Способы и составы лечения болезни хантингтона

Способы и составы лечения болезни хантингтона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/605028, зарегистрированной 29 февраля 2012 г., содержание которой в полном объеме включено в данный текст посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к области техники генной экспрессии и геномного редактирования.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Болезнь Хантингтона (БХ), также известная как хорея Хантингтона, является прогрессирующим нарушением двигательных, когнитивных функций в сочетании с психическими расстройствами. Средний возраст начала этой болезни составляет 35-44 года, хотя примерно в 10% случаев начало болезни приходится на возраст до 21 года, а средняя продолжительность жизни после диагностирования болезни составляет 15-18 лет. Частота встречаемости среди людей с западноевропейскими корнями составляет приблизительно от 3 до 7 случаев на 100000 человек.

[0004] Болезнь Хантингтона является примером нарушений, связанных с экспансией тринуклеотидных повторов, которые впервые были описаны в ранних 1990-х (см. Di Prospero and Fischbeck (2005) Nature Reviews Genetics 6:756-765). Эти нарушения включают локальную экспансию нестабильных повторов групп из трех нуклеотидов и могут привести к потере функции гена, в котором находится увеличенное количество повторов, развитию токсичной функции или к обоим этим последствиям. Тринуклеотидные повторы могут находиться в любой части гена, включая некодирующую и кодирующую области гена. Повторы, которые локализированы в пределах кодирующих областей, обычно включают повторяемый глутамин-кодирующий триплет (CAG) или аланин-кодирующий триплет (CGA). Наличие участков с увеличенным количеством повторов в пределах некодирующих последовательностей может привести к аберрантной экспрессии гена, в то время как увеличенное количество повторов в пределах кодирующих областей (также известное как нарушение повторов кодонов) может стать причиной неправильного сворачивания и агрегации белка. Зачастую настоящая причина патофизиологии, связанной с абберантными белками, остается невыясненной. Обычно в генах дикого типа, в которых может происходить экспансия тринуклеотидов, в нормальной популяции эти области содержат разное число повторяющихся последовательностей, но в пораженных популяциях число повторов может увеличиваться от удвоения до логарифмического возрастания числа повторов. При БХ эти повторы находятся в пределах N-терминальной области, кодирующей крупный цитозольный белок хантингтин (Htt). Нормальные аллели Htt содержат 15-20 повторов CAG, при этом аллели, содержащие 35 и более повторов, могут считаться аллелями, потенциально являющимися причиной БХ и несущими риск развития болезни. Аллели, содержащие 36-39 повторов, считаются частично пенетрантными, а у людей, имеющих такие аллели, болезнь может как развиться, так и не развиться (или симптомы могут появиться в более старшем возрасте), при этом аллели, содержащие 40 или более повторов, считаются полностью пенетрантными. Фактически, не сообщалось о пациентах с отсутствием симптомов среди тех, кто имеет аллели БХ с таким большим количеством повторов. У пациентов с ранним началом БХ (возрастом <21 года) часто обнаруживают 60 или более повторов CAG. Также было показано, что дополнительно к увеличению количества повторов CAG БХ может включать +1 или +2 сдвига рамки в пределах повторяющихся последовательностей, вследствие чего эта область будет кодировать полипептидный полисериновый тракт (кодируемый повторами AGC в случае +1 сдвига рамки) с большей вероятностью, чем полиглутаминовый (Davies and Rubinsztein (2006) Journal of Medical Genetics 43: 893-896).

[0005] При БХ мутантный аллель Htt обычно наследуется от одного из родителей как доминантный признак. Любой ребенок, рожденный от пациента с БХ, имеет 50% шанс развития болезни в случае, если второй из родителей не страдает этим нарушением. В некоторых случаях один из родителей может иметь промежуточный аллель БХ и не проявлять при этом симптомов заболевания, в то время как у ребенка из-за экспансии повторов болезнь проявляется. Вдобавок, аллель БХ также может характеризоваться явлением, известным как антиципация, при котором в нескольких поколениях наблюдается увеличение тяжести заболевания или снижение возраста начала заболевания, что связано с нестабильностью природы повторяемой области во время сперматогенеза.

[0006] Более того, тринуклеотидная экспансия в Htt приводит к потере нейронов среди проекционных шипиковых интернейронов стриатума, использующих в качестве нейротрансмиттеров гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), также потери нейронов наблюдаются в новой коре головного мозга. Шипиковые интернейроны, которые содержат энкефалин и которые проецируются на наружный сегмент бледного шара, затрагиваются чаще, чем нейроны, которые содержат субстанцию Р и проецируются на внутренний сегмент бледного шара. Другие участки мозга, которые сильно поражаются у людей с болезнью Хантингтона, включают черную субстанцию, 3, 5 и 6 слои коры головного мозга, участок СА1 гиппокампа, угловую извилину в теменной доле, клетки Пуркинье в мозжечке, боковые туберальные ядра гипоталамуса и парафасцикулярный комплекс таламуса (Walker (2007) Lancet 369:218-228).

