Способы получения гликосфинголипидов и их применение

Способы получения гликосфинголипидов и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым аналогам гликосфинголипидов, являющимся промежуточными продуктами при их получении. Более конкретно, изобретение относится к новым способам получения гликосфинголипидов. В частности, изобретение относится к способам синтеза и применению новых альфа-связанных гликосфинголипидных соединений.

Уровень техники

Исследования показывают, что естественные киллерные Т-клетки (NKT-клетки), уникальная субпопуляция лимфоцитов, характеризуются коэкспрессией инвариантного антигенного рецептора и рецепторов естественных киллеров. Естественные киллерные Т-клетки человека (Vα24-Jα18) активируются специфическим гликолипидным антигеном, CD1d-зависимым способом. Молекулы CD1d представляют собой гетеродимеры, состоящие из тяжелой полипептидной цепи, нековалентно связанной с 2-микроглобулином, и обладают существенным структурным сходством с протеинами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I. После активации естественные киллерные Т-клетки проявляют МНС-независимую противоопухолевую активность в отношении опухолевых клеток in vitro и in vivo по нескольким механизмам. Активированные Vα24 NKT-клетки продуцируют значительное количество цитокинов, таких как интерферон-гамма (IFN-γ), тем самым объединяя врожденный и приобретенный иммунитет активацией других эффекторных клеток, включая дендритные клетки (DC), естественные киллерные клетки (NK-клетки) и CD8⁺ Т-клетки. NKT-клетки играют регуляторную роль в иммунной системе, следовательно, они являются перспективными целями в иммунотерапии.

В настоящее время альфа-галактозилцерамид (αGalCer, KRN-7000) является наиболее полно изученным CD1d презентируемым антигеном. Первоначально он вызвал интерес, когда были продемонстрированы новые противоопухолевые свойства экстрактов из морской губки, Agelas mauritianus. Фармацевтическая компания Kirin Beer (патент США №5849716). Позже эта выраженная активность была отмечена у группы альфа-связанных гликосфинголипидов (GSLs), от которых структурной оптимизацией был получен αGalCer. Гликосфинголипиды состоят из сахаридной группы альфа-связанной с церамидом, образованным амидной связью жирной кислоты с длинноцепочечным основанием.

При активации αGalCer естественные киллерные Т-клетки высвобождают провоспалительный (Th1) и иммуномодулирующий (Th2) цитокин. Считается, что выработка Т_Н1 цитокинов коррелирует с противоопухолевым, противовирусным/антибактериальным и адъювантным действием, тогда как выработка Т_Н2 цитокина считается подавляющей аутоиммунные заболевания. αGalCer был объектом клинических испытаний в связи с его противораковым потенциалом, но они были прекращены на этапе I. Неспецифическая природа профиля цитокина, индуцированного αGalCer , а также обоих Th1 и Th2, делает его менее эффективным в плане терапевтического лечения. Это объяснение побудило многих исследователей сосредоточить свое внимание на поиске соединений которые повышают селективность в отношении ответной реакции на T_H1 или на T_H2 цитокины. Уонг и коллеги (Wong et al.) синтезировали ряд гликолипидов, несущих ароматические группы в ацильной цепи и установили, что эти молекулы смещают профиль высвобождения цитокина в сторону ответной реакции на T_H1 (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 9022-9023. US 2007/0238871). В эксперименте in vivo на мышах с агрессивными раковыми опухолями легкого (клеточная линия ТС1) и раковыми опухолями молочной железы (клеточная линия 4Т1) было показано, что у мышей с раком легкого, которых лечили новыми гликолипидами, значительно увеличилось время жизни по сравнению с мышами, которых лечили αGalCer. У мышей, пораженных раком молочной железы, лечение новыми гликолипидами замедляло темп роста опухоли на 75% относительно группы, не получавшей лечения, по сравнению с 50% замедлением у мышей, которых лечили α-GalCer (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104, 10299-10304).

Следовательно, существует потребность в эффективном средстве для синтеза альфа-гликосфинголипидов, таких как соединения αGalCer, а также потребность в синтезе новых альфа-гликосфинголипидных соединений, обладающих иммуномодулирующим эффектом.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение предоставляет новые способы синтеза галактозилсфинголипидов, включая новые соединения, относящиеся к альфа-галактозилцерамидам и их активным аналогам, таким как С34.

По одному из вариантов осуществления изобретение предоставляет соединение структурной формулы (1):

где R₁=OH, NH₂, NHCOR₂; R₂=Н или алкил, алкенил или алкил с концевой арильной группой, замещенный арил, гетероарил, или замещенный гетероарил; X = алкильная группа, алкенил; R₃, R₄=H, ОН; R₅ = арил, замещенный арил, гетероарил или замещенный гетероарил.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы 1 может быть получено способом, включающим в числе прочих этап удаления бензилиденовой защитной группы и гидрогенизации соединения структурной формулы (2):

где PG является защитной группой гидроксила.

