Композиции и способы лечения и предупреждения инфекций, вызванных staphylococcus aureus

Композиции и способы лечения и предупреждения инфекций, вызванных staphylococcus aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США под номером 62/007242, поданной 3 июня 2014 года, предварительной заявки на патент США под номером 62/041423, поданной 25 августа 2014 года, и предварительной заявки на патент США под номером 62/115665, поданной 13 февраля 2015 года.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Вышеназванная копия в формате ASCII, созданная 28 мая 2015 года, названа 5407-0234_SL.txt и имеет размер 83036 байт.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Настоящее изобретение, в общем, относится к способам терапевтического лечения, иммунологии и микробиологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения и предупреждения инфекций, вызванных Staphylococcus aureus.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Staphylococcus aureus (SA) является существенной причиной болезней и смертей, как среди людей, так и среди животных. Инфекция, вызванная данными грамположительными кокками, часто приводит к развитию поверхностного абсцесса. Другие случаи инфекции, вызванной SA, могут быть намного более серьезными. Например, попадание SA в лимфатическую систему и кровь может привести к системной инфекции, которая, в свою очередь, может привести к таким осложнениям, как эндокардит, артрит, остеомиелит, пневмония, септический шок и даже смерть. Внутрибольничная инфекция, вызываемая SA, является распространенной и особенно проблематичной в случае со SA, который является наиболее часто встречающейся причиной внутрибольничных инфекций в области хирургического вмешательства и пневмонии и второй, наиболее часто встречающейся причиной сердечно-сосудистых инфекций и инфекций кровотока. Введение антибиотиков было и остается стандартным лечением инфекций, вызванных SA. К сожалению, применение антибиотиков также способствовало развитию устойчивости к антибиотикам у SA. Причем метициллин-резистентный SA (MRSA) развил способность устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и цефалоспорины. Что более тревожно, недавно были выявлены SA, резистентные к антибиотикам «последней надежды», таким как ванкомицин и линезолид. Таким образом, необходим новый подход к предупреждению и лечению инфекций, вызванных SA.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0005] Было обнаружено, что определенные антитела (Ab) с паратопами Fab-фрагментов, которые специфично связываются с белком A SA (SpA), способны опосредовать опсонизацию бактерии SA несмотря на экспрессию SA SpA, нейтрализующего антитела (Ab). Предыдущие основанные на Ab стратегии лечения или предупреждения инфекций, вызываемых SA, продемонстрировали потенциал в доклинических испытаниях и клинических испытаниях на начальных этапах, но с ними не удалось достичь конечных точек в испытаниях фазы III. Вероятно, в качестве объяснения этих результатов, предыдущие стратегии не касались свойства SpA нейтрализовывать Ab. SpA представляет собой широко экспрессируемый белок, связанный с клеточной стенкой, который связывается с большинством иммуноглобулинов (Ig) посредством их Fс-(эффекторных) фрагментов. SpA связывается с антителами человека подклассов IgG1, IgG2 и IgG4 посредством их Fc-фрагмента с KD приблизительно 1×10^-9 М и таким образом выступает в роли якоря Fc-фрагмента, который располагает эффекторную часть иммуноглобулина (Ig) в сторону, противоположную иммунным эффекторам, взаимодействующим с Fc-фрагментом, таким как фагоциты, несущие рецепторы для комплемента и рецепторы для Fc-фрагмента (FcR). Соответственно, большинство Ab, специфичных к антигенам SA, являются, таким образом, "изолированными" относительно иммунных эффекторов. В дополнение, поскольку SpA настолько широко распространен на клеточной стенке SA (предположительно 7% клеточной стенки), то он опосредует образование щита от Ig, покрывающих клеточную стенку. Данный щит стерически препятствует Ab, специфичным антигенам клеточной стенки, от связывания с их целями и опосредования опсоно-фагоцитозу бактерий. Образование щита от Ig ранее не рассматривали как фактор вирулентности. Таким образом, обнаружение, что Ab, связывающиеся с SA, имеющие Fab-фрагменты, которые специфично связываются с SpA, в тоже время позволяют продолжать взаимодействие их Fc-фрагментов с FcR на иммунных эффекторных клетках и/или активировать комплемент путем связывания C1q, несмотря на способность SpA нейтрализовывать Fc-фрагмент и на образование щита от Ig, являлось значительным шагом в сторону других основанных на Ab подходов против SA. Преимущественными вариантами этих Ab являются такие, которые способны к вытеснению Ig, уже связанных с SpA при помощи их Fc-фрагментов.

