Липосомы, содержащие олигопептидные фрагменты основного белка миелина, фармацевтический состав и способ лечения рассеянного склероза

Липосомы, содержащие олигопептидные фрагменты основного белка миелина, фармацевтический состав и способ лечения рассеянного склероза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 13/444788, поданной 11 апреля 2012 года, под названием "ЛИПОСОМЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ОЛИГОПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА", содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки для всевозможных целей.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рассеянный склероз (РС) - нейродегенеративное заболевание, при котором повреждаются жировые миелиновые оболочки вокруг аксонов головного мозга и спинного мозга, что приводит к демиелинизации и образованию рубцов. Повреждение, причиненное центральной нервной системе (ЦНС), приводит к неврологическим симптомам широкого спектра. Во всем мире приблизительно один миллион людей страдают от данного аутоиммунного заболевания, имеющего загадочную этиологию и мало изученный патогенез. B- и Т-клетки, химически активные в отношении составляющих миелиновой оболочки, опосредуют демиелинизацию в головном и спинном мозге и, как представляется, отвечают за большую часть прогрессирования заболевания.

Перечень потенциальных аутоантигенов, для которых B- и Т-клетки являются химически активными в отношении пациентов с РС, постепенно растет и включает в себя несколько олигодендроцитарно-ассоциированных белков, в частности, основной белок миелина (ОБМ) и миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ). Инфильтрация центральной нервной системы этими макрофагами и лимфоцитами посредством гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) приводит к образованию воспалительных очагов демиелинизации в головном и спинном мозге.

В то время как Т-клетки несут ответственность за большую часть эффекта демиелинизации, хотя и В-клетки играют в этом существенную роль. Это связано с тем, что В-клетки функционируют в качестве антиген-представляющих клеток и цитокинов продуцирующих клеток, в дополнение к их всеми признанной роли в образовании антител (Хикада и Зуали, журнал "Природа иммунологии" (Hikada and Zouali, Nat Immunol) 2010; 11:1065-8). Дополнительным подтверждением причастности В-клеток к демиелинизации является обнаружение каталитических антител к ОБМ у пациентов с рассеянным склерозом. Эти каталитические антитела способны не только связывать их антиген, но также расщеплять его (Пономаренко Н.А. и др., Труды Национальной академии наук, США 2006; 103:281-6). Факты показывают, что существует сильная экологическая составляющая для прогрессирования РС, в котором аутоантитела, обладающие перекрестной реактивностью к нейронным и вирусным антигенам, способствуют этиологии и патогенезу РС (Габибоа А.Г. и др., журн. Федерация американских обществ экспериментальной биологии 2011; 25:4211-21).

Было предложено множество методов лечения РС, в том числе: (i) введение глатиромерацетата (GA); (ii) введение "измененных пептидных лигандов" (APL), которые взаимодействуют с рецепторами Т-клеток (TCR); (iii) введение IFNβ; (iv) введение анти-CD20, анти-CD25 и анти-CD52 моноклональных антител; (v) различные пероральные терапии; (vi) вакцинация инактивированных Т-клеток или гипервариабельных участков TCR; (vii) толеризация иммунной системы путем введения аутоантигенов или DNA-вакцинация; и (viii) нацеленная деплеция B-клеток.

Однако, несмотря на многообещающие клинические, иммунологические и биохимические данные, ни один из существующих методов лечения не способен вылечить или предотвратить прогрессирование РС. Таким образом, в данной области существует большая потребность в эффективных терапевтических подходах к лечению РС.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение удовлетворяет потребность в области медицины по эффективным составам и способам лечения рассеянного склероза (РС), путем предоставления терапевтической композиции иммунодоминантных пептидов ОБМ, связанных с вектором для введения нуждающемуся в этом субъекту. В конкретном воплощении композиция включает в себя иммунодоминантные пептиды ОБМ, инкапсулированные в маннозилированные липосомы. Как видно из данного документа, введение этих композиций улучшает непрерывный экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в ЭАЭ-индуцированной модели крыс с РС.

