Регуляторные элементы растений и их применение

Регуляторные элементы растений и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка утверждает преимущество предварительной заявки Соединенных Штатов № 61/635945, поданной 20 апреля 2012 года, и непредварительной заявки Соединенных Штатов № 13/830403, поданной 14 марта 2013 года, которые в настоящем документе включены в виде ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, содержащихся в файле с названием «MONS326WO_ST25.txt», который содержит 22 килобайта (как определено в Microsoft Windows®) и был создан 10 апреля 2013 года, подан при этом для электронного представления и включен посредством ссылки в настоящий документ.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии растений и генной инженерии растений. А именно, настоящее изобретение относится к молекулам ДНК, полезным для модуляции экспрессии генов в растениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Регуляторные элементы представляют собой генетические элементы, которые регулируют активность генов путем модуляции транскрипции функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Такие элементы включают промоторы, лидерные последовательности, интроны и 3'-нетранслируемые области и являются полезными в области молекулярной биологии растений и генной инженерии растений.

Трансгенным культурам, экспрессирующим трансгены, которые дают преимущество растению в период прорастания в холодных и влажных стрессовых условиях, требуются регуляторные элементы, которые обладают профилями экспрессии в тканях, которые являются наиболее благоприятными для экспрессии таких трансгенов. Такие регуляторные элементы в развивающемся семени должны экспрессироваться в достаточной степени относительно возможности накопления трансгенных продуктов, которые могут действовать быстро в случае, когда семя прорастет в холодных и/или влажных условиях, а также обеспечивать экспрессию на ранних стадиях прорастания и формирования всходов. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет новые регуляторные элементы, которые демонстрируют более высокие уровни экспрессии в развивающемся и прорастающем семени и могут быть использованы для управления экспрессией трансгенов, которые обеспечивают преимущество при прорастании в холодных и/или влажных условия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет новые генные регуляторные элементы для применения в растениях. Настоящее изобретение также предоставляет ДНК-конструкции, содержащие регуляторные элементы. Настоящее изобретение также предоставляет трансгенные клетки растений, растения и семена, содержащие регуляторные элементы. Могут предоставляться последовательности, функционально связанные с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В одном варианте осуществления транскрибируемая полинуклеотидная молекула может быть гетерологичной относительно регуляторной последовательности, предоставленной в настоящем документе. Последовательность регуляторного элемента, предоставленного изобретением, таким образом, может в конкретных вариантах осуществления быть определена как функционально связанная с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. Настоящее изобретение также предоставляет способы изготовления и применения регуляторных элементов, ДНК-конструкции, содержащие регуляторные элементы, и трансгенные клетки растений, растения, семена, содержащие регуляторные элементы, функционально связанные с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой.

В одном аспекте изобретение предоставляет молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: (a) последовательности с, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8, где фрагмент обладает геннорегуляторной активностью, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В одном варианте осуществления молекула ДНК имеет, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью ДНК любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8. В другом варианте осуществления молекула ДНК имеет, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью ДНК любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8. В другом варианте осуществления последовательность ДНК обладает геннорегуляторной активностью. В еще одном варианте осуществления гетерологичная транскрибируемая полинуклеотидная молекула содержит ген, представляющий агрономический интерес. В других вариантах осуществления ген, представляющий агрономический интерес, придает растениям устойчивость к гербицидам или устойчивость к вредителям.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет трансгенную клетку растения, включающую молекулу гетерологичной ДНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) последовательности, имеющей, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8, где фрагмент имеет геннорегулирующую активность, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В вариантах осуществления трансгенная клетка растения может представлять собой клетку однодольного растения или клетку двудольного растения.

В других вариантах осуществления изобретение предоставляет трансгенное растение или его часть, содержащее молекулу ДНК, выбранную из группы, состоящей из: (a) последовательности, имеющей, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8, где фрагмент обладает геннорегулирующей активностью, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет растение-потомок любого поколения такого трансгенного растения или его части, где растение-потомок или его часть содержит молекулу ДНК, как описано выше. В еще одном варианте осуществлении изобретение предоставляет трансгенное семя, где семя содержит молекулу ДНК, как описано выше.