[0006] В качестве примеров вышеизложенного, в данном документе описаны выделенные или очищенные антитела (в частности, антитела IgG3 человека, которые имеют Fc-фрагменты с низкой или отсутствующей аффинностью к SpA, такие как фрагмент с аллотипом, содержащим аргинин в аминокислотной позиции 435; Stapleton et al., Nature Communications 2, Article number: 599, 2011), имеющие Fab-фрагменты, способные специфично связываться с целевым эпитопом SpA на бактерии SA, в то время как их Fc-фрагменты все еще способны взаимодействовать с FcR (например, растворимыми рекомбинантными или нативными на иммунных эффекторных клетках), несмотря на способность SpA к связыванию с Fc-фрагментом и стерический барьер целевого эпитопа путем связывания Ig с SpA посредством их Fc-фрагмента. В данном документе также предусмотрены фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно из этих антител и фармацевтически приемлемый носитель (например, ненатуральный фармацевтически приемлемый носитель). Дополнительно предусмотрены способы лечения субъекта с инфекцией, вызванной SA, или снижения риска развития вызываемой SA инфекции у субъекта, которые включают введение терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций, описанных в данном документе, или любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту.

[0007] Используемая в данном документе, форма единственного числа для существительного предусматривает "одно или несколько" данного существительного. Например, фраза "антитело" предусматривает "одно или несколько антител".

[0008] Термин "антитело" или "Ab" означает любой иммуноглобулин (например, антитела человека, хрящевых рыб или верблюда) или их конъюгат, который специфично связывается с антигеном (например, антигеном SpA, таким как SEQ ID NO: 1 или антигенным фрагментом под SEQ ID NO: 1). Специалисту в данной области известно огромное множество Ab. Неограничивающие примеры Ab включают моноклональные Ab (например, включая непроцессированные Ab), поликлональные Ab, мультиспецифические Ab (например, биспецифические Ab), Ab с двойным вариабельным доменом, одноцепочечные Ab (например, однодоменные Ab, Ab верблюдов и Ab хрящевых рыб), химерные Ab (например, гуманизированные, такие как гуманизированный IgG3) и Ab человека (например, Ab IgG3 человека). Термин антитело также включает конъюгаты Ab (например, Ab, конъюгированное со стабилизирующим белком, меткой или терапевтическим средством (например, любым из терапевтических средств, описанных в данном документе или известных из уровня техники)).

[0009] Термин "антигенсвязывающий фрагмент" означает любую часть непроцессированного Ab, которая содержит по меньшей мере один вариабельный домен ((например, вариабельный домен (например, человека, мыши, крысы, кролика или козы) тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего), вариабельный антигенсвязывающий домен верблюда (VHH) или домен нового антигенного рецептора (Ig-NAR) иммуноглобулина хрящевых рыб), способный специфично связываться с антигеном. Например, антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, может включать по меньшей мере часть Fc-фрагмента Ab, достаточную для того, чтобы опосредовать антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) у млекопитающих (например, человека), и/или коньюгирован с терапевтическим средством (например, любыми терапевтическими средствами, описанными в данном документе или известными из уровня техники). Неограничивающие примеры фрагментов Ab включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, Fv-фрагменты, диатела, линейные антитела, и мультиспецифические Ab, образованные из фрагментов Ab. Дополнительные фрагменты Ab, содержащие по меньшей мере один VHH домен верблюда или по меньшей мере один Ig-NAR домен хрящевых рыб, включают мини-тела, микро-антитела, субнано-антитела, и нано-антитела, и любые другие формы Ab, описанные в заявке на патент США №2010/0092470. Антигенсвязывающий фрагмент может являться, например, антигенсвязывающим фрагментом человека или гуманизированным IgG1, IgG2, IgG3 IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM.

[0010] Термин "антитело человека" означает Ab, которое кодируется нуклеиновой кислотой (например, реаранжированный локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека), которая присутствует в геноме человека. В некоторых вариантах осуществления Ab человека получают в культуре клеток млекопитающих (например, человека). В некоторых вариантах осуществления Ab человека получают в клетках, не относящийся к человеку (например, клеточной линии яичника китайского хомячка или клеточной линии мыши или хомячка). В некоторых вариантах осуществления Ab человека получают в клетках бактерий или дрожжей. Ab человека может включать конъюгированное терапевтическое средство (например, любые терапевтические средства, описанные в данном документе или известные из уровня техники). Ab человека может быть IgG1, IgG2, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM человека, и предпочтительно представляет собой IgG3 человека. Термин "истинное антитело человека" означает Ab с вариабельными участками тяжелой и легкой цепей, в норме присутствующие в сыворотке человека.