[0007] Роль нормального белка Htt изучена плохо, но он может участвовать в нейрогенезе, апоптотической гибели клеток и миграции везикул. Вдобавок, есть свидетельства того, что Htt дикого типа стимулирует выработку нейротрофического фактора головного мозга (НФГМ) - фактора, поддерживающего развитие стриарных нейронов. Было показано, что в мышиных моделях БХ прогрессирование БХ сопровождается снижением экспрессии НФГМ (Zuccato et al (2005) Pharmacological Research 52(2): 133-139), и что доставка НФГМ или нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (НФГК) посредством адено-ассоциированной вирусной (ААВ) вектор-опосредованной доставки генов может защитить стриарные нейроны в мышиных моделях БХ (Kells et al, (2004) Molecular Therapy 9(5): 682-688).

[0008] Возможности лечения БХ на сегодняшний день очень ограничены. Некоторые потенциальные методики, разработанные для предотвращения токсических эффектов, связанных с агрегацией белка, которая возникает при удлиненном полиглутаминовом тракте, таких как повышенная экспрессия шаперонинов или индукция ответа на тепловой шок выработкой соединения гелданамицина, продемонстрировали снижение этих токсических эффектов в in vitro моделях. Другие способы лечения нацелены на роль апоптоза в клинических проявлениях болезни. Например, замедление развития симптомов болезни в животных моделях было достигнуто путем блокирования каспазной активности у потомков пары мышей, где один из родителей имел аллель БХ, а второй из родителей имел доминантный негативный аллель для каспазы 1. Вдобавок, в патогенности болезни может играть роль расщепление мутантного БХ Htt каспазой. Было обнаружено, что у трансгенных мышей, несущих устойчивый к каспазе-6 мутантный Htt, сохраняется нормальное функционирование нейронов и не развивается стриарная нейродегенерация по сравнению с мышами, несущими неустойчивый к каспазе мутантный аллель Htt (см. Graham et al (2006) Cell 125: 1179-1191). Также было показано, что молекулы, нацеленные на участников каскада апоптотических реакций, оказывают замедляющее воздействие на симптомологию. Например, было показано, что соединения zVAD-fmk и миноциклин, которые ингибируют каспазную активность, замедляют проявление болезни у мышей. Также в клинических испытаниях на людях с нетяжелыми случаями БХ применяли лекарственный препарат ремацемид, так как считалось, что это соединение предотвращает связывание мутантного Htt с рецептором NDMA и, соответственно, предотвращает воздействие токсических эффектов на нервные клетки. Однако в этих исследованиях не наблюдали статистически значимого улучшения в функционировании нейронов. Вдобавок исследовательская группа по болезни Хантингтона (Huntington Study Group) провела рандомизированное исследование двойным слепым методом с применением кофермента Q. Хотя среди пациентов, которых лечили при помощи кофермента Q10, наблюдали тенденцию к замедлению прогрессирования болезни, никаких заметных изменений в скорости снижения общей функциональной способности не произошло. (Di Prospero and Fischbeck, там же). В патентной публикации США 2011/0082093 описываются специфические белки “цинковые пальцы”, нацеленные на Htt.

[0009] Следовательно, сохраняется потребность в составах и способах для лечения и предотвращения болезни Хантингтона.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] В данном тексте раскрыты способы и составы для лечения болезни Хантингтона. В частности, в данном тексте предложены способы и составы для модифицирования (например, модуляции экспрессии какого-либо компонента) аллеля БХ Htt таким образом, чтобы лечить болезнь Хантингтона. Также предложены способы и составы для создания животных моделей болезни Хантингтона.