По другому варианту осуществления изобретения защитной группой гидроксила может быть бензил.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы 2, где X=(CH₂)₈, R₃=H, R₄=H, R₅=4-F-фенокси-фенил, может быть получено способом, включающим в числе прочих этап образования амидной связи между соединениями формулы (3) и формулы (4).

где по одному из вариантов осуществления PG является бензилом

где по одному из вариантов осуществления, X = алкильная группа, алкенил, R₃=H, ОН, R₄=Н, OH, R₅ = арил, замещенный арил, гетероарил, или замещенный гетероарил.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы (3), где R является бензилом, может быть получено способом, включающим в числе прочих этап восстановления азидной группы соединения структурной формулы (5):

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы 5, где PG является бензилом, может быть получено способом, включающим в числе прочих этап реакции соединения структурной формулы (6)

где PG является защитной группой гидроксила и LG является уходящей группой, с соединением структурной формулы (7)

где PG является защитной группой гидроксила, с образованием альфа-гликозидной связи, с получением, таким образом, соединения формулы (5). По другому варианту осуществления изобретения замещаемой группой из формулы (6) может быть любая группа из числа:

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы 1 может быть получено способом, включающим в числе прочих этап удаления бензилиденовой защитной группы и гидрогенизации соединения структурной формулы (8):

где PG является защитной группой гидроксила. По другому варианту осуществления изобретения PG может быть в числе прочих бензилом.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы (8) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап реакции соединения структурной формулы (9) с соединением, представленным алкановой кислотой, арильной кислотой, арил-алкановой кислотой, замещенной арил-алкановой кислотой и гетероциклической кислотой.

где PG является защитной группой гидроксила.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (9) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап восстановления азида структурной формулы (10)

где PG является защитной группой гидроксила.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (10) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап замещения соединения структурной формулы (11)

где R является уходящей группой, с получением, таким образом, соединения формулы (11).

По другому варианту осуществления изобретения R может быть в числе прочих метансульфонилом или толуолсульфонилом. По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы (11) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап проведения замещения гидроксильной группы соединения структурной формулы (12)

По другому варианту осуществления изобретения замещение может проводиться в присутствии основания и метансульфонил хлорида или толуолсульфонил хлорида.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (12) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап гидролиза соединения структурной формулы (13)

где R является защитной группой гидроксила, по одному из вариантов осуществления изобретения R является сложным эфиром алкила. По другому варианту осуществления изобретения R является ацетатом.

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (13) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап образования амидной связи между соединением структурной формулы (14),

и соединением структурной формулы (4).

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (14) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап восстановления азида структурной формулы (15).

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение (15) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап реакции соединения структурной формулы (16)

где PG является защитной группой гидроксила, LG является уходящей группой и R является сложным эфиром, с соединением структурной формулы (7), где PG является защитной группой гидроксила с образованием альфа-гликозидной связи, с получением, таким образом, соединения формулы (15).

По другому варианту осуществления изобретения уходящей группой может быть любая группа из числа:

По одному из вариантов осуществления изобретения соединение формулы (17) может быть получено способом, включающим в числе прочих этап удаления защитной группы гидроксила PG1, с получением, таким образом, соединения формулы (17), при этом PG1 может быть в числе прочих тритилом.

Эти и другие аспекты станут очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления в сочетании с приведенными ниже чертежами, причем очевидно, что могут быть осуществлены другие реализации и модификации в рамках изобретения без отступления от существа и объема новых концепций раскрытия.

Краткое описание чертежей

Следующие чертежи являются частью настоящего описания, они были включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего раскрытия, изобретения в рамках которого будут более понятными при наличии ссылок на один или несколько этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем документе.

Фиг.1 является схематической иллюстрацией, описывающей синтез С34, А15-21. Схема 1. Реактивы и условия: (a) TfN₃, K₂CO₃, CuSO₄, дихлорметан, МеОН, H₂O; (b) тритил хлорид, триэтиламин, толуол; (c) бензилхлорид (BnCl), NaH, диметилформамид, толуол; (d) HCl, толуол, МеОН; (е) А5, Me₂S₂-Tf₂O, тетрагидрофуран, 4 Å MS; (f) LiAlH₄, тетрагидрофуран; (g) RCO₂H, HBTU, N-метилморфолин, дихлорметан; (h) Pd(OH)₂, H₂, МеОН, дихлорметан.