[0011] Термин "гуманизированное антитело" означает Ab, которое в основном содержит последовательности Ab человека, но также и включает немного последовательностей, полученных из Ig, отличного от Ig человека (например, мыши, крысы, кролика или козы). В неограничивающих примерах, гуманизированные Ab представляют собой Ab человека (Ab реципиента), в которых остатки гипервариабельного участка Ab реципиента заменены остатками гипервариабельного участка Ab видов, не являющихся человеком (Ab донора), например, Ab мыши, крысы, кролика или козы, имеющими необходимую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых вариантах осуществления остатки каркасного участка Fv Ig человека заменены соответствующими остатками не от человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные Ab могут содержать остатки, которые не присутствуют в Ab реципиента или в Ab донора. Данные модификации могут быть сделаны, чтобы дополнительно улучшить функциональные свойства Ab.

[0012] В некоторых вариантах осуществления гуманизированные Ab будут содержать существенную часть из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или существенная часть гипервариабельных петель (гипервариабельных участков) соответствуют таковым иммуноглобулина не от человека и все или существенная часть каркасных участков представляют собой последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константного участка Ig (Fc-фрагмента), обычно, такового из Ig человека (например, IgG3 человека). Гуманизированные Ab можно получить с использованием способов молекулярной биологии, хорошо известных из уровня техники. В данном документе описаны неограничивающие примеры способов создания гуманизированных Ab. Гуманизированное антитело может включать конъюгированное терапевтическое средство (например, любые терапевтические средства, описанные в данном документе или известные из уровня техники).

[0013] Термин "одноцепочечное антитело" означает одиночный полипептид, который содержит по меньшей мере один вариабельный связывающий домен (например, вариабельный домен Ig млекопитающих тяжелой или легкой цепи, вариабельный антигенсвязывающий домен (VHH) верблюда или домен нового антигенного рецептора (Ig-NAR) иммуноглобулина хрящевых рыб (например, акулы)), способный специфично связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных Ab описаны в данном документе, и известны из уровня техники (см., например, антитела, описанные в заявке на патент США №2010/0092470). Однодоменное антитело может включать конъюгированное терапевтическое средство (например, любые терапевтические средства, описанные в данном документе или известные из уровня техники).

[0014] Ab или его антигенсвязывающий фрагмент "специфично связывается" или "связывается специфично" с определенным антигеном, например, SpA (таким как эпитоп, содержащий SEQ ID NO: 1 или антигенным фрагментом под SEQ ID NO: 1), если оно связывается с данным антигеном, но распознает и связывается с другими молекулами в образце в меньшей степени (например, не распознает и не связывается). В некоторых вариантах осуществления Ab или его антигенсвязывающий фрагмент избирательно связывается с эпитопом с аффинностью (K_D), равной или менее чем 1×10^-10 М (например, менее чем 1×10^-11 М или менее чем 1×10^-12 М) в натрий-фосфатном буферном растворе (например, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса). Способность Ab или антигенсвязывающего фрагмента специфично связываться с белковым эпитопом можно определить с использованием любых способов, известных из уровня техники или тех способов, что описаны в данном документе.

[0015] Термин "гипервариабельный участок" или "CDR" означает участок в Ig (тяжелой или легкой цепи Ig), который образует часть антигенсвязывающего участка (паратопа) в Ab или его антигенсвязывающем фрагменте. Как известно из уровня техники, тяжелая цепь Ig в норме содержит три CDR: CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, и легкая цепь Ig в норме содержит три CDR: CDR1, CDR2 и CDR3. В любом Ab или его антигенсвязывающем фрагменте три CDR из тяжелой цепи Ig и три CDR из легкой цепи Ig вместе образуют антигенсвязывающий участок в Ab или его антигенсвязывающий фрагмент. База данных Kabat является одной системой, применяемой в данной области для нумерации последовательностей CDR, присутствующих в легкой цепи Ig или тяжелой цепи Ig.