[0011] Соответственно, в одном аспекте реализации изобретения предложены сконструированные ДНК-связывающие домены (например, белки цинковые пальцы или белки TAL-эффекторы (TALE)), которые модулируют экспрессию БХ аллеля (например, Htt). Сконструированные белки цинковые пальцы или TALE являются белками цинковые пальцы или TALE неприродного происхождения, чьи ДНК-связывающие домены (например, спирали узнавания или RVD (от англ. - “repeat variable diresidue”)) были изменены (например, путем селекции и/или рационального проектирования) для того, чтобы связываться с предварительно выбранным целевым участком. Любые описанные в данном тексте белки цинковые пальцы могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более цинковых пальцев, при этом каждый из цинковых пальцев содержит спираль узнавания, которая связывается с целевым субсайтом в выбранной последовательности(ях) (например, гене(ах)). Аналогично, любой из описанных в данном тексте белков TALE может содержать любое количество TALE RVD. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один RVD характеризуется неспецифическим связыванием ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одна спираль узнавания (или RVD) имеет неприродное происхождение. В некоторых вариантах реализации изобретения белки цинковые пальцы содержат спирали узнавания, приведенные в таблицах 1А и 1Б. В других вариантах реализации изобретения белки цинковые пальцы связываются с целевыми последовательностями, приведенными в таблицах 2А и 2Б. В некоторых вариантах реализации изобретения белки цинковые пальцы содержат спирали узнавания, приведенные в таблице 2В. В определенных вариантах реализации изобретения белки цинковые пальцы входят в фармацевтический состав, предназначенный, например, для введения пациенту.

[0012] В одном аспекте реализации изобретения предложены репрессоры (ZFP-TF или TALE-TF - транскрипционные факторы на основе цинковых пальцев и TALE (от англ. “zinc finger protein transcription factors” и “transcription activator-like effector transcription factors”)), которые связываются с последовательностями, полностью или частично находящимися снаружи повторяющегося CAG-участка Htt. В другом аспекте реализации изобретения предложены репрессоры ZFP или TALE (ZFP-TF или TALE-TF), которые связываются с последовательностями, находящимися в пределах повторяющегося CAG-участка Htt. В некоторых вариантах реализации изобретения эти ZFP-TF или TALE-TF преимущественно связываются с тринуклеотидными трактами, удлиненными относительно длины повторяемых трактов дикого типа, чем достигается преимущественная репрессия удлиненных аллелей. В некоторых вариантах реализации изобретения эти ZFP-TF или TALE-TF содержат домены белкового взаимодействия (или “димеризационные домены”), которые обеспечивают возможность мультимеризации при связывании с ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения эти ZFP-TF или TALE-TF достигают кооперативного связывания ДНК с повторяющейся последовательностью таким образом, что удлиненный аллель более эффективно связывается большим количеством белков ZFP или TALE, чем аллель дикого типа, что дает возможность осуществлять преимущественную репрессию мутантного аллеля. Эти ZFP-TF или TALE-TF кооперативного связывания могут дополнительно содержать или не содержать домены белкового взаимодействия, которые создают возможность мультимеризации при связывании с ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения ZFP-TF или TALE-TF образуют устойчивый комплекс мультимеров заданного размера и, таким образом, способны к преимущественному взаимодействию с трактом CAG, длина которого превышает определенный минимальный размер, при этом минимальный размер является большим, чем длина тракта CAG дикого типа.

[0013] В определенных вариантах реализации изобретения ZFP или белки TALE, описанные в данном тексте (например, двурукие, мультимеризующиеся и т.д.), преимущественно модифицируют экспрессию мутантного аллеля Htt. В некоторых вариантах реализации изобретения ZFP или TALE специфически связывается с мутантными аллелями Htt, при этом удлиненный тракт кодирует полиглутамин, в то время как в других вариантах реализации изобретения ZFP или TALE специфически связывается с мутантным аллелем Htt, но при этом удлиненный тракт кодирует полисерин. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения ZFP-TF или TALE-TF модулирует как дикую, так и мутантную формы аллеля Htt. В определенных вариантах реализации изобретения ZFP или TALE модулирует только аллель Htt дикого типа. В других вариантах реализации изобретения ZFP или TALE модулирует только мутантную форму Htt.

[0014] В других вариантах реализации изобретения предложены репрессирующие ZFP-TF или TALE-TF, которые преимущественно связываются с известными ОНП, связанными с удлиненными аллелями БХ Htt. В этом случае ZFP-TF или TALE-TF являются специфичными для мутантных аллелей Htt, которые содержат ОНП, что дает возможность осуществлять специфическую репрессию мутантного аллеля Htt. В другом аспекте реализации изобретения предложены ZFP-TF или TALE-TF, которые специфически активируют аллель Htt дикого типа посредством взаимодействия с ОНП, связанными с аллелями дикого типа. В этом случае активируется только аллель Htt дикого типа.