Фиг.2 является схематической иллюстрацией, описывающей синтез соединения А23-А25. Схема 2. Реактивы и условия: (a) Pd(OH)₂, Н₂ (80 фунтов/кв. дюйм), МеОН, дихлорметан, АсОН; (b) RCO₂H, HBTU, N-метилморфолин, дихлорметан МеОН.

Фиг.3 является схематической иллюстрацией, описывающей синтез соединения формулы (4). Схема 3.

Фиг.4 является схематической иллюстрацией, описывающей синтез соединений C5-C7. Схема 4. Реактивы и условия: (a) PPh₃, тетрагидрофуран, H₂O; (b) Ph(CH₂)_nCO₂H, HBTU, N-метилморфолин, дихлорметан; (c) Pd(OH)₂, Н₂, дихлорметан, МеОН.

Фиг.5 является схематической иллюстрацией, описывающей синтез соединений C20-C31. Схема 5. Реактивы и условия: (a) TsCl, пиридин; (b) NaN₃, диметилформамид; (c) PPh₃, тетрагидрофуран, H₂O; (d) RCH₂CO₂H, HBTU, N-метилморфолин, МеОН, дихлорметан.

Фиг.6 показывает индуцированную гликосфинголипидами секрецию IL-2 в клеточной системе A20CD1d и mNK1,2. Данные приведены как среднее ± среднеквадратическое отклонение; "-" указывает на отсутствие соединения.

Фиг.7 показывает секрецию INF-гамма цитокина спленоцитами самки мыши C57BL/6.

Фиг.8 показывает секрецию IL-4 цитокина спленоцитами самки мыши C57BL/6.

Фиг.9 показывает соотношения секреции цитокина, полученные при сравнении фиг.7 и 8.

Осуществление изобретения

Термины, использованные в этом описании, как правило, имеют свое обычное значение в данной области в контексте изобретения и в конкретном контексте, в котором использован каждый термин. Некоторые термины, которые были использованы для описания изобретения, обсуждаются ниже или в других местах описания для предоставления дополнительных указаний практикам применительно к описанию изобретения. Для удобства некоторые термины могут быть выделены, например, курсивом и/или кавычками. Использование выделения не влияет на объем и значение термина; объем и значение термина остаются теми же в том же контексте, независимо от того, был он выделен или нет. Следует понимать, что одно и то же может быть выражено несколькими способами. Следовательно, для любого или нескольких обсуждаемых здесь терминов могут быть использованы альтернативные выражения и синонимы, независимо от того, развивается или обсуждается термин в настоящем документе или нет, он не принимает никакого специального значения. Для некоторых терминов приведены синонимы. Указание одного или нескольких синонимов не исключает использование других синонимов. Использование примеров в любой части этого описания, включая примеры любых обсуждаемых здесь терминов, приведено только для иллюстрации, и ни в коей мере не ограничивает объем и значение изобретения или любого термина, представленного в качестве примера. Аналогично, изобретение не ограничивается различными вариантами осуществления, приведенными в этом описании.

Если не определено иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют такое значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение. При возникновении споров, преимущественной силой будет обладать настоящий документ, включая определения.

Новые способы синтеза соединений формулы (1) в целом включают связывание церамида с сахаридом, но также существует возможность сначала провести связывание с фитосфингозином, а затем преобразовать аминогруппу в амидогруппу для формирования соединения формулы 1.

Примером такого синтеза может служить синтез соединения формулы (1), в котором галактоза C6' является гидроксильной группой во время последовательных этапов (см. Фиг.1-3).

Исходным материалом является фитосфингозин гидрохлорид ((2S,3S,4R)-2-амино-1,3,4-октадекантриол), хотя существует ряд способов синтеза фитосфингозина согласно описанию в Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391. Промышленно выпускаемый источник - фитосфингозин гидрохлорид готовят из соответствующего дрожжевого ферментативного бульона, который можно получать в больших количествах по разумной цене (Evonik Degussa Taiwan Ltd.). Изомерные сфингозины, конфигурация которых отличается от таковой природного сфингозина, можно приготовить в соответствии с методами, описанными в Helvetica Chimica Acta 1957, 470, 1145; или в Chem. Commun. 1991, 820.