[0016] Если не указано иное, то все технические и научные термины, которые используются в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. Способы и материалы описаны в данном документе для применения в настоящем изобретении; также можно применять другие, подходящие способы и материалы, известные из уровня техники. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, значения в базах данных и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в полном объеме путем ссылки на них. В случае возникновения конфликта, контрольным документом будет выступать настоящее описание, включая приведенные определения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0017] Фигура 1 представляет собой схематическое изображение SpA, демонстрирующее различные домены и расположение каждого из пяти антигенных пептидов. Показана последовательность антигенного пептида №5 (SEQ ID NO: 1).

[0018] Фигура 2 представляет собой серию из двух графических изображений, демонстрирующих гистограмму флуоресценции клинического штамма SA 00Х (верхняя часть) и штамма SA АТСС №25923 (нижняя часть), инкубированных с биотинилированными Ab PA8-G3 (светлая линия) или контрольных с биотинилированными Ab против интерлейкина-1 альфа (MABp1) (темная линия), а затем инкубированных со стрептавидином-АРС.

[0019] Фигура 3 представляет собой серию из двух графических изображений, демонстрирующая гистограмму флуоресценции клинического штамма 00Х (верхняя часть) и штамма АТСС №25923 (нижняя часть), инкубированных с немеченными Ab PA8-G3 (светлая линия) или немеченными Ab MABpl (темная линия), после чего следует биотинилированный рекомбинантный рецептор Fcγ 1, а затем инкубированных со стрептавидином-АРС.

[0020] Фигура 4 представляет собой графическое изображение среднего значения интенсивности флуоресценции дифференцированных клеток HL60 (с использованием сортировки клеток с флуоресценцией) после чего следует коинкубация с Ab PA8-G3, опсонизированных с меченным зеленым pHrodo штаммом АТСС №25923 или клиническим штаммом 00Х. Похожие образцы, инкубированные с контрольными Ab MABp1, вместо Ab PA8-G3, применяли в качестве отрицательного контроля.

[0021] Фигура 5 представляет собой серию из двух графических изображений, демонстрирующих интенсивность флуоресценции клинического штамма 00Х (верхняя часть) или АТСС №25923 (нижняя часть), предварительно инкубированного с сывороткой человека за 15 минут до добавления биотинилированных Ab PA8-G3 или Ab МАВР1 в качестве отрицательного контроля, а затем инкубированного со стрептавидином-АРС.

[0022] Фигура 6 представляет собой графическое изображение, демонстрирующее среднее значение интенсивности флуоресценции дифференцированных или недифференцированных клеток HL-60 после коинкубации с меченными зеленым pHrodo SA и одним из следующих немеченных Ab: PA7.2-G3, PA4-G3, PA8-G3, PA15-G3, PA21-G3, PA27-G3, PA32-G3, PA37-G3 или MABp1. Образцы Ab MABp1 применяли в качестве отрицательного контроля.

[0023] Фигуры 7A-D представляют собой графические изображения, демонстрирующие, что введение mAb РА8 повышает выживаемость субъектов-мышей, инфицированных S. aureus.

[0024] Фигуры 8А-С представляют собой графические изображения, демонстрирующие синергизм между PA8-G3 и ванкомицином.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0025] В данном документе описаны способы и композиции для лечения субъекта с инфекцией, вызванной SA, или снижения риска развития инфекции у субъекта, вызываемой SA.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты

