита, и агрегаты довольно однородны, со средним диаметром около ста микрон,

- Культуры дедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme не демонстрируют никакой особенный запах.

Изобретение также относится к клеточной линии, изолированной заявителем и депонированной в соответствии с Будапештским Договором в Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) 4 июля 2012 года, под номером 2-6307.

Преимущественно, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть применены свежие или лиофилизированные дедифференцированные растительные клетки или их экстракты или они включены в состав композиций, стабилизирующих их.

Лиофилизированные дедифференцированные растительные клетки могут быть повторно экстрагированы водой. В качестве преимущества, лиофилизация дедифференцированных растительных клеток делает возможным отделить активные вещества от биополимерных наполнителей, таких как полисахариды клеточной стенки.

В некоторых вариантах реализации дедифференцированные клетки лиофилизируют, а затем ресуспендируют. Клеточный детрит, который может присутствовать в полученной суспензии, удаляют, например, с помощью пропускания через шприц и последующего центрифугирования. Суспензию с удаленным клеточным детритом можно использовать в качестве активного агента, полученного из дедифференцированных клеток растений в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, может быть применен экстракт дедифференцированных растительных клеток. Изобретение обязательно относится к активным экстрактам дедифференцированных растительных клеток по параметрам полученного воздействия на стареющую кожу и стареющие волосы. Активность экстракта по настоящему изобретению может, в частности, быть оценена с помощью различных экспериментальных протоколов, описанных в примерах, указанных ниже.

Любой способ экстракции, известный специалистам в данной области техники, может быть применен для получения экстракта дедифференцированных растительных клеток в соответствии с изобретением.

В качестве экстрактов, которые подходят для реализации настоящего изобретения, можно упомянуть водные экстракты, спиртовые экстракты или экстракты с органическим растворителем.

Термин «водный растворитель» означает любой растворитель, полностью или частично состоящий из воды. Можно, таким образом, упомянуть саму воду, водно-спиртовые растворители в любом соотношении или же растворители, состоящие из воды и соединения, такого как пропиленгликоль, в любом соотношении. Среди спиртовых растворителей, можно назвать, в частности, этанол.

Способ экстракции, который подходит для настоящего изобретения, может включать в себя первый этап измельчения дедифференцированных растительных клеток, например, в холодном водном растворе, затем второй этап удаления частиц в суспензии из водного раствора, полученного на первой стадии, и третий этап стерилизации водного раствора, полученного на второй стадии. Этот водный раствор соответствует экстракту.

Полученный экстракт затем могут лиофилизировать любыми обычными способами лиофилизации. Таким образом получают порошок, который может быть применен непосредственно, либо смешан с подходящим растворителем перед применением.

Дедифференцированные растительные клетки по настоящему изобретению также могут быть применены в виде лиофилизата. Такой лиофилизат может быть получен любым способом лиофилизации, известным специалистам в данной области.

В принципе, лиофилизация состоит в удалении воды из жидкого, пастообразного или твердого продукта посредством комбинированного действия холода и вакуума. Когда вода нагревается в твердом состоянии при очень низком давлении, вода сублимирует, то есть переходит непосредственно из твердого состояния в газообразное состояние. Водяной пар (или пар любого другого растворителя) покидает продукт и захватывается с помощью замораживания, с использованием конденсатора, или ловушки. Эта методика дает возможность сохранить и объем, и внешний вид обрабатываемого продукта. Это может происходить в природе (высыхание в горах) или более быстро, в сублимационной сушилке.

Лиофилизация обычно включает в себя три этапа: замораживание, сублимация и вторичная сушка.

Замораживание состоит в очень быстром переносе вещества в температуру между -20°C и -80°C, таким образом, чтобы заблокировать воду в форме льда в том положении, в котором она была в жидком состоянии; таким образом избегают лизиса клеток.

Сублимация состоит в устранении «свободной» воды. Под вакуумом примерно 100 мкбар, значение которого, однако, может значительно варьировать в зависимости от продукта, к продукту подводится тепло; лед подвергается сублимации. В зависимости от продукта и производственных потребностей, температура может варьировать в течение цикла. Водяной пар захватывается «ловушку» или «конденсатор», и дегидратация продукта происходит непрерывно. Когда большая часть воды претерпела сублимацию, продукт теряет около 80%-90% воды.

Сушка состоит в удалении захваченной воды из продукта. На этом этапе вакуум более сильный, примерно до 5 мкбар. На этой стадии продукт становится сухим на 95%.

Например, после извлечения клеток из культуральной среды путем фильтрации на ткани с контролируемой пористостью (примерно 80 мкм), клетки замораживают при низкой температуре, предпочтительно от -20°C до -80°C, в условиях, которые позволят избежать образования крупных кристаллов льда, способных повредить их. Замороженные клетки затем подвергают этапу сублимации льда в вакууме в диапазоне от 5 до 500 мкбар и, предпочтительно, в вакууме, составляющем 100 мкбар.

Как указано выше, лиофилизированные клетки растений по настоящему изобретению могут быть регидратированы перед использованием.

Неожиданно, заявитель показал, что эффекты, оказываемые на кожу дедифференцированными клетками кустовой розы Lancôme в соответствии с настоящим изобретением или экстрактом или лиофилизатом указанных клеток, значительно отличаются от тех, которые наблюдали у недедифференцированных клеток кустовой розы Lancôme или у экстракта или лиофилизата из указанных клеток.

Также неожиданно, что заявитель показал, что дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme или экстракт или лиофилизат указанных клеток оказывают особенный эффект на профиль экспрессии генов в клетках кожи человека. Авторы настоящего изобретения показали, что дедифференцированные клетки кустовой розы Lancôme или экстракт или лиофилизат из указанных клеток оказывают специфическое действие на экспрессию генов в клетках кожи человека, по сравнению с э