В другом аспекте изобретение предоставляет трансгенную кассету, содержащую группу транскрипционных регулирующих экспрессию элементов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 6 и 8, где группа транскрипционных регулирующих экспрессию элементов функционально связана с гетерологичной кодирующей последовательностью, которая функционально связана с 3'UTR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 11, 12 и 13. В варианте осуществления трансгенная кассета содержит группу транскрипционных регулирующих экспрессию элементов, представленную как SEQ ID NO: 1, где группа транскрипционных регулирующих экспрессию элементов функционально связана с гетерологичной кодирующей последовательностью, функционально связанной с 3'UTR, представленной как SEQ ID NO: 10. В другом варианте осуществления трансгенная кассета содержит группу транскрипционных регулирующих экспрессию элементов, представленную как SEQ ID NO: 6, где группа транскрипционных регулирующих экспрессию элементов функционально связана с гетерологичной кодирующей последовательностью, функционально связанной с 3'UTR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11 и 12. В еще одном варианте осуществления трансгенная кассета содержит группу транскрипционных регулирующих экспрессию элементов, представленную как SEQ ID NO: 8, где группа транскрипционных регулирующих экспрессию элементов функционально связана с гетерологичной кодирующей последовательностью, функционально связанной с 3'UTR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 и 13. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ получения товарного продукта, включающий получение трансгенного растения или его части, содержащего последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: (a) последовательности, имеющей, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8, где фрагмент обладает геннорегулирующей активностью, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой, и производство из него товарной продукции. В варианте осуществления товарный продукт представляет собой белковый концентрат, белковый изолят, зерно, крахмал, семена, шрот, муку, биомассу или масло семян.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ экспрессии транскрибируемой полинуклеотидной молекулы, включающий получение трансгенных растений, содержащих последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: (a) последовательности, имеющей, по меньшей мере, около 85 процентов идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; (b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8; и (c) фрагмента любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 или 8, где фрагмент обладает геннорегулирующей активностью, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой, а также культивирование растения, в котором экспрессируется транскрибируемый полинуклеотид.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 демонстрирует экспрессию β-глюкуронидазы (GUS) в трансгенном развивающемся зародыше кукурузы и тканях эндосперма, вызванную различными конфигурациями трансгенных кассет. Каждая конфигурация трансгенной кассеты состоит из последовательности, кодирующей GUS, функционально связанной с группой транскрипционных регулирующих экспрессию элементов EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO: 6), и EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8), и 3'UTR T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11), T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO: 12), и T-Os.Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13), как показано в таблице 3 примера 3.

Фиг. 2 демонстрирует экспрессию β-глюкуронидазы (GUS) в отдельных тканях трансгенной кукурузы, вызванную различными конфигурациями трансгенных кассет. Каждая конфигурация трансгенной кассеты состоит из последовательности, кодирующей GUS, функционально связанной с группой транскрипционных регулирующих экспрессию элементов EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO: 6), и EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8), и 3'UTR T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11), T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO: 12), и T-Os.Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13), как показано в таблице 3 примера 3.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 - последовательность группы транскрипционных регулирующих экспрессию элементов или ЕХР, ЕХР-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1, состоящая из промотора P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2), который функционально связан с 5'-концом лидера L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), который функционально связан с интроном I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 5).

SEQ ID NO: 2 - последовательность промотора P-Zm.Nac-1:1:2.

SEQ ID NO: 3 - последовательность, содержащая промотор P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2), который функционально связан с 5'-концом лидера L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4).

SEQ ID NO: 4 - последовательность лидера L-Zm.Nac-1:1:1.

SEQ ID NO: 5 - последовательность интрона I-Zm.DnaK-1:1:1.

SEQ ID NO: 6 - последовательность группы транскрипционных регулирующих экспрессию элементов или ЕХР, ЕХР-Zm.Nac+Os.FBA:1:1, которая состоит из промотора P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2), который функционально связан с 5'-концом лидера L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), который функционально связан с интроном I-Os.FBA-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 7).

SEQ ID NO: 7 - последовательность интрона I-Os.FBA-1-1:1:1.

SEQ ID NO: 8 - последовательность группы транскрипционных регулирующих экспрессию элементов или ЕХР, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1, которая состоит из промотора P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2), который функционально связан с 5'-концом лидера L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), который функционально связан с интроном I-Os.Cab-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 9).

SEQ ID NO: 9 - последовательность интрона I-Os.Cab-1-1:1:1.