[0026] В данном документе описаны очищенные или выделенные (например, по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% чистые по весу) Ab (например, предпочтительно "истинные" человеческие IgG3, IgG3 человека или гуманизированные IgG3), которые связываются с SpA и способны опосредовать опсонизацию бактерий SA, несмотря на экспрессию SA SpA, нейтрализирующего антитела (Ab). Предпочтительные указанные Ab связываются с пептидом под SEQ ID NO:1 с достаточной аффинностью связывания для вытеснения иммуноглобулинов IgG человека (например, одного или нескольких из IgG1, IgG2 и IgG4), связанных с SpA посредством их Fc-фрагмента. Предпочтительные Ab могут связываться с SpA посредством паратопов их Fab-фрагментов с K_D менее чем 1×10^-10 М (например, менее чем 1×10^-11 М, менее чем 1×10^-12 М, менее чем 0,5×10^-12 М или менее чем 1×10^-13 М) в физиологических условиях (например, в натрий-фосфатном буферном растворе) (например, как определено с использованием поверхностного плазмонного резонанса или био-слой интерферометрии с использованием рекомбинантного SpA). Например, описанные в данном документе Ab, которые связываются с SpA посредством их Fab-фрагментов с K_D от 1×10^-10 М до 0,5×10^-12 М, от 1×10^-11 М до 0,5×10^-12 М, от 1×10^-11 М до 0,2×10^-12 М (например, в физиологических условиях, например, в натрий-фосфатном буферном растворе, например, как определено с использованием поверхностного плазмонного резонанса с использованием рекомбинантного SpA), являются предпочтительными. Такие Ab иди антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, предпочтительно способны вытеснять Ab человека (например, один или несколько из IgG1, IgG2 и IgG4) связанные с SpA в клеточной стенке бактерии SA посредством их Fc-фрагментов. В данном документе также предусмотрены очищенные или выделенные (например, по меньшей мере на 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% чистые по весу) mAb (например, предпочтительно "истинные" человеческие IgG3, IgG3 человека или гуманизированные IgG3) которые специфично связываются с белком A (SpA) Staphylococcus aureus с K_D менее чем 1×10^-10 М посредством паратопов их Fab-фрагментов, где mAb способны опосредовать опсонизацию экспрессирующих SpA бактерий Staphylococcus aureus в присутствии по меньшей мере 1 мг/мл (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 или 100 мг/мл или количества, в норме содержащегося в сыворотке человека) иммуноглобулинов IgG, которые связываются с SpA посредством их Fc-фрагментов.

[0027] Очищенные или выделенные предусмотренные в данном документе Ab могут связываться с эпитопом, присутствующим во внеклеточном домене (например, присутствующим в участке повторов X_R и одном или нескольких IgG-связывающих доменах) SpA. Неограничивающие примеры антигена, который можно специфично распознать любым из Ab (или их антигенсвязывающих фрагментов), предусмотренные в данном документе, включают: 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 1 (например, фрагмент, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 под SEQ ID NO: 1); 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 82 (например, фрагмент, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 под SEQ ID NO: 82); 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 83 (например, фрагмент, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 под SEQ ID NO: 83); 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 84 (например, фрагмент, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 под SEQ ID NO: 84); 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 85 (например, фрагмент, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 под SEQ ID NO: 85); или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот из аминокислотных позиций от 1 до 20, от 10 до 30, от 20 до 40, от 30 до 50, от 40 до 60, от 50 до 70, от 60 до 80, от 70 до 90, от 80 до 100, от 90 до 110, от 100 до 120, от 110 до 130, от 120 до 140, от 130 до 150, от 140 до 160, от 150 до 170, от 160 до 180, от 170 до 190, от 180 до 200, от 190 до 210, от 200 до 220, от 210 до 230, от 220 до 240, от 230 до 250, от 240 до 260, от 250 до 270, от 260 до 280, от 270 до 290, от 280 до 300, от 290 до 310, от 300 до 320, от 310 до 330, от 320 до 340, от 330 до 350, от 340 до 360, от 350 до 370, от 360 до 380, 370 до 390, 380 до 400, 390 до 410, 400 до 420, 410 до 430, 420 до 440, или 430, или до 450 под SEQ ID NO: 86. Примеры других антигенов включают похожие фрагменты SpA, имеющие аминокислотные последовательности, отличающиеся от таковых под SEQ ID NO:86.

[0028] Способы определения способности Ab или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с целевым белком (например, SpA или его частью) можно выполнять с использованием способов, известных из уровня техники. Неограничивающие примеры указанных способов включают конкурентно-связывающие анализы с использованием Ab с известным свойством связывания с целевым белком (например, SpA), иммуноферментные анализы, BioCoRE®, колонки для аффинной хроматографии, иммуноблот или технологию белкового микрочипа. В некоторых вариантах осуществления активность связывания Ab или его антигенсвязывающего фрагмента определяют путем приведения в контакт бактерии SA с Ab или его антигенсвязывающим фрагментом. Иллюстративные способы определения способности Ab или антигенсвязывающего фрагмента вытеснять Ab человека (например, один или несколько из IgG1, IgG2 и IgG4), связанных с SpA в клеточной стенке бактерии SA, описаны в разделе примеров ниже. Дополнительные способы определения способности Ab или антигенсвязывающего фрагмента вытеснять Ab человека (например, один или несколько из IgG1, IgG2 и IgG4), связанных с SpA в клеточной стенке бактерии SA, известны из уровня техники.