[0015] В определенных вариантах реализации изобретения белки цинковые пальцы (ZFP) или белки TALE, описанные в данном тексте, можно размещать в функциональной связи с регуляторным доменом (или функциональным доменом) как часть слитого белка. Функциональным доменом может быть, например, домен активации транскрипции, домен репрессии транскрипции и/или нуклеазный (расщепляющий) домен. Выбрав активационный домен либо репрессионный домен для сшивания с ZFP или TALE, такие слитые белки можно использовать как для активации, так и для подавления генной экспрессии. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен слитый белок, содержащий ZFP или TALE, нацеленный на мутантный Htt, как описано в данном тексте, сшитый с доменом репрессии транскрипции, который можно применять для снижения экспрессии мутантного Htt. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен слитый белок, содержащий ZFP или TALE, нацеленный на аллель Htt дикого типа, сшитый с доменом активации транскрипции, который может осуществлять повышающую регуляцию аллеля Htt дикого типа. В определенных вариантах реализации изобретения активность регуляторных доменов регулируется экзогенным низкомолекулярным компонентом или лигандом, таким образом, что взаимодействие с клеточным транскрипционным комплексом не будет происходить в отсутствие экзогенного лиганда. Такие внешние лиганды контролируют степень взаимодействия ZFP-TF или TALE-TF с транскрипционным комплексом. Регуляторный домен(ы) может быть функционально связан с любой частью(ями) одного или более ZFP или TALE, включая часть между одним или более ZFP или TALE, снаружи одного или более ZFP или TALE и любые комбинации этих вариантов. Любые описанные в данном тексте слитые белки могут являться частью фармацевтического состава.

[0016] В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном тексте сконструированные ДНК-связывающие домены можно размещать в функциональной связи с нуклеазными (расщепляющими) доменами как часть слитого белка. В других вариантах реализации изобретения нуклеазные системы, такие как система CRISPR/Cas, можно использовать вместе со специфической одиночной “руководящей” РНК для нацеливания нуклеазы на целевой участок в ДНК. В определенных вариантах реализации изобретения такие нуклеазы и нуклеазные продукты слияния можно использовать для нацеливания на мутантные аллели Htt в стволовых клетках, таких как индуцированные полипотентные стволовые клетки (иПСК), человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК), мезенхимальные стволовые клетки (МСК) или нейрональные стволовые клетки, при этом активность нуклеазного продукта слияния приведет к появлению аллеля Htt, содержащего “дикое” количество повторов CAG. В определенных вариантах реализации изобретения предложены фармацевтические составы, содержащие модифицированные стволовые клетки.

[0017] В другом аспекте реализации изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий любой из описанных в данном тексте ДНК-связывающих белков. В другом аспекте реализации изобретения предложены полинуклеотиды, кодирующие нуклеазу CRIPSR/Cas и одиночную “руководящую” РНК. Такие полинуклеотиды можно вводить пациенту, у которого необходимо лечить болезнь Хантингтона.

[0018] В дополнительных аспектах реализации в изобретении предложены способы и составы для создания специфических модельных систем для изучения болезни Хантингтона. В определенных вариантах реализации изобретения предложены модели, в которых создаются мутантные аллели Htt путем использования эмбриональных стволовых клеток для создания клеточных и животных линий, в которых удлиненные тринуклеотидные тракты определенной длины (50, 80, 109 и 180 повторов CAG, например) вставлены в аллель Htt дикого типа при помощи целевого внедрения, осуществляемого цинк-пальцевыми нуклеазами (ZFN), нуклеазами TALE (TALEN) или нуклеазами CRISPR/Cas. В определенных вариантах реализации изобретения модельные системы включают in vitro клеточные линии, в то время как в других вариантах реализации изобретения модельные системы включают трансгенных животных. В любой из описанных в данном тексте животных моделей животное может быть, например, грызуном (например, крысой, мышью), приматом (например, любым приматом за исключением человека) или кроликом.

[0019] В другом аспекте реализации изобретения предложен вектор доставки генов, содержащий любой из описанных в данном тексте полинуклеотидов. В определенных вариантах реализации изобретения вектор является аденовирусным вектором (например, вектором Ad5/F35), лентивирусным вектором (ЛВ), включая интеграционно-компетентные или интеграционно-дефектные лентивирусные векторы, либо аденоассоциированным вирусным вектором (ААВ). Таким образом, в данном тексте также предложены аденовирусные (Ад) векторы, ЛВ или аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ), содержащие последовательность, кодирующую по меньшей мере одну нуклеазу (ZFN или TALEN) и/или донорную последовательность для целевой интеграции в ген-мишень. В определенных вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор является химерным аденовирусным вектором, например, вектором Ad5/F35. В определенных вариантах реализации изобретения лентивирусный вектор является интегразо-дефектным лентивирусным вектором (ИДЛВ) или интеграционно-компетентным лентивирусным вектором. В определенных вариантах реализации изобретения вектор является псевдотипированным с VSV-G оболочкой или с другими оболочками.