На первом этапе аминогруппа фитосфингозина была преобразована в азидогруппу реакцией диазопереноса свежеприготовленным TfN₃ с получением А1. С приготовлением TfN₃ можно ознакомиться в Tetrahedron Lett 1996, 37, 6029-6032. Защита тритилом первичного спирта А1 дала неочищенный А2, который был напрямую подвергнут воздействию условий бензилирования NaH и BnCl с получением соединения A3. В данном методе, когда бензильная группа применяется как защитная группа гидроксильной группы, можно также применять другие соответствующие группы, такие как бензоат, (p-метокси)-бензил или изопропилиден. Для синтеза соединения с А1 по A3 в качестве растворителя был выбран толуол. Реакцию бензилирования вторичных спиртов не удавалось провести в толуоле, если он был единственным растворителем. Для решения проблемы низкой химической активности реакции бензилирования в толуоле была использована система сорастворителей из 10% диметилформамида в толуоле с целью повышения растворимости NaH и промежуточного алкоксида. После промывания водой был получен неочищенный A3 в виде раствора в толуоле, и было проведено удаление защитной группы кислотой с получением акцептора гликозила А4. Для удаления защитной тритиловой группы можно использовать разные кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота, бромистый водород, трифторуксусная кислота, BF₃.OEt, азотная кислота, смоляная кислота (например, амберлит (Amberlite IR120^®)) и тому подобные.

Раньше при синтезе гликолипидов применяли различные способы гликозилирования, включая использование гликозил фторида, гликозил трихлорацетоимидата, гликозил бромида и гликозил иодида^20-23. Tetrahedron 1998, 54, 3141-3150; J Org Chem 2005, 70, 10260-10270; J Org Chem 2002, 67, 4559-4564; Chem Commun 2007, 2336-2338. Первоначально в нашем синтезе применяли гликозил имидат, который обеспечивал отличный выход (89%) и селективность по отношению к аномерам (α/β=9/1). В связи с тем, что имидат легко подвергается гидролизу, и обычно необходимо применять свежеприготовленный раствор, при применении этой замещаемой группы для гликозилирования при проведении синтеза в большом масштабе могут возникать проблемы с хранением и очисткой. В качестве альтернативы можно в качестве донора получить тиогликозид А5 с использованием кислоты Льюиса, такой как TMSOTf, Tf₂O, BF₃⋅OEt₂, TfOH, Me₂S₂-Tf₂O, в качестве катализаторов и с применением молекулярных сит для дегидратации. Соединение А5 содержит азидо-группу, которая способствует гликозилированию, тогда как аминогруппа фитосфингозина защищена амидом или карбаматом (t-бутил карбаматом) как показано в US 5849716; US 2007/0238871; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13602-13603; J. Org. Chem. 2005, 70, 10260-10270; Tetrahedron 1998, 54, 3141-3150; Synthesis 2004, 847-850; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 2195-2199. 2-NH и 1-OH могут образовывать внутримолекулярную водородную связь, которая мешает ему как нуклеофилу вступать в реакцию с активированным гликозидом, результатом этого является низкий выход реакции гликозилирования. После гликозилирования между А4 и А5 очистка в колонне может дать А6 в чистой α-форме и в чистой β-форме.

Соединение А6, которое содержит азидо-группу, можно восстановить с помощью любого из: алюмогидрида лития, борогидрида натрия, боранового комплекса, фосфинового комплекса, ферментного восстановления, гидрогенизации или трансферной гидрогенизации. Вместо использования фосфинового комплекса, образующего побочный продукт - оксид фосфина, который трудно удалить, восстановление азида алюмогидридом лития (LiAlH₄) давало высокочистый амин А7. Соединение А7 сочетали с различными полученными карбоновыми кислотами (способы получения, см. Фиг. 3) с образованием соответствующих амидных соединений. В целом, снятие защитных групп у этих соединений достигалось в условиях гидрогенолиза в присутствии катализатора гидрогенизации, выбранного из Pd/C, Pd(OH)₂ или ренеевского никелевого катализатора, и Н₂ в смешанных растворителях МеОН и CH2CI2 с получением аналогов С34, соединений А15-21.

Восстановительное дегалогенирование арил галидов на ацильной цепи проводится реакцией гидрогенизации хлоро- и бромо-ацил содержащих соединений. Поэтому для предупреждения реакции дегалогенирования с А6 удаляли защитные группы и восстанавливали гидрогенизацией в присутствии каталитического Pd(OH)₂ и Н₂. После этого образовавшийся амин А22 сочетали с соответствующими кислотами (способы приготовления, см. Фиг. 3) в условиях сочетания с получением аналогов А23-25 (Фиг. 2).

Для этого процесса известен ряд способов проведения реакций, в частности для амидирования. Можно также использовать ацил хлорид и ангидрид кислоты или карбоновую кислоту. Карбоновая кислота используется в реакции конденсации в присутствии соответствующего конденсирующего реагента. Соответствующие конденсирующие реагенты, используемые в этой реакции, включают дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-(3'диметиламинопропил)карбодиимин (EDC), а также 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониум гексафторфосфат (HBTU), гидроксибензотриазол (HOBt) или тому подобные. Для обеспечения быстрого протекания реакции добавляют органическое основание, такое как триэтиламин, пиридин, N-метилморфолин, диметиланилин, 4-диметиламинопиридин, N-метилпиперидин, N-метилпирролидин. Растворителем может быть любой инертный растворитель, который не будет вовлечен в реакцию, такой как тетрагидрофуран, простой этиловый эфир, толуол, хлороформ, метилен хлорид, этилацетат, ацетон или тому подобные.