[0029] Ab может быть, например, mAb, мультиспецифическим Ab (например, биспицефическим Ab), химерным Ab (например, гуманизированным Ab, таким как гуманизированное Ab IgG), Ab человека или фрагментом любого из вышеназванного. Например, Ab может быть моноклональным Ab IgG3 человека или гуманизированным моноклональным Ab IgG3. Ab может также быть одноцепочечным Ab (например, однодоменным Ab), таким как одноцепочечное Ab верблюдов или хрящевых рыб (например, акулы) или одноцепочечное Ab, которое содержит по меньшей мере один вариабельный антигенсвязывающий домен (VHH) верблюда или по меньшей мере один домен нового антигенного рецептора (Ig-NAR) иммуноглобулина хрящевых рыб (например, акулы) (см, например, Ab, описанные в заявке на патент США №2010/0092470). Ab может быть молекулой целого Ab или мультимером Ab.

[0030] Термин Ab также включает конъюгаты Ab (например, Ab, конъюгированное со стабилизирующим белком, меткой или терапевтическим средством (например, любым из терапевтических средств, описанных в данном документе или известных из уровня техники)). Ab, предусмотренное в данном документе может, например, включать Fc-фрагмент или часть Fc-фрагмента, достаточную для того, чтобы опосредовать Ab-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) у млекопитающих (например, человека), и/или конъюгировано с терапевтическим средством (например, любыми терапевтическими средствами, описанными в данном документе или известными из уровня техники). Ab может быть, например, IgG1, IgG2, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM человека или гуманизированным IgG1, IgG2, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM, и предпочтительно представляет собой IgG3 человека или гуманизированный IgG3.

[0031] Антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, может, например, включать по меньшей мере часть Fc-фрагмента, достаточную для того, чтобы опосредовать Ab-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) у млекопитающих (например, человека), и/или конъюгирован с терапевтическим средством (например, любыми терапевтическими средствами, описанными в данном документе или известными из уровня техники). Неограничивающие примеры Ab фрагментов включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, одноцепочечные Fv- (scFv-), Fv-фрагменты, фрагменты, содержащие либо вариабельный домен легкой, либо тяжелой, диатела, линейные Ab и мультиспецифические Ab, образованные из фрагментов Ab. Дополнительные фрагменты Ab, содержащие по меньшей мере один VHH домен верблюда или по меньшей мере один Ig- NAR домен хрящевых рыб, включают мини-тела, микро-Ab, субнано-Ab, и нано- Ab, и любые другие формы Ab, описанные в заявке на патент США №2010/0092470.

[0032] Ab или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, и IgY человека или гуманизированные IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, и IgY), класса (например, IgG1 человека или гуманизированные IgG1 (например, IgG1a или IgG1b), IgG2 человека или гуманизированные IgG2 (например, IgG2a или IgG2b), IgG3 человека или гуманизированные IgG3 (например, IgG3a или IgG3b), IgG4 человека или гуманизированные IgG4 (например, IgG4a или IgG4b), IgA1 человека или гуманизированные IgA1, и IgA2 человека или гуманизированные IgA2) или подкласса, хотя предпочтительными являются те, у которых низкая аффинность связывания SpA с Fc-фрагментом (например, имеющим K_D выше 1×10^-7 М, 1×10^-6 М, 1×10^-5 М, 1×10^-4 М или 1×10^-3 М; или имеющим K_D выше, чем для SpA и Fc-фрагментом IgG1 человека) в физиологических условиях (например, в натрий-фосфатном буферном растворе) (например, как определено с использованием поверхностного плазмонного резонанса с использованием рекомбинантного SpA). Антигенсвязывающий фрагмент может быть, например, антигенсвязывающим фрагментом IgG1 человека или гуманизированного IgG1 (например, IgG1a или IgG1b), IgG2 человека или гуманизированного IgG2 (например, IgG2a или IgG2b), IgG4 человека или гуманизированного IgG4 (например, IgG4a или IgG4b), IgD человека или гуманизированного IgD, IgA (например, IgA1 или IgA2), IgE человека или гуманизированного IgE или IgM человека или гуманизированного IgM, и предпочтительно представляет собой фрагмент IgG3 человека или гуманизированного IgG3 (например, IgG3a или IgG3b). Аминокислотные мутации можно вводить в константный участок данных подклассов IgG. Аминокислотные мутации, которые можно вводить, могут быть, например, такими, которые повышают связывание с рецепторами для Fc-фрагмента (как описано, например, в Proc. Natl Acad. Set U.S.A. 103(11): 4005-4010, 2006; MAb 1(6): 572-579, 2009; US 2010/0196362; US 2013/0108623; US 2014/0171623; US 2014/0093496; и US 2014/0093959) или повышают или снижают связывание с FcRn (как описано, например, в J. Biol Chem. 276(9): 6591-6604, 2001; Int Immunol. 18(12): 1759-1769, 2006; и J. Biol. Chem. 281(33): 23514-23524, 2006).