SEQ ID NO: 10 - последовательность 3'UTR T-AGRtu.nos-1:1:13.

SEQ ID NO: 11 - последовательность 3'UTR T-Os.CLUS33428_1-1:1:1.

SEQ ID NO: 12 - последовательность 3'UTR T-Os.Mth-1:1:1.

SEQ ID NO: 13 - последовательность 3'UTR T-Os.Ara5-1:1:1.

SEQ ID NO: 14 - кодирующая последовательность маркерного гена β-глюкуронидазы.

SEQ ID NO: 15 - последовательность группы транскрипционных регулирующих экспрессию элементов или EXP, EXP-CaMV.35S:1:1, включающая промотор и лидер 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV).

SEQ ID NO: 16 - последовательность группы транскрипционных регулирующих экспрессию элементов или EXP, EXP-Os.Act1:1:1, включающая промотор, лидер и интрон актина 1 риса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предоставляет новые полинуклеотидные молекулы, обладающие благоприятной геннорегулирующей активностью, из видов растений. Изобретение также предоставляет ДНК-конструкции, содержащие регуляторные элементы, а также трансгенные клетки растений, растения и семена, содержащие регуляторные элементы. Нуклеотидные последовательности этих полинуклеотидных молекул представлены как SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 и 8. Изобретением предусмотрено проектирование, конструирование и использование этих полинуклеотидных молекул. Эти полинуклеотидные молекулы способны, к примеру, оказывать влияние на экспрессию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы в тканях растений, и, следовательно, к избирательной регуляции генной экспрессии или активности кодируемого генного продукта в трансгенных растениях. Настоящее изобретение также предоставляет способы изготовления и использования регуляторных элементов, ДНК-конструкций, содержащих промоторы и/или другие известные нуклеотидные последовательности, и способы их подготовки и применения. Изобретение также предоставляет трансгенные растительные клетки, растения и семена, содержащие регуляторные элементы, функционально связанные с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой, а также трансформированные клетки-хозяева.

Последовательности ДНК по настоящему изобретению могут быть предоставлены функционально связанными с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В одном варианте осуществления транскрибируемая полинуклеотидная молекула может быть гетерологичной относительно регуляторной последовательности, предоставленной в настоящем документе. Последовательность регуляторного элемента, предоставленная изобретением, таким образом, в определенных вариантах осуществления может быть определена как функционально связанная с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой.

Далее представлены определения и способы, чтобы лучше охарактеризовать настоящее изобретение и как руководство для любых специалистов в рассматриваемой области в практике настоящего изобретения. Если не указано иное, термины должны пониматься в соответствии с обычным использованием любыми специалистами в соответствующей области техники.

Молекулы ДНК

Как используется в настоящем документе, термин «ДНК» или «молекула ДНК» относится к двухцепочечной молекуле ДНК геномного или синтетического происхождения, т.е. полимеру дезоксирибонуклеотидных оснований или полинуклеотидной молекуле, читаемой от 5'-конца (расположенного вверх по течению) к 3'-концу (расположенному вниз по течению). Как используется в настоящем документе, термин «последовательность ДНК» относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Используемая в настоящем документе номенклатура соответствует таковой Наименования 37 Свода федеральных нормативных актов США § 1.822 и изложенным в таблицах стандартам ВОИС ST.25 (1998), Приложение 2, таблицы 1 и 3.

Как используется в настоящем документе, термин «выделенная молекула ДНК» относится к молекуле ДНК, по меньшей мере, частично отделенной от других молекул, обычно связанной с ней в ее нативном или естественном состоянии. В одном варианте осуществления термин «выделенный» относится к молекуле ДНК, которая, по меньшей мере, частично отделена от некоторых нуклеиновых кислот, которые обычно контактируют с молекулой ДНК в ее нативном или естественном состоянии. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями, с которыми они обычно не ассоциируются, например, в результате рекомбинантных технологий, считаются выделенными в настоящем документе. Такие молекулы считаются выделенными в случае, когда интегрированы в хромосому клетки-хозяина или присутствуют в растворе нуклеиновых кислот с другими молекулами ДНК, в котором они не находятся в своем природном состоянии.