[0020] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены модельные системы болезни Хантингтона, в которых целевые аллели (например, мутантного Htt) помечены экспрессионными маркерами. В определенных вариантах реализации изобретения мутантные аллели (например, мутантного Htt) помечены. В некоторых вариантах реализации изобретения помечен аллель дикого типа (например, Htt дикого типа), а в дополнительных вариантах реализации изобретения отдельными экспрессионными маркерами помечены аллели как дикого типа, так и мутантные. В определенных вариантах реализации изобретения модельные системы включают in vitro клеточные линии, в то время как в других вариантах реализации изобретения модельные системы включают трансгенных животных.

[0021] Дополнительно предложены фармацевтические составы, содержащие нуклеиновые кислоты и/или белки (например, ZFP или TALE либо слитые белки, содержащие ZFP или TALE). Например, определенные составы содержат нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, которая кодирует один из описанных в данном тексте ZFP или TALE, функционально связанную с регуляторной последовательностью, соединенную с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, при этом регуляторная последовательность обеспечивает возможность экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. В определенных вариантах реализации изобретения кодируемые ZFP или TALE являются специфическими аллелю БХ Htt. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические составы содержат ZFP или TALE, которые модулируют аллель БХ Htt, и ZFP или TALE, которые модулируют нейротрофический фактор. Составы на белковой основе содержат один или более из описанных в данном тексте ZFP или TALE и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[0022] В другом аспекте реализации изобретения предложена также выделенная клетка, содержащая любой из белков, полинуклеотидов и/или составов, которые описаны в данном тексте.

[0023] В другом аспекте реализации изобретения предложены способы лечения и/или предотвращения болезни Хантингтона при помощи описанных в данном тексте способов и составов. В некоторых вариантах реализации изобретения способы включают применение составов, в которых доставка полинуклеотидов и/или белков может быть осуществлена при помощи вирусного вектора, невирусного вектора (например, плазмиды) и/или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения способы включают применение составов, содержащих популяции стволовых клеток, содержащих ZFP или TALE либо измененных при помощи нуклеазных систем ZFN, TALEN или CRISPR/Cas, которые являются объектами данного изобретения.

[0024] В целом эти и другие аспекты реализации станут понятны специалисту в данной области техники в свете раскрытия сущности настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0025] На фигуре 1, панелях от А до Д, приведены схематические изображения аллеля хантингтина (Htt) дикого типа и мутантного (болезни Хантингтона, БХ), а также разных типов связывание ZFP-TF с этим аллелем. На фигуре 1А показаны конструкции ZFP, которые связываются с внешней стороны CAG-повтора и, следовательно, предполагается, что они связываются как с аллелем дикого типа, так и с мутантным (БХ) аллелем. “KRAB” обозначает репрессионный домен KRAB из гена KOX1, а “ZFP” обозначает ДНК-связывающий белок «цинковые пальцы». “Стандартный ZFP TF” является слитым белком транскрипционного фактора ZFP, в котором ДНК-связывающие домены цинковых пальцев связаны с репрессионным доменом KRAB. На фигуре 1Б показаны ZFP-TF, сконструированные так, чтобы связываться в пределах участка CAG. На фигуре 1В показан “двурукий ZFP TF”, который представляет собой транскрипционный фактор ZFP, в котором два кластера из доменов цинковых пальцев разделены жесткими белковыми последовательностями. На этой фигуре функциональный (репрессионный) домен изображен снаружи одного из ZFP, но стоит понимать, что функциональный домен может находиться между двумя ZFP или снаружи ZFP, находящегося на другом конце белка. На фигуре 1Г показан “мультимеризующийся ZFP TF”, который представляет собой ZFP TF, способный к мультимеризации посредством мультимеризационного домена (изображен в виде пятнистых прямоугольников). На фигуре 1Д показана конфигурация ZFP-ZFP-KRAB, в которой два ДНК-связывающих домена цинковых пальцев связаны гибким линкером и дополнительно сшиты с доменом KRAB. Специалисту в данной области техники понятно, что во всех слитых белках функциональный домен может находиться на любом конце ДНК-связывающего домена, и что ДНК-связывающий домен может содержать большой количественный диапазон цинковых пальцев. Функциональный домен (например, активационный, репрессионный домен или расщепляющий домен) изображен на фигуре 1 в виде прямоугольника с черными ромбами. Специалисту в данной области техники понятно, что приведенные на фигурах примеры моделей применимы также к TALE TF.