Как можно видеть на Фиг.3 для получения различных замещенных фенилалкановых кислот применяется реакция Виттига. В этом способе ω-бромо-алкановые кислоты смешивают с трифенил фосфином в присутствии растворителя. Реакцию обычно проводят с соответствующим растворителем, но если реакция протекает вяло, ее можно усилить проведением реакции в отсутствие растворителя. Растворителем может быть любой инертный растворитель, который не будет вовлечен в реакцию, например, толуол, бензол, диглим, диметилсульфид или тому подобные.

В качестве еще одного примера синтеза, можно также синтезировать соединение формулы (1) проведением различных замещений в позиции галактозы С6', выполнив следующие этапы (см. Фиг.4-5).

Синтез модифицированных аналогов С6 был начат с соединения С1 согласно описанию в Org Lett 2002, 4, 1267-1270. Восстановление азида, затем амидирование с различными выпускаемыми ароматическими кислотами и полное снятие защитных групп дало С5-С6 (Фиг.4, схема 4). Кроме того, для предотвращения трудоемкого взаимного преобразования защитных групп для приготовления из соединения C1 при синтезе С6'' и би-модифицированных соединений с ацильной цепью (Фиг.5) была применена иная стратегия. Гидроксильную группу C6'' А15 можно тозилировать или мезилировать толуол сульфонил хлоридом или метан сульфонил хлоридом в присутствии основания, такого как пиридин, диметилпиридин, триэтиламин, диэтилпропиламин, DBU или тому подобных, и затем соответствующую группу тозилата или мезилата можно заместить азидом реакцией с азидом натрия с получением С18. Восстановление азида по Штаудингеру, амидирование с различными кислотами дает C20-31.

Применение соединения по настоящему изобретению

Соединения формулы (1), обладающие следующей физиологической активностью, можно применять в качестве иммунотерапевтического средства против рака или в качестве иммуностимулирующего средства против других болезней.

Активность по активации АРС: секрецию IL-2 можно измерить в системе клеток A20CD1d и mNK1,2 как АРС и эффекторных клеток, как показано в примере 2.

Иммуностимулирующая активность: секрецию цитокина IFN-γ и Il-4 можно измерить, как показано в примере 2, в котором самка мыши C57BL/6 (16w4d) была забита, и селезенка использована для анализа.

Противоопухолевое средство: соединение по настоящему изобретению обладает смещенным в сторону Th1 профилем секреции цитокина и может быть использовано как вещество, обладающее противоопухолевой активностью и иммуностимулирующим действием.

Наряду с тем, что соединения в настоящем изобретении могут применяться как иммунотерапевтическое средство против опухолей, их можно применять отдельно или в сочетании с химиотерапией или радиотерапией.

Соединения по настоящему изобретению в качестве противоопухолевого средства или иммуностимулирующего средства можно вводить любыми соответствующими способами введения дозы. Соединение обычно превращают в препарат, в растворенной форме или сформованный с фармацевтически приемлемым носителем (липосома или мицелла). При применении соединения по настоящему изобретению, его можно вводить перорально или парентерально человеку или млекопитающему. Например, соединения по настоящему изобретению при применении в форме инъекции, можно вводить внутривенно, внутримышечно, подкожно или в виде ингаляций в форме раствора, суспензии или эмульсии с соответствующим растворителем. В этом случае при необходимости можно добавить в качестве солюбилизирующего вещества полисорбаты или макрогол, холестерол. При пероральном приеме соединений по настоящему изобретению они могут быть в форме таблетки, порошка, гранулы, или сухого сиропа в соответствующем разбавителе.

ПРИМЕРЫ

Без намерения ограничить объем изобретения ниже приведены типовые приборы, аппарат, способы и связанные с ними результаты, соответствующие вариантам осуществления настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что для удобства читателя в примерах могут быть использованы заглавия или подзаголовки, которые ни в коей мере не будут ограничивать объем изобретения. Кроме того, в документе предложены и раскрыты некоторые теории; однако, независимо от того, являются ли они правильными или нет, они ни в коем случае не будут ограничивать объем изобретения, поскольку изобретение воплощается на практике по изобретению без учета какой бы то ни было конкретной теории или плана действий.