Любое количество способов, которые хорошо известны специалистам в рассматриваемой области техники, может быть использовано для выделения и манипулирования молекулой ДНК или ее фрагментом, как раскрыто в настоящем изобретении. Например, технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть использована для амплификации определенной начальной молекулы ДНК и/или продуцирования вариантов исходной молекулы. Молекулы ДНК или их фрагменты могут также быть получены с помощью других способов, например, путем непосредственного синтеза фрагмента с помощью химических средств, как это обычно практикуется с использованием автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов.

Как используется в настоящем документе, термин «идентичность последовательности» относится к степени, в которой две оптимально выровненные полинуклеотидные последовательности или две оптимально выровненные полипептидные последовательности идентичны. Оптимальное выравнивание последовательностей создается путем выравнивания двух последовательностей вручную, например, референсной последовательности и другой последовательности, чтобы максимизировать число нуклеотидных совпадений при выравнивании последовательностей с соответствующими внутренними нуклеотидными вставками, делециями или пробелами. Как используется в настоящем документе, термин «референсная последовательность» относится к последовательности, предоставленной в качестве полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 и 8.

Как используется в настоящем документе, термин «процент идентичности последовательностей» или «процент идентичности» или «% идентичности» представляет собой фракцию идентичности, умноженную на 100. «Фракция идентичности» для последовательности, оптимально выровненной с референсной последовательностью, представляет собой число нуклеотидных совпадений при оптимальном выравнивании, деленное на общее число нуклеотидов в референсной последовательности, например, общее число нуклеотидов в полной длине всей референсной последовательности. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение предоставляет молекулу ДНК, содержащую последовательность, которая при оптимальном выравнивании с референсной последовательностью, представленной в настоящем документе как SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6 и 8, имеет, по меньшей мере, 85% идентичности, по меньшей мере, 90% идентичности, по меньшей мере, около 95% идентичности, по меньшей мере, около 96% идентичности, по меньшей мере, около 97% идентичности, по меньшей мере, приблизительно 98% идентичности или, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичности с референсной последовательностью. В определенных вариантах осуществления такие последовательности могут быть определены как обладающие геннорегулирующей активностью.

Регуляторные элементы

Регуляторный элемент представляет собой молекулу ДНК, обладающую геннорегулирующей активностью, т.е. таковую, которая обладает способностью оказывать влияние на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Термин «геннорегуляторная активность», таким образом, относится к способности влиять на профиль экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы путем влияния на транскрипцию и/или трансляцию этой функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Как используется в настоящем документе, группа транскрипционных регуляторных экспрессионных элементов (EXP) может состоять из элементов экспрессии, таких как энхансеры, промоторы, лидерные последовательности и интроны, функционально связанные. Таким образом, группа транскрипционных регуляторных экспрессионных элементов может состоять, например, из промотора, функционально связанного 5' с лидерной последовательностью, которая, в свою очередь, функционально связана 5' с интронной последовательностью. Последовательность интрона может состоять из последовательности, начинающейся в точке первой интрон/экзон границы нативной последовательности, и может также состоять из небольшого лидерного фрагмента, содержащего вторую интрон/экзонную границу, с тем, чтобы обеспечить надлежащий интрон/экзонный процессинг для облегчения транскрипции и правильного процессинга полученного транскрипта. Лидерные последовательности и интроны могут позитивно влиять на транскрипцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы, а также трансляцию полученной в результате транскрибированной РНК. Предварительно процессированная молекула РНК содержит лидерные последовательности и интроны, которые могут влиять на пост-транскрипционный процессинг транскрибируемых РНК и/или экспорт транскрибируемой молекулы РНК из ядра клетки в цитоплазму. После пост-транскрипционного процессинга транскрибируемой молекулы РНК лидерная последовательность может сохраняться как часть конечной матричной РНК и может положительно влиять на трансляцию молекулы матричной РНК.

Регуляторные элементы, такие как промоторы, лидерные последовательности, интроны и области терминации транскрипции, представляют собой молекулы ДНК, которые обладают геннорегуляторной активностью и играют неотъемлемую роль в общей экспрессии генов в живых клетках. Термин «регуляторный элемент» относится к молекуле ДНК, обладающей геннорегуляторной активностью, т.е. такой, которая обладает способностью влиять на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Выделенные регуляторные элементы, такие как промоторы и лидерные последовательности, которые функционируют в растениях, являются, следовательно, полезными для изменения фенотипов растений способами генной инженерии.