[0026] Фигура 2, панели от А до Д, иллюстрирует репрессию обоих аллелей Htt, осуществляемую ZFP, как описывается фигурой 1А, при помощи ZFP TF, которые не связываются с повторяющимися последовательностями CAG. Идентификационные номера ZFP приведены в таблицах 1А и 1Б и указаны под столбиками. Фигура 2А иллюстрирует репрессию человеческих аллелей Htt в клетках HEK293 при помощи ZFP, нацеленных на пять участков в гене человека. Приведена диаграмма для человеческого гена Htt, а также показаны расположения ZFP-связывающих участков. Для каждой группы ZFP каждый из столбиков представляет независимую трансфекцию. Фигура 2Б иллюстрирует вестерн-блоттинг, показывающий уровни белка Htt в клетках HEK293, трансфицированных контрольным ЗФБ или репрессором 18856 ZFP TF (содержащим репрессионный домен KRAB KOX1), при этом для подтверждения равноценной загрузки белка использовали уровни NFκB p65 (“p65”). Результаты вестерн-блоттинга подтверждают наличие подавления экспрессии Htt, осуществляемой ZFP-TF. На фигуре 2В приведены данные, аналогичные приведенным на фигуре 2А, для ZFP, специфичного к мышиному Htt, в клетках Neuro2A. Как и на фигуре 2А, приведена диаграмма для мышиного гена Htt, а также показаны расположения ZFP-связывающих участков. Фигуры 2Г и 2Д иллюстрируют подавление экспрессии мышиного гена Htt (РНК) в иммортализованных стриарных клетках, в случаях применения разных дозировок ZFP-TF мРНК для трансфекции. Во всех случаях за исключением фигуры 2Б уровни мРНК для Htt измерены при помощи ПЦР в режиме реального времени и нормированы относительно уровней мРНК для актина.

[0027] Фигура 3, панели от А до Ж, иллюстрирует избирательную репрессию мутантного Htt, осуществляемую путем применения связывания ZFP в пределах повторяемого участка CAG, как показано на фигуре 1Б. Эта модель иллюстрирует, что более длинный повторяемый участок CAG в мутантном аллеле делает возможным повышенное связывание нацеленных на CAG репрессорных молекул ZFP. Фигура 3А иллюстрирует воздействие нацеленных на CAG ZFP, имеющих разную репрессорную активность, на эндогенный ген Htt (с нормальной длиной CAG-повторов) в клетках HEK293. Фигура 3Б иллюстрирует репрессию репортеров люциферазы, управляемую фрагментами промотора/экзона1 Htt, содержащими повторы CAG разной длины в диапазоне от 10 до 47 повторов CAG. CAG10 (крайний левый столбик для каждого из двух указанных условий) представляет результаты для 10 CAG-повторов; CAG17 (второй столбик слева для каждого из двух указанных условий) представляет результаты для 17 CAG-повторов; CAG23 (второй столбик справа для каждого из двух указанных условий) представляет результаты для 23 CAG-повторов и CAG47 (крайний правый столбик для каждого из двух указанных условий) представляет результаты для 47 CAG-повторов. На схеме, расположенной над графиком, приведена конструкция промотора, экзона1, CAG-повторов Htt и репортерного гена люциферазы, которые применяются в данной системе. Данные показывают, что увеличение количества повторов CAG приводит к сниженной экспрессии от промотора Htt под действием нацеленного на CAG ZFP. Кроме того, фигура 3В показывает, что хотя относительно слабый нацеленный на CAG ZFP не репрессирует репортер люциферазы, который содержит участок CAG-повторов нормальной длины, равно как и сильный репрессор CAG, он осуществляет такую же репрессию репортера люциферазы, который содержит удлиненный участок CAG-повторов, как и сильный нацеленный на CAG ZFP, что справедливо при всех тестируемых дозировках. “pRL-Htt-CAG23-интрон 1” (левый столбик в каждой паре) соответствует экспрессии аллеля дикого типа, в то время как “pRL-HttCAG47-интрон 1” (правый столбик в каждой паре) соответствует экспрессии мутантного удлиненного аллеля Htt (содержащего 47 повторов CAG). На фигуре 3Г приведен график, иллюстрирующий репрессию мутантного Htt (111 CAG), осуществляемую нацеленными на CAG ZFP в иммортализованных стриарных клетках, полученных от мышей с генным нокином HdH(Q111/Q7). Экспрессию дикого типа отображает левый столбик из каждой пары, а нокин-экспрессию - правый столбик из каждой пары. ZFP-TF, содержащие определенный ZFP, сшитый с репрессионным доменом KRAB, исследовали, используя для трансфекций три разных концентрации ZFP мРНК. Фигура 3Д иллюстрирует репрессию мутантного Htt, осуществляемую нацеленными на CAG ZFP, в линии фибробластов (CAG15/70), полученной от пациента с БХ. В данной линии фибробластов аллель Htt дикого типа содержит 15 повторов CAG (“099T(CAG15)”, средний столбик для каждого из указанных условий), а мутантный удлиненный аллель Htt содержит 70 повторов CAG (“099C(CAG70)”, правый столбик для каждого из указанных условий). Фигура 3F иллюстрирует избирательное подавление экспрессии мутантного Htt в фибробластных клеточных линиях, полученных от 4 разных пациентов с БХ. Числа над каждой из групп обозначают количество повторов CAG в аллеле Htt дикого типа (например, 15 или 18) и в мутантном аллеле (например, 70, 67, 45 и 44); а исследования проводили для двух разных дозировок ZFP мРНК. Левый столбик в каждой из пар отображает экспрессию Htt дикого типа, а правый столбик отображает экспрессию мутантного Htt. Фигура 3Ж иллюстрирует оцененную при помощи вестерн-блоттинга экспрессию Htt в фибробластах, полученных от пациента с БХ, в присутствии ZFP-TF 30640, 32528 и 30657. Более медленные миграционные полосы белка соответствуют тем, которые получены от удлиненных мутантных аллелей Htt. 32528 связывается с сайтом инициации транскрипции Htt (СИТ) и таким образом подавляет экспрессию обоих аллелей, в то время как 30640 и 30657 связываются с CAG-повторами (CAG).