[0033] Два типа Н-цепей гетерологично соединены с получением биспецифичного Ab. Технология "выступы-во-впадины" (как описано, например, в J. Immunol Methods 248(1-2): 7-15, 2001; и J. Biol. Chem. 285(27): 20850-20859, 2010), технология электростатического отталкивания (как описано, например, в WO 06/106905), технология SEEDbody (как описано, например, в Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202, 2010), и подобные можно применять для гетерологичного соединения двух типов Н-цепей посредством СН3-домена. Любые антитела, описанные в данном документе, могут быть таковыми с модифицированной цепью или дефицитными по сахарной цепи. Примеры антител, содержащих модифицированные углеводные цепи, включают антитела, сконструированные посредством гликозилирования (как описано, например, в WO 99/54342), антитела с дефукозилированными углеводными цепями (как описано, например, в WO 00/61739, WO 02/31140, WO 06/067847 и WO 06/067913), и антитела, имеющие сахарную цепь с GlcNAc в точке ветвления (как описано, например, в WO 02/79255). Известные примеры способов получения антител IgG, дефицитных по сахарной цепи, включают способ введения в тяжелой цепи мутации в аспарагин в положении 297 нумерации EU (J. Clin. Pharmacol. 50(5): 494-506, 2010), и способ получения IgG с использованием Е. coli (J. Immunol. Methods 263(1-2): 133-147, 2002; и J. Biol. Chem. 285(27): 20850-20859, 2010). Кроме того, гетерогенность, сопутствующая делеции С-концевого лизина в IgG, и гетерогенность, сопутствующая нарушению комплементарности дисульфидных связей в шарнирном участке IgG2 можно снизить путем введения аминокислотных делеций/замен (как описано, например, в WO 09/041613). Любые из Ab или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, включают по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) аминокислоту (например, добавленную, вставленную или замещенную аминокислоту, например, за пределами CDR), которая не присутствует в соответствующем Ab человека. Любые из Ab или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, могут также характеризоваться по меньшей мере одной удаленной аминокислотой (например, в сравнении с соответствующим Ab человека), например, N- или С-концевой делецией легкой или тяжелой цепи или делецией аминокислоты константного домена (например, Fc-фрагмента).

[0034] SpA или его фрагмент (например, по меньшей мере 7, 8, 9 или 10 смежных аминокислот под SEQ ID NO: 1 (например, начинающийся с аминокислотной позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 под SEQ ID NO: 1) или все под SEQ ID NO: 1) можно применять в качестве иммуногенного вещества для создания Ab с использованием стандартных методик получения поликлональных и моноклональных Ab. Ab фрагменты можно создавать из моноклональных Ab с использованием способов, хорошо известных из уровня техники.

[0035] Иммуногенное вещество обычно применяют для получения Ab путем иммунизации подходящего субъекта (например, кролика, козы, мыши или другого млекопитающего). Подходящее получение иммуногенным путем может содержать, например, экспрессированный рекомбинантно или химически синтезированный полипептид. Получение может дополнительно включать вспомогательное вещество, такое как полный или неполный адъювант Фрейнда или похожее иммуностимулирующее средство.

[0036] В качестве альтернативы для получения моноклональных Ab-секретирующих гибридом, моноклональное Ab, направленное против полипептида, можно определить и выделить путем скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных иммуноглобулинов (например, библиотеки фагового отображения Ab) на предмет полипептида, представляющего интерес. Наборы для создания и скрининга библиотек фагового отображения являются коммерчески доступными (например, набор Recombinant Phage Antibody System от Pharmacia, № по каталогу 27-9400-01; и набор SurfZAP* Phage Display от Stratagene, № по каталогу 240612). Дополнительно, примеры способов и реагентов, особенно пригодных для применения в создании и скрининге библиотеки отображения Ab, можно найти, например, в заявке на патент США №5223409; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/2079; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85, 1992; Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734, 1993.