Пример 1

Ниже описаны методы синтеза и физико-химические свойства соединений по настоящему изобретению (номера соединений, участвующих в процессе синтеза, приведены на схемах реакций, которые показаны на Фиг.1-5).

На приведенных в настоящем документе схемах использованы следующие сокращения:

THF:	тетрагидрофуран
DMF:	N,N-диметилформамид
MS-4А:	молекулярные сита - 4А (дегидратирующее средство)
CH2Cl2:	дихлорметан
NMM:	N-метилморфолин
HBTU:	О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметил-урониум-гексафторо-фосфат
TMSOTf:	триметилсилил трифторметансульфонат
Tf2O:	трифторметансульфоновый ангидрид
CDCl3:	d1-хлороформ
NMR:	ядерно-магнитный резонанс
HRMS:	масс-спектрометрия высокого разрешения
ESI:	ионизация электрораспылением

Другие сокращения имеют те же значения, как и сокращения на схемах, приведенные выше.

Схема синтеза 1 (Фиг.1)

Пути конкретно показывают способ получения соединения С34, А13, А14, А15, А16, А18, А19, А20, А21, этим способом можно также синтезировать соединения по настоящему изобретению.

Синтез (2S,3S,4R)-2-азидо-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А1)

К раствору азида натрия (64,3 г, 989 мМоль) в 250 мл воды добавили дихлорметан (350 мл). Двухфазную смесь охладили до 5°C в ледяной бане и в течение 20 мин добавляли трифторметансульфоновый ангидрид (47,5 мл, 283 мМоль), поддерживая температуру на уровне ниже 10°C. После перемешивания в течение 2,5 часов в ледяной бане реакцию в реакционной смеси остановили добавлением 70 мл насыщенного раствора K₂CO₃. Органическую фазу отделили, а водную фазу экстрагировали CH₂Cl₂ (200 мл). Органические фазы соединили и получили раствор азида трифторметансульфоновой кислоты в дихлорметане. [Осторожно! Азид трифторметансульфоновой кислоты является взрывчатым веществом, его необходимо хранить с растворителем.]

К раствору сульфата меди (0,35 г, 1,4 мМоль) в воде (150 мл) добавили фитосфингозин гидрохлорид (фитосфингозин гидрохлорид высокой степени очистки [(2S,3S,4R)-2-амино-1,3,4-октадекантриол] из соответствующего дрожжевого ферментативного бульона, который производят для продажи в больших количествах по разумной цене, 50,0 г, 141 мМоль), карбонат калия (29,28 г, 211,9 мМоль) и метанол (1,0 л). Суспензию охладили до 0-5°C в льдосоляной бане и в течение 10 мин добавляли раствор азида трифторметансульфоновой кислоты (в 550 мл CH₂Cl₂). После перемешивания реакционной смеси в течение 12 часов при комнатной температуре, смесь концентрировали. Остаток развели в воде (1,0 л) и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Осадок отфильтровали и промыли водой (500 мл×2). Осадок высушили азеотропной дистилляцией (70-80°C, 200-250 мм рт.ст.) с толуолом (1,5 л) и получили (2S,3S,4R)-2-азидо-D-рибо-октадекан-1,3,4-триол (А1) (47,0 г, 137 мМоль, 97%) в виде белого твердого вещества с сероватым или желтоватым оттенком, точка плавления: 87°C. ¹H-NMR (CD₃OD, 400 мГц) δ 3,85 (dd, J=11,6, 3,3 Гц, 1Н), 3,69 (dd, J=11,6, 7,9 Гц, 1H), 3,50-3,55 (m, 1Н), 3,43-3,47 (m, 2Н), 1,22-1,60 (m, 26Н), 0,83 (t, J=6,4 Гц, 3Н). ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 МГц) δ 74,6, 71,5, 65,3, 61,2, 32,5, 31,7, 29,4, 29,4, 29,1, 25,4, 22,4, 13,1. HRMS (ESI) в пересчете на O₁₈H₃₇N₃O₃Na [M+Na]⁺: 366,2733, установлено: 366,2729.

Синтез (2S,3S,4R)-2-азидо-3,4-ди-O-бензил-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А4)