[0028] Фигура 4, панели А и Б, иллюстрирует репрессию мутантного Htt в линии фибробластов, полученной от пациента с БХ, осуществляемую ZFP, нацеленными на CAG-повторы. Применяемый диапазон концентраций РНК составил от 0,1 до 3 мкг. На фигурах 4А и 4Б левый столбик для каждого из указанных условий отображает общую экспрессию Htt, средний столбик отображает экспрессию Htt в фибробластах, в которых аллель Htt содержит 18 повторов CAG (“099T(CAG18)”, а мутантный удлиненный аллель Htt содержит 45 повторов CAG 099T (CAG45).

[0029] Фигура 5 иллюстрирует воздействие нацеленных на CAG ZFP репрессоров на экспрессию Htt и других CAG-содержащих генов в фибробластах, полученных от пациента с БХ. Левый столбик под каждым из указанных условий отображает результаты для 30640; средний столбик под каждым из указанных условий отображает результаты для 30675 и правый столбик отображает ложные трансфекции.

[0030] Фигура 6, панели А и Б, иллюстрирует эксперимент, в котором исследовали общегеномную специфичность трех нацеленных на CAG ZFP. На фигуре 6А приведены результаты количественного ПЦР-анализа репрессии Htt, проведенного для шести биологических образцов (шести отдельных трансфекций) БХ фибробластов (CAG18 (средние столбики)/CAG45, правые столбики) с применением 30640, 30645 или 33074. Четыре наиболее схожих согласно данным количественного ПЦР-анализа образца были отобраны для микроматричного анализа, а данные представлены на фигуре 6Б.

[0031] Фигура 7 иллюстрирует репрессию Htt в нейрональных стволовых клетках (НСК) CAG17/69. Клетки трансфицировали ZFP мРНК в указанных дозировках. Левые столбики под каждой из указанных дозировок отображают результаты для клеток CAG17, средние столбики отображают результаты для клеток дикого типа, правые столбики отображают результаты для клеток CAG69.

[0032] Фигура 8 иллюстрирует экспрессию Htt в нейронах, дифференцировавших из БХ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (CAG 17/48), обработанных ZFP TF. Клетки трансфицировали ZFP мРНК в указанных дозировках.

[0033] Фигура 9 иллюстрирует подавление экспрессии мутантного трансгена Htt в R6/2 мышах с последующей обработкой ZFP TF 30640.