Регуляторные элементы могут быть охарактеризованы по их эффектам на профиль экспрессии (качественно и/или количественно), например, положительные или отрицательные эффекты и/или конститутивные или иные эффекты, например, по их временному, пространственному, возрастному, тканевому, экологическому, физиологическому, патологическому, относящемуся к клеточному циклу и/или химически реагирующему профилю экспрессии, и любые их сочетания, а также по количественным или качественным показателям. Промотор может быть полезен в качестве регуляторного элемента для регулирования экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы.

Как используется в настоящем документе, «профиль генной экспрессии» представляет собой любой профиль транскрипции функционально связанной молекулы ДНК в транскрибированную молекулу РНК. Транскрибированная молекула РНК может быть транслирована для продуцирования белковой молекулы или может предоставлять антисмысловую или другую регуляторную молекулу РНК, такую как мРНК, дцРНК, тРНК, рРНК, микроРНК и тому подобное.

Как используется в настоящем документе, термин «белковая экспрессия» представляет собой любой профиль трансляции транскрибированной молекулы РНК в белковую молекулу. Белковая экспрессия может характеризоваться временными, пространственными, относящимися к развитию или морфологическими качествами, а также количественными или качественными показателями.

Как используется в настоящем документе, термин «промотор» относится обычно к молекуле ДНК, которая участвует в распознавании и связывании РНК-полимеразы II и других белков (транс-действующих факторов транскрипции) для инициации транскрипции. Промотор может быть изначально изолирован из 5'-регуляторной области (5'UTR) геномной копии гена. Кроме того, промоторы могут представлять собой полученные синтетически или обработанные молекулы ДНК. Промоторы также могут являться химерными, т.е. промотор, полученный посредством слияния двух или более гетерологичных молекул ДНК. Промотор, полезный в практике настоящего изобретения, может включать в себя SEQ ID NO: 3 или ее фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления изобретения такие молекулы и любые варианты или производные этого, как описано в настоящем документе, определены как обладающие промоторной активностью, т.е. способны выступать в качестве промотора в клетке-хозяине, такой, как в трансгенных растениях. В еще более специфических вариантах осуществления фрагмент может быть определен как проявляющий промоторную активность, которой обладала начальная промоторная молекула, из которой он образован, или фрагмент может содержать «минимальный промотор», который обеспечивает базальный уровень транскрипции и состоит из TATA-бокса или эквивалентной последовательности для распознавания и связывания комплекса РНК-полимеразы II для инициации транскрипции.

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет фрагменты промоторной последовательности, как раскрыто в настоящем документе. Промоторные фрагменты могут обладать промоторной активностью, как описано выше, и могут быть использованы самостоятельно или в комбинации с другими промоторами и промоторными фрагментами, такими как, например, при конструировании химерных промоторов. В конкретных вариантах осуществления предоставляются фрагменты промотора, содержащие, по меньшей мере, примерно 50, 95, 150, 250, 500, 750 или, по меньшей мере, примерно 1000 смежных нуклеотидов или более обладающей промоторной активностью полинуклеотидной молекулы, раскрытой в настоящем документе.

Композиции, полученные из промотора, представленного как SEQ ID NO: 3, такие, как внутренняя или 5'-делеции, например, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области техники, для увеличения или изменения экспрессии, в том числе путем устранения элементов, которые оказывают положительное или отрицательное воздействие на экспрессию; дублирования элементов, которые оказывают положительное или отрицательное воздействие на экспрессию; и/или дублирования или удаления элементов, которые обладают ткане- или клеточно-специфическим воздействием на экспрессию. Могут быть использованы композиции, полученные из промотора, представленного как SEQ ID NO: 3, содержащая 3'-делеции, в котором удаляется элемент TATA-бокс или эквивалентная последовательность этого и расположенная ниже по течению последовательность, например, чтобы образовать энхансерные элементы. Можно сделать дополнительные делеции, чтобы удалить какие-либо элементы, которые оказывают положительный или отрицательный; ткане-специфический; клеточно-специфический; или время-специфический (такой как, без ограничения, циркадные ритмы) эффекты на экспрессию. Промотор, представленный как SEQ ID NO: 3, и фрагменты или энхансеры, полученные на ее основе, могут быть использованы для создания композиций химерных транскрипционных регуляторных элементов, содержащих промотор, представленный как SEQ ID NO: 3, и фрагменты или энхансеры, полученные из этого, функционально связанные с другими энхансерами и промоторами. Эффективность модификаций, дупликаций или делеций, описанных в настоящем документе, на нужные аспекты экспрессии конкретного трансгена может быть проверена эмпирически в стационарных и полевых тестах на растениях, таких, как описано в рабочих примерах в настоящем документе, с тем, чтобы проверить результаты, которые могут различаться в зависимости от сделанных изменений и цели изменения в начальной молекуле.