К смеси (2S,3S,4R)-2-азидо-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (47,0 г, 137 мМоль) в толуоле (1,0 л) добавили триэтиламин (46 мл, 332 мМоль) и тритил хлорид (42,0 г, 151 мМоль). После перемешивания при 50-55°C в течение 6 часов добавили триэтиламин (4,6 мл, 33 мМоль) и трифенилметил хлорид (4,20 г, 15,1 мМоль), затем смесь перемешивали еще 15 часов. К смеси добавили воду (1,0 л) и перемешали в течение 3 мин. Органическую фазу вымыли водой (1,0 л, 500 мл) провели концентрацию и получили неочищенный (2S,3S,4R)-2-азидо-1-тритил-D-рибо-октадекан-1,3,4-триол (А2). Очистку образца для анализа методом NMR провели колоночной хроматографией. ¹Н-NMR (CDCl₃, 400 МГц) δ 7,22-7,47 (m, 15Н), 3,62 (dd, J=3,7, 10,1 Гц, 2Н), 3,53 (m, 2Н), 3,40 (dd, J=6, 10,1 Гц, 1H), 2,35 (brs, 1H), 1,83 (brs, 1H), 1,20-1,52 (m, 26Н), 0,87 (t, J=6,8 Гц, 3Н). ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 МГц) δ 143,35, 128,54, 128,01, 127,27, 87,78, 74,19, 72,18, 63,48, 62,31, 31,90, 31,74, 29,67, 29,64, 29,60, 29,55, 29,34, 25,59, 22,67, 14,10.

К раствору неочищенного (2S,3S,4R)-2-азидо-1-тритил-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А2) в толуоле (750 мл) и диметилформамида (75 мл) добавили гидрид натрия (60% в минеральном масле, 21,9 г, 548 мМоль) тремя порциями в течение 10 мин. Смесь перемешивали в течение 30 мин., после чего в реакционную смесь добавили бензилхлорид (50,5 мл, 0,438 мМоль). Смесь нагрели до 50-60°C и перемешивали в течение 18 часов. Затем смесь охладили до 0°C и по каплям добавили воду (50 мл). Органическую фазу промыли насыщенным раствором хлорида аммония (500 мл×2) и водой (500 мл×2). Органическую фазу профильтровали через целитовую подушку, и провели концентрацию фильтрата для получения неочищенного (2S,3S,4R)-2-азидо-2,3-ди-бензил-1-тритил-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (A3).

К раствору A3 в смеси толуол/метанол (600 мл, 1/1) добавили водный раствор HCl (33%, 6,0 мл). Смесь нагрели до 50-60°C и перемешивали в течение 20 часов. Реакцию в реакционной смеси остановили добавлением 1,0 N NaOH (55 мл) и провели концентрацию. Остаток разделили толуолом (500 мл) и водой (500 мл). Провели концентрацию органической фазы, и очистку остатка провели колоночной хроматографией (неочищенная фаза 100 г, силикагель 500 г, этилацетат/n-гексан = 1/10) с получением (2S,3S,4R)-2-азидо-2,3-ди-бензил-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А4) (27,5 г, 52,5 мМоль, 38% за 4 этапа) в форме желтого жидкого масла. ¹H-NMR (CDCl₃, 200 МГц) δ 7,26-7,39 (m, 10Н), 4,69 (d, J=1,4 Гц, 2Н), 4,59 (d, J=4,3 Гц, 2Н), 3,59-3,94 (m, 5Н), 1,26-1,61 (m, 26Н), 0,88 (t, J=6,4 Гц, 3Н). ¹³C-NMR (CDCl₃, 50 МГц) δ 137,9, 137,6, 128,5, 128,4, 128,1, 127,97, 127,81, 127,10, 80,38, 78,96, 73,59, 72,49, 63,03, 62,20, 21,90, 30,16, 29,66, 29,35, 25,43, 22,67, 14,11. HRMS (ESI) в пересчете на C₃₂H₄₉N₃O₃Na [M+Na]⁺: 546,3672, установлено: 546,3689.

Синтез 4-метилфенил 2,3-O-дибензил-4,6-O-бензилиден 1-тиол-D-галактопиранозида (А5)

Соединение А5 может быть получено методом, описанным в Plettenburg, О. et al. J. Org. chem. 2002, 67, 4559-4564.

Данные о соединении А5: ¹Н-NMR (CDCl₃, 400 МГц) δ 7,58 (d, J=8,1 Гц, 1Н), 7,50 (m, 2Н), 7,23-7,42 (m, 15Н), 6,98 (d, J=8,0 Гц, 1H), 5,46 (s, 1Н), 4,69 (m, 4Н), 3,54 (d, J=9,5 Гц, 1Н), 4,35 (dd, J=12,3, 1,5 Гц, 1H), 4,12 (d, J=3,2 Гц, 1Н), 4,03 (dd, J=9,8, 3,6 Гц, 1Н), 3,82 (t, J=9,3 Гц, 1H), 3,60 (dd, J=9,2, 3,4 Гц, 1H), 3,39 (s, 1Н), 2,28 (s, 3Н).