[0034] На Фигуре 10, панели от А до Г, показаны ZFP с мультимеризационными доменами, которые специфически нацелены на удлиненные повторы CAG, как показано на фигуре 1Г. На фигуре 10А показан одиночный ZFP, который содержит четыре компонента: (i) репрессорный домен KOX (овал, подписанный как “репрессор”); (ii) группу из 2-6 пальцев (показано два, маленькие овалы, помеченные как “Z”), которая связывается с (CAG)_N или пермутацией этой последовательности, и (iii) два димеризационных домена (прямоугольники, подписанные как “д1” и “д2”), которые взаимодействуют в антипараллельной конфигурации. Эти домены обеспечивают возможность полимеризации ZFP в пределах большой бороздки CAG-тракта. На фигуре 10Б приведено схематическое изображение связывания с мультимером из 3 ZFP. Следует понимать, что можно использовать любое количество мультимеров, и что функциональный домен может размещаться в любом месте на одном или более из отдельных ZFP, и что данные диаграммы применимы также к TALE-TF. На фигуре 10В приведены белковые последовательности четырех мономерных каркасов ZFP, которые сконструированы так, чтобы мультимеризоваться через взаимодействия между димеризующимися цинковыми пальцами (DZ). Каркасы имеют названия DZ1 (SEQ ID NO:180), DZ2 (SEQ ID NO:181), DZ3 (SEQ ID NO:182) и DZ4 (SEQ ID NO:183). Димеризующиеся домены цинковых пальцев выделены подчеркиванием, а репрессионный домен и последовательность ядерной локализации выделены, соответственно, жирным подчеркнутым и курсивным текстом. На фигуре 10Г приведены белковые последовательности семи мономерных каркасов ZFP, которые сконструированы так, чтобы мультимеризоваться через взаимодействия между суперспиралями (СС). Каркасы имеют названия CC1 (SEQ ID NO:184), CC2 (SEQ ID NO:185), CC3 (SEQ ID NO:186), CC4 (SEQ ID NO:187), CC5 (SEQ ID NO:188), CC6 (SEQ ID NO:189) и CC7 (SEQ ID NO:190). Последовательности суперспиралей выделены подчеркиванием, а репрессионный домен и последовательность ядерной локализации выделены, соответственно, жирным подчеркнутым и курсивным текстом. Расположение участка ZFP каждого из каркасов, которое будет отличным в разных конструкциях, обозначено как “[ZFP]”. Расположение (ДНК-связывающего) участка ZFP каждого из каркасов, которое будет отличным в разных конструкциях, обозначено как “[ZFP]”.

[0035] Фигура 11, панели А и Б, иллюстрирует активность ZFP-TF с димеризационными доменами. На фигуре 11А ZFP-TF с “суперспиральными” (СС) доменами исследовали вместе с репортерами люциферазы. pRL-Htt CAG17 (левый столбик в каждой паре) представляет репортер люциферазы Renilla, управляемый фрагментом человеческого промотора/экзона1 Htt с 17 CAG; pGL3-Htt-CAG47 (правый столбик в каждой паре) представляет репортер люциферазы светляков, управляемый фрагментом человеческого промотора/экзона1 Htt с 47 повторами CAG. См. текст примера 10, в котором описаны разные димеризационные домены. На фигуре 11Б ZFP с димеризующимися доменами цинковых пальцев “DZ” исследовали вместе с такими же репортерами люциферазы и наблюдали повышенную репрессию некоторыми димеризационными доменами ZFP-TF. Левый столбик в каждом дублете отображает экспрессию аллеля Htt с 17 CAG-повторами, а правый столбик отображает экспрессию аллеля Htt с 47 CAG-повторами.

[0036] Фигура 12, панели А и Б, иллюстрирует репрессию Htt белками ZFP-ZFP-KOX. Фигура 12А иллюстрирует репрессию Htt одиночными 33088 и 33084 ZFP-TF и репрессию белками 33088-33088 и 33088-33084 ZFP-ZFP-KOX в БХ фибробластах дикого типа (левый столбик), CAG18 (средний столбик) и CAG45 (правый столбик) (фигура 12А); фигура 12Б иллюстрирует репрессию Htt 33088-33088 и 33088-33084 ZFP-ZFP-KOX в БХ фибробластах дикого типа (левый столбик), CAG20 (средний столбик) и CAG41 (правый столбик).

[0037] Фигура 13, панели от А до Д, иллюстрирует активацию мышиного Htt. На фигуре 13А показана ZFP-TF-стимулированная повышающая регуляция генов мышиного Htt на уровне РНК в клетках Neuro2A при применении ZFP, сшитого с активационным доменом р65. Двойные столбики обозначают дублирующие трансфекции. На фигуре 13Б приведены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие повышенную выработку белка Htt, стимулированную ZFP. На фигуре 13В показан мышиный аллель Htt дикого типа и “нокин” аллель Htt, в котором мышиная последовательность (большая часть экзона 1 и часть интрона 1, линия над схематическим изображением аллеля дикого типа) была заменена соответствующей человеческой последовательностью с экспансией CAG (линия над схематическим изображением нокин-аллеля). На фигуре 13Г приведено выравнивание между мышиной последовательностью (SEQ ID NO:191), которая была заменена соответствующей человеческой последовательностью (SEQ ID NO:192), таким образом, что нокин-аллель обладает достаточным расхо