Как используется в настоящем документе, термин «лидер» относится к молекуле ДНК, выделенной из нетранслируемой 5' области (5'UTR) геномной копии гена и определяемой, как правило, как нуклеотидный сегмент между участком начала транскрипции (TSS) и участком начала кодирующей последовательности белка. Кроме того, лидеры могут представлять собой полученные синтетически или обработанные элементы ДНК. Лидер может быть использован в качестве 5'-регуляторного элемента для регулирования экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Лидерные молекулы могут использоваться с гетерологичным промотором или со своим собственным промотором. Промоторные молекулы по настоящему изобретению, таким образом, могут быть функционально связаны со своим собственным лидером или могут быть функционально связаны с гетерологичным лидером. Лидер, полезный в практике настоящего изобретения, представлен как SEQ ID NO: 4 или его фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления могут быть предоставлены такие последовательности, определенные как обладающие способностью действовать в качестве лидера в клетке-хозяине, в том числе, например, трансгенной клетке растения. В одном варианте осуществления такие последовательности декодируются как обладающие лидерной активностью.

Лидерная последовательность (5'UTR), представленная как SEQ ID NO: 4, может состоять из регуляторных элементов или может принимать вторичные структуры, которые могут оказывать влияние на транскрипцию или трансляцию трансгена. Эта лидерная последовательность может быть использована в соответствии с настоящим изобретением для создания химерных регуляторных элементов, которые влияют на транскрипцию или трансляцию трансгена. Кроме того, может использоваться лидерная последовательность, представленная как SEQ ID NO: 4, для создания химерных лидерных последовательностей, которые влияют на транскрипцию или трансляцию трансгена.

Введение чужеродного гена в новое растение-хозяин не всегда приводят к высокой экспрессии привнесенного гена. Кроме того, в случае сложных признаков иногда необходимо модулировать несколько генов с различным пространственным или временным профилем экспрессии. Интроны принципиально могут обеспечить такую модуляцию. Однако многократное использование одного и того же интрона в одном растении, как было показано, обнаруживает недостатки. В этих случаях необходимо иметь набор основных контрольных элементов для конструирования соответствующих рекомбинантных элементов ДНК. Число интронов, известных в рассматриваемой области техники как обладающие свойствами, увеличивающими экспрессию, является ограниченным, и, таким образом, необходимы альтернативы.

Композиции, полученные из любого из интронов, представленных как SEQ ID NO: 5, 7 и 9, могут состоять из внутренней делеции или дупликации cis-регуляторных элементов. Кроме того, изменения 5'- и 3'- последовательностей, включающие интрон/экзонные границы, могут быть использованы для улучшения экспрессии или специфичности экспрессии в случае функциональной связи с промотором + лидером или химерным промотором + лидером и кодирующей последовательностью. Изменения 5'- и 3'-областей, включающих интрон/экзонные границы, также можно осуществлять для уменьшения потенциала для индуцирования ложных инициирующих кодонов и стоп-кодонов, производимых в полученном транскрипте после процессинга и сплайсинга матричной РНК. Интроны могут быть проверены эмпирически, как описано в рабочих примерах, чтобы определить влияние интрона на экспрессию трансгена.

В соответствии с настоящим изобретением, промотор или фрагмент промотора может быть проанализирован на наличие известных промоторных элементов, т.е. характерных особенностей последовательностей ДНК, таких как TATA-бокс и другие известные мотивы сайтов связывания транскрипционных факторов. Выявление таких известных промоторных элементов может быть использовано любым специалистом в рассматриваемой области техники для проектирования вариантов промотора, обладающего профилем экспрессии, аналогичным таковому исходного промотора.