Настоящее изобретение основано, отчасти, на обнаружении того факта, что определенные пептиды ОБМ являются основными эпитопами В-клеток у пациентов, страдающих рассеянным склерозом. Было обнаружено, что введение липосомальных рецептур этих пептидов, а не свободных пептидов, моделям грызунов с РС привело к статистически значимому снижению паралича. Не вдаваясь в теорию, мы можем смело заявить, что липосомная рецептура данных пептидов приводит к улучшению доставки пептидов в иммунные клетки (например, В-клетки и/или антигенпрезентирующие клетки) и/или улучшает потребление этих пептидов в иммунных клетках (например, В-клетки и/или антигенпрезентирующие клетки).

Таким образом, настоящее изобретение, кроме всего прочего, предоставляет нам композиции (составы) и способы лечения рассеянного склероза. Композиции содержат один или несколько идентифицированных пептидов ОБМ, связанных с вектором (например, a маннозилированные липосомы).

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает композицию для лечения рассеянного склероза. Данная композиция содержит в себе первый пептид основного белка миелина (ОБМ), связанный с первым вектором; первый пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R¹)_a-P₁-(R²)_b, где P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R₁ и R₂, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная a и b, независимо друг от друга, равна нулю или единице.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, а и b оба равны нулю. В другом из воплощений составов, приведенных выше, а равно единице, а b равно нулю. В другом из воплощений составов, приведенных выше, а равно нулю, а b равно единице. В другом из воплощений составов, приведенных выше, а и b оба равны единице.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере 90%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере 95%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - это аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере 90%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 95%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - это аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере 90%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере 95%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом из воплощений составов, приведенных выше, Р₁ - это аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, состав дополнительно содержит второй пептид ОБМ, связанный со вторым вектором, второй пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R³)_c-P₂-(R⁴)_d, где P₂ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R³ и R⁴, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная c и d, независимо друг от друга, равна нулю или единице, и где P₁ и P₂ представляют собой различные аминокислотные последовательности.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, первый и второй векторы являются одним вектором.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, состав дополнительно содержит третий пептид ОБМ, связанный с третьим вектором, третий пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f, где P₃ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R⁵ и R⁶, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная e и f, независимо друг от друга, равна нулю или единице, и где P₁, P₂, и P₃ - различные аминокислотные последовательности.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, первый, второй и третий векторы являются одним вектором.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1; P₂ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2; а P₃ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, пептид ОБМ ковалентно связан с вектором. В другом из воплощений составов, приведенных выше, пептид ОБМ нековалентно связан с вектором.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, вектор содержит наночастицы. В особом воплощении составов, приведенных выше, наночастицы представляют собой липосомы.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, вектор содержит целевой фрагмент. В особом воплощении составов, приведенных выше, вектор представляет собой целевой фрагмент.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, целевой фрагмент повышает: (a) доставку пептида ОБМ к иммунной клетке; или (б) поступление пептида ОБМ в иммунную клетку; по сравнению с пептидом ОБМ, связанного с вектором при отсутствии целевой части.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит остаток маннозы. В другом из воплощений составов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит антитело, которое особым образом связывается с иммунной клеткой. В другом из воплощений составов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит аптамер, который особым образом связывается с иммунной клеткой. В одном из воплощений составов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит пептид, который особым образом связывается с иммунной клеткой. В одном из воплощений составов, приведенных выше, иммунная клетка представляет собой В-клетку. В другом из воплощений составов, приведенных выше, иммунная клетка представляет собой антигенпрезентирующую клетку (АПК).