Синтез 2-азидо-3,4-ди-O-бензил-1-O-(2,3-ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-α-D-галактопиранозил)-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А6)

К раствору диметил дисульфида (10,0 мл, 113 мМоль) в дихлорметане (75 мл) добавили трифторметансульфоновый ангидрид (17 мл, 100 мМоль) при 0-5°C в льдосоляной бане. После перемешивания реакционной смеси в льдосоляной бане в течение 30 мин получили Me₂S₂-Tf₂O в виде 1,0 М раствора в дихлорметане, его можно хранить в ледяной бане в течение 3 часов.

Соединение А4 (27,3 г, 52,2 мМоль), А5 (34,7 г, 62,6 мМоль) и молекулярное сито 4 Å (33 г) смешали и высушили под вакуумом в течение 1 часа, затем к смеси добавили тетрагидрофуран (520 мл). Смесь охладили до -10°C в льдосоляной бане перед добавлением Me₂S₂Tf₂O (1,0 М раствор в CH₂Cl₂, 94 мл, 94 мМоль). После перемешивания в течение 20 мин реакцию в реакционной смеси остановили добавлением триэтиламина (22 мл), затем разбавили дихлорметаном (200 мл). Смесь профильтровали через целитовую подушку и промыли дихлорметаном (50 мл). Провели концентрацию объединенного фильтрата и разделили его дихлорметаном (500 мл) и водой (500 мл). Провели концентрацию органической фазы, и остаток очистили колоночной хроматографией (вес неочищенной фазы = 153 г, 600 г силикагеля, этилацетат : n-гексан = 1:15 до 1:12 до 1:10) и получили 2-азидо-3,4-ди-O-бензил-1-O-(2,3-ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-α-D-галактопиранозил)-D-рибо-октадекан-1,3,4-триол (А6) (32,07 г, 33,60 мМоль, 64%) в виде белого воска с сероватым или желтоватым оттенком, точка плавления: 59°C. ¹H-NMR (CDCl₃, 400 МГц) δ 7,22-7,50 (m, 25Н), 5,44 (s, 1H), 4,96 (d, J=3,4 Гц, 1Н), 4,85 (d, J=11,9 Гц, 1Н), 4,79 (d, J=12,3 Гц, 1H), 4,73 (d, J=12,3 Гц, 1H), 4,66-4,69 (m, 2Н), 4,59 (d, J=8,5 Гц, 1H), 4,56 (d, J=12,8 Гц, 1H), 4,48 (d, J=11,5 Гц, 1Н), 4,15 (d, J=2,8 Гц, 1H), 4,06-4,12 (m, 1H), 3,98-4,04 (m, 3Н), 3,86 (dd, J=12,5, 1,5 Гц, 1H), 3,68-3,73 (m, 3H), 3,60-3,62 (m, 1H), 3,55 (s, 1H), 1,25-1,55 (m, 26H), 0,87 (t, J=7,1 Гц, 3H). ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 МГц) δ 138,75, 138,36, 138,01, 137,82, 128,85, 128,37, 128,34, 128,26, 128,22, 128,09, 127,90, 127,79, 127,75, 127,70, 127,66, 127,61, 127,50, 127,45, 126,33, 101,05, 99,13, 79,41, 78,95, 76,68, 75,80, 75,44, 74,66, 73,77, 73,49, 72,06, 72,03, 69,31, 68,43, 62,97, 61,80, 31,91, 30,01, 29,75, 29,69, 29,67, 29,65, 29,63, 29,60, 29,35, 25,44, 22,68, 14,10. +63,1 (c 1,0, CHCl₃). HRMS (ESI) в пересчете на C₅₉H₇₅N₃O₈Na [M+Na]⁺: 976,5452, установлено: 976,5483.

Синтез 3,4-ди-O-бензил-1-O-(2,3-ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-α-D-галактопиранозил)-2-(11-(4-(4-фторфенокси)фенил)ундеканоил)амино-D-рибо-октадекан-1,3,4-триола (А8)

К раствору соединения А7 (32,07 г, 33,61 мМоль) в тетрагидрофуране (340 мл), охлажденному в ледяной бане, за два приема добавили алюмогидрид лития (1,910 г, 50,33 мМоль). Смесь была возвращена к комнатной температуре, и ее перемешивали в течение 70 мин. Смесь охладили до 0°C перед тем, как последовательно остановить реакцию добавлением воды (1,9 мл), 1,0 N NaOH (3,8 мл) и воды (1,9 мл). Смесь профильтровали через целитовую подушку и промыли дихлорметаном (100 мл). Фильтрат концентрировали и разделили дихлорметаном (350 мл) и водой (350 мл).

К выделенной органической фазе добавили 11-(4-(4-фторфенокси)фенил)) ундекановую кислоту (В4) (11,27 г, 30,26 мМоль), затем N-метилморфолин (9,2 мл, 84 мМоль) и HBTU (19,12 г, 50,