[0037] Дополнительные способы выделения и секвенирования Ab человека (например, IgG3 человека), которое специфично связывается с эпитопом SpA (например, эпитопом, расположенным или определенным в пределах полипептида под SEQ ID NO: 1) описаны в разделе примеров ниже. Дополнительные общие способы создания Ab и антигенсвязывающих фрагментов описаны в заявке на патент США №2011/0059085.

[0038] В некоторых вариантах осуществления Ab или антигенсвязывающие фрагменты, предусмотренные в данном документе, представляют собой Ab человека или гуманизированные Ab (например, Ab IgG3 человека или гуманизированные Ab IgG3). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное Ab представляет собой Ab человека, сконструированное так, чтобы содержать по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR), присутствующий в Ab не от человека (например, Ab крысы, мыши, кролика или козы). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное Ab или его фрагмент может содержать все три CDR легкой цепи человека или Ab не от человека, которое специфично связывается с эпитопом SpA (например, эпитопом, расположенным или определенным в пределах полипептида под SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные Ab или его фрагмент может содержать все три CDR тяжелой цепи человека или Ab не от человека, которое специфично связывается с эпитопом SpA (например, эпитопом, расположенным или определенным в пределах полипептида под SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные Ab или его фрагмент может содержать все три CDR тяжелой цепи и все три CDR легкой Ab не от человека или моноклонального Ab человека, которое специфично связывается с эпитопом SpA (например, эпитопом, расположенным или определенным в пределах полипептида под SEQ ID NO: 1).

[0039] Ab по настоящему изобретению могут также включать мультимерные формы Ab. Например, Ab по настоящему изобретению могут принимать вид димеров, тримеров Ab или мультимеров молекул мономерного иммуноглобулина более высокого порядка. Димеры молекул целого иммуноглобулина или F(аb')₂-фрагментов представляют собой тетраваленты, в то время как димеры Fab-фрагментов или молекул scFv представляют собой биваленты. Отдельные мономеры внутри мультимера Ab могут быть идентичными или различными, т.е., они могут быть гетеромерными или гомомерными мультимерами Ab. Например, отдельные Ab внутри мультимера могут обладать той же или иной специфичностью связывания.

[0040] Мультимеризацию Ab можно совершать путем естественной агрегации Ab или при помощи техник химического или рекомбинантного связывания, известных из уровня техники. Например, определенный процент очищенных продуктов Ab (например, очищенных молекул IgG1) самостоятельно образует белковые агрегаты, содержащие гомодимеры Ab и другие мультимеры Ab более высокого порядка. В качестве альтернативы, гомодимеры Ab можно образовывать при помощи техник химического связывания, известных из уровня техники. Например, гетеробифункциональные сшивающие агенты, включающие без ограничения SMCC (сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтио-ацетат) (доступные, например, от Pierce Biotechnology, Inc. (Рокфорд, Иллинойс)), можно применять для образования мультимеров Ab. Иллюстративный протокол образования гомодимеров Ab представлен Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры Ab можно преобразовать до гомодимеров Fab'2-фрагментов путем ферментативного расщепления с пепсином. Другим путем получения гомодимеров Ab является путь при помощи применения аутофильного пептида Т15, описанного Zhao et al. (J. Immunol. 25:396-404, 2002).

[0041] В качестве альтернативы, можно подталкивать мультимеризацию Ab, используя методики рекомбинантных ДНК. IgM и IgA естественным образом образовывают мультимеры Ab путем взаимодействия с полипептидом зрелой J-цепи. Молекулы иммуноглобулинов, которые не являются IgA или IgM, такие как молекулы IgG, можно сконструировать так, чтобы они содержали домен взаимодействия J-цепи IgA или IgM, таким образом, придавая способность образовывать мультимеры более высокого порядка на молекулах иммуноглобулинов, которые не являются IgA или IgM (см., например, Chintalacharuvu et al., Clin. Immunol. 101:21-31, 2001, и Frigerio et al., Plant Physiol. 123:1483-1494, 2000). Димеры IgA естественным образом секретируют в полость органов, выстланных слизистой оболочкой. Данная секреция опосредована посредством взаимодействия J-цепи с полимерным рецептором IgA (p1gR) на эпителиальных клетках. Если секреция формы I