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает композицию для лечения рассеянного склероза. Данная композиция содержит в себе первый пептид основного белка миелина (ОБМ), связанный с первым вектором; первый пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R¹)_a-P₁-(R²)_b, где P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS:1-3; каждый R¹ и R², независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная a и b, независимо друг от друга, равна нулю или единице, где вектор представляет собой липосому, содержащую маннозилированные липиды.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, P₁ - это аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, состав дополнительно содержит: второй пептид ОБМ, связанный со вторым вектором, второй пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R³)_c-P₂-(R⁴)_d; и третий пептид ОБМ, связанный с третьим вектором, третий пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f, где P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1; P₂ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2; P₃ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3; каждый R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная a, b, c, d, e и f, независимо друг от друга, равна нулю или единице.

В одном из воплощении составов, приведенных выше, пептид(ы) ОБМ нековалентно связан(ы) с липосомами. В другом из воплощений составов, приведенных выше, пептид(ы) ОБМ инкапсулирован(ы) липосомами.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, средний диаметр липосомы составляет 100-200 нм.

В одном из воплощений составов, приведенных выше, маннозилированным липидом является тетраманнозил-3-L-лизин-диолеоил глицерола. В другом из воплощений составов, приведенных выше, маннозилированным липидом является manDOG.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения рассеянного склероза у пациента, нуждающегося в лечении: способ, включающий в себя введение указанному пациенту состава, состоящего из первого пептида основного белка миелина (ОБМ), связанного с первым вектором; первый пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R¹)_a-P₁-(R²)_b, где P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R¹ и R², независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; а каждая переменная a и b, независимо друг от друга, равна нулю или единице.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, а и b оба равны нулю. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, а равно единице, а b равно нулю. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, а равно нулю, а b равно единице. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, а и b оба равны единице.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 90%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 95%-идентичностью с SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 90%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 95%-идентичностью с SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 90%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 95%-идентичностью с SEQ ID NO:3. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав дополнительно содержит второй пептид ОБМ, связанный со вторым вектором, второй пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R³)_c-P₂-(R⁴)_d, где P₂ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R³ и R⁴, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; каждая переменная c и d, независимо друг от друга, равна нулю или единице, и где P₁ и P₂ представляют собой различные аминокислотные последовательности.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, первый и второй векторы являются одним вектором.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав дополнительно содержит третий пептид ОБМ, связанный с третьим вектором, третий пептид ОБМ состоит из следующей аминокислотной последовательности: (R⁵)_e-P₃-(R⁶)_f, где P₃ - аминокислотная последовательность, обладающая, по меньшей мере, 85%-идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-3; каждый R₅ и R⁶, независимо друг от друга, является аминокислотными последовательностями, состоящими из 1-10 аминокислот; каждая переменная e и f, независимо друг от друга, равна нулю или единице, и где P₁, P₂ и P₃ представляют собой различные аминокислотные последовательности.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, первый, второй и третий векторы являются одним вектором.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, P₁ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1; P₂ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2; а P₃ - аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, пептид ОБМ ковалентно связан с вектором. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, пептид ОБМ нековалентно связан с вектором.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, вектор содержит наночастицы. В конкретном воплощении наночастица представляет собой липосому.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, вектор содержит целевой фрагмент.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, целевой фрагмент повышает: (a) доставку пептида ОБМ к иммунной клетке; или (б) поступление пептида ОБМ в иммунную клетку; по сравнению с пептидом ОБМ, связанным с вектором при отсутствии целевой части.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, вектор представляет собой целевой фрагмент. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит остаток маннозы. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит антитело, которое особым образом связывается с иммунной клеткой. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит аптамер, который особым образом связывается с иммунной клеткой. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, целевой фрагмент содержит пептид, который особым образом связывается с иммунной клеткой. В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, иммунная клетка представляет собой В-клетку. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, иммунная клетка представляет собой антигенпрезентирующую клетку (АПК).