Как используется в настоящем документе, термин «энхансер» или «энхансерный элемент» относится к cis-действующему транскрипционному регуляторному элементу (cis-элементу), который придает аспект общему характеру экспрессии, но самому по себе, как правило, недостаточному для управления транскрипцией функционально связанной полинуклеотидной последовательности. В отличие от промоторов, энхансерные элементы обычно не включают сайт начала транскрипции (TSS), или TATA-бокс, или эквивалентную последовательность. Промотор может природно содержать один или более энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанной полинуклеотидной последовательности. Выделенный энхансерный элемент может также быть слит с промотором для получения химерного промоторного cis-элемента, который придает аспект общей модуляции экспрессии генов. Промотор или фрагмент промотора может содержать один или более энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанных генов. Многие промоторные энхансерные элементы, как считается, связываются с ДНК-связывающими белками и/или влияют на топологию ДНК, производя локальные конформации, которые избирательно позволяют или ограничивают доступ РНК-полимеразы к ДНК-матрице или которые облегчают селективное раскрытие двойной спирали в сайт инициации транскрипции. Энхансерный элемент может действовать для связывания транскрипционных факторов, регулирующих транскрипцию. Некоторые энхансерные элементы связываются с более чем одним фактором транскрипции, и транскрипционные факторы могут взаимодействовать с различными аффинностями с более чем одним энхансерным доменом. Энхансерные элементы могут быть определены с помощью ряда способов, в том числе делеционного анализа, т.е. удаления одного или нескольких нуклеотидов с 5'-конца или от середины в направлении промотора; анализа ДНК-связывающих белков с использованием футпринтинга с ДНКазой I, интерференции участков метилирования, тестов на сдвиг электрофоретической подвижности, геномного футпринтинга in vivo путем лигированно-опосредованной ПЦР и других традиционных анализов; или путем анализа сходства последовательностей ДНК с использованием известных мотивов cis-элементов или энхансерных элементов в качестве последовательности-мишени или мотива мишени при помощи обычных способов сравнения последовательностей ДНК, таких как BLAST. Тонкую структуру энхансерного домена можно также изучать путем мутагенеза (или замещения) одного или нескольких нуклеотидов или другими традиционными способами. Энхансерные элементы могут быть получены путем химического синтеза или путем выделения из регуляторных элементов, которые включают в себя такие элементы, и они могут быть синтезированы с дополнительными фланкирующими нуклеотидами, которые содержат полезные сайты рестрикции для облегчения манипуляции с подпоследовательностями. Таким образом, проектирование, конструирование и применение энхансерных элементов в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе, для модуляции экспрессии функционально связанных транскрибируемых полинуклеотидных молекул охватываются настоящим изобретением.

В растениях включение некоторых интронов в генные конструкции приводит к увеличению накопления мРНК и белка по сравнению с конструкциями, не содержащими интрон. Этот эффект был назван «интрон-опосредованное увеличение» (IME) генной экспрессии (Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15: 913-920). Интроны, известные по стимулированию экспрессии у растений, были идентифицированы в генах кукурузы [например, tubA1, Adh1, Shi, Ubi1 (Jeon et al., Plant Physiol. 123: 1005-1014, 2000; Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200, 1987; Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575-1579, 1989; Christiansen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992)] и в генах риса (например, salt, tpi: McElroy et al, Plant Cell 2: 163-171, 1990; Xu et al., Plant Physiol. 106: 459-467, 1994). Аналогично, интроны из генов двудольных растений, таких как петуния (например, rbcS), картофель (например, st-ls1) и Arabidopsis thaliana (например, ubq3 и pat1), как было найдено, увеличивают уровни экспрессии генов (Dean et al., Plant Cell 1: 201-208, 1989; Leon et al., Plant Physiol. 95: 968-972, 1991; Norris et al., Plant Mol Biol 21: 895-906, 1993; Rose and Last, Plant J. 11: 455-464, 1997). Было показано, что делеции или мутации в участках сплайсинга интрона снижают генную экспрессию, указывая на то, что сплайсинг может быть необходим для IME (Mascarenhas et al., Plant Mol Biol. 15: 913-920, 1990; Clancy and Hannah, Plant Physiol. 130: 918-929, 2002). Однако такой сплайсинг не тр