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав содержит пептид ОБМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, пептид ОБМ связан с вектором, содержащим целевой фрагмент, где вектор, содержащий целевой фрагмент, представляет собой липосому, содержащую маннозилированный липид.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав содержит: (i) первый пептид ОБМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; (ii) второй пептид ОБМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; и (iii) третий пептид ОБМ, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, пептид(ы) ОБМ нековалентно связан(ы) с липосомой.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, пептид(ы) ОБМ инкапсулирован(ы) липосомами.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, средний диаметр липосомы составляет 100-200 нм.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, маннозилированным липидом является тетраманнозил-3-L-лизин-диолеоил глицерола. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, маннозилированным липидом является manDOG.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав вводят пациенту, по меньшей мере, один раз в неделю. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, состав вводят пациенту, по меньшей мере, два раза в неделю. В другом варианте осуществления способов, приведенных выше, состав вводят пациенту ежедневно.

В одном варианте осуществления способов, приведенных выше, состав вводится пациенту путем местного применения, энтеросолюбильного введения или парентерального введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Крысы линии DA с индуцированным ЭАЭ (экспериментальный аллергический энцефаломиелит) являются наиболее соответствующими моделями грызунов с РС с точки зрения анти-ОБМ аутоантител, связывающих паттерн. (A) Сыворотка аутоантител от пациентов с РС и моделей грызунов, вырабатывающих экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (крысы линии DA и SJL, а также мыши линии C57BL/6), воспроизводимым образом связывает ОБМ при методе ELISA (энзим-связанный иммуносорбентный метод исследования). В качестве отрицательного контроля была использована сыворотка мышей линии BALB/c. (B) Построение эпитопного банка ОБМ. Типичное окрашивание Кумасси и гибридизация с использованием вестерн-блоттинга для anti-с-myc и анти-ОБМ мАт с эпитопным банком ОБМ. Anti-с-myc Ab связывает все члены эпитопного банка ОБМ благодаря наличию целевого эпитопа во всех слитых белках (схема сверху), тем самым, предполагая воздействие и доступность всех пептидов ОБМ, расположенный непосредственно выше по потоку к эпитопу с-myc. Моноклональные анти-ОБМ Ab (клон F4A3, эпитоп ОБМ RHGFLPRHR (SEQ ID NO:20)) вступает в реакцию с ОБМ и его пептидами ОБМ2 и ОБМ3, как и было предсказано. (C) Сыворотка аутоантител, связывающих паттерн с эпитопным банком ОБМ согласно методу ELISA. По нашим данным крысы линии DA, вырабатывающие ЭАЭ, являются наиболее подходящей моделью грызунов с РС. Последовательность ОБМ с пептидами, представленными в его эпитопном банке, показаны снизу (SEQ ID NO:17). Каждый десятый аминокислотный остаток отмечен жирным шрифтом. Квадратные скобки представляют собой иммунодоминантные пептиды ОБМ-1/-2/-3, отобранные для достижения эффективности скрининга лечения.

Фиг.2. Характеристика специфичности и аффинности поликлональных антител от крыс линии DA, иммунизированных ОБМ (63-81). (A) Верхняя панель показывает нам, что три фрагмента ОБМ распознаются по сыворотке аутоантитела от крыс линии DA с искусственным ЭАЭ. Иммунодоминантные пептиды были определены согласно методу ELISA из аutoАb, связывающегося с эпитопным банком, а дальнейший теоретический расчет основан на предположении их перекрывающихся последовательностей. Кроме того, для проверки анализа связывания, эпитопный банк ОБМ был гибридизован с anti-с-myc и анти-ОБМ F4A3 мкАт (нижняя панель). (B) Количественные характеристики распознавания определенных эпитопов с помощью аутоантитела, измеряемого методом ППР (поверхностный плазмонный резонанс). Вы можете также увидеть соответствующие пептиды и эффективные константы диссоциации. Точные эпитопы выделены жирным шрифтом, н/о = не определено.

Фиг.3. Схематическое изображение метода липосомации, используемого для инкапсуляции иммунодоминантных пептидов ОБМ в маннозилированные SUV липосомы. (Сверху слева) Смесь липидов (Egg PC с 1% маннозилированного DOG) в хлороформе. (Сверху посередине) Образование нерегулярных липидных слоев при испарении органического растворителя. (Сверху справа) Первая регидратация приводит к образованию многослойных MLV липосом. Средний диаметр частиц составляет 1-5 мкм. (Снизу слева) Лиофилизация SUV липосом, полученных из MLV липосом путем гомогенизации под высоким давлением, и смеси пептидов избыточным сахаром. (Снизу посередине) Пептиды расположены между обрушившимися SUV липосомами. (Снизу справа) Инкапсулирование пептидов в течение второй регидратации в SUV липосомы размером около 60-80 нм и 1,0% остатков маннозы на поверхность. Воспроизведения были выполнены компанией "Visual Science Company".

Фиг.4. Включенные в липосомы иммунодоминантные пептиды ОБМ улучшают показатели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс линии DA. Все рассматриваемые группы (А-G) были изучены по среднему индексу заболевания, показателю глиоза/демиелинизации. Необработанная контрольная (получающая носитель) группа показана жирной темной линией (А) и повторяется на каждом графике для сравнения. Для лечения ЭАЭ у крыс линии DA использовались три иммунодоминантных фрагмента ОБМ, инкапсулированные в маннозилированные SUV липосомы: Во время первой атаки (B) ОБМ (46-62) оказался наиболее эффективным при снижении максимального индекса заболевания, ОБМ (124-139) (C) и ОБМ (147-170) (D) предотвратили развитие периода ремиссии. Введение смеси ОБМ (46-62), ОБМ (124-139) и ОБМ (147-170) иммунодоминантных пептидов ОБМ, включенных в липосомы, значительно улучшило показатели затянувшийся ЭАЭ (E), копаксон (copaxone) (F) и свободный пептид ОБМ (46-62) (G) использовались в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Для каждой группы представлен средний индекс заболевания. Статистически существенная разница показана жирным курсивом. Характерный профиль отдельно выбранной крысы показан тонкой линией. Характерный показатель гематоксилина и окрашивания эозином показаны на панели справа.

Фиг.5. Включенные в липосомы иммунодоминантные пептиды ОБМ снижают содержание сывороточного анти-ОБМ титра аутоантител и подавляет Th1 профиль цитокина ЦНС. (A) Концентрация сывороточного анти-ОБМ аутоантитела у крыс линии DA c ЭАЭ, получавших ОБМ1 SUV, ОБМ1/2/3 SUV и копаксон, в сравнении с необработанными и неиммунизированными крысами. Типичное окрашивание luxol fast blue (B), иммуноокрашивание для Th1 цитокинов IFNγ (B) и IL2 (C), и иммуноокрашивание BDNF (нейротрофический фактор головного мозга) (D) в срезах мозга крыс линии DA, получивших ОБМ1 SUV (внизу справа), ОБМ1/2/3 SUV (внизу слева) и копаксон (сверху справа), в сравнении c необработанными крысами (сверху слева).

Фиг.6. Средний балл паралича для ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. В течение всего срока периодов исследования мы ежедневно присваивали показатель паралич каждой крысе: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения (всего 35 дней). 54 ЭАЭ-индуцированных крыс линии DA были поровну разделены на 9 групп. Группы I-VII лечили лекарственными средствами 1-7, VIII группу лечили копаксоном (положительная контрольная группа), IX группе вводили инъекции воды (отрицательная контрольная группа). Мы ежедневно записывали показатели паралича, и они отображаются в виде средних значений для групп I-V (A) и групп VI-IX (B). Статистически значимое снижение показателя паралича, в сравнении контрольных групп, наблюдалось у группы IV (лечение 4 лекарственным средством) на 3 и 4 день после лечения (n=6, *p<0,05). Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.7. Средний вес туловища (г) ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. Мы записывали вес всех животных на протяжении всех периодов исследования: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения (всего 35 дней). 54 ЭАЭ-индуцированные крысы линии DA были поровну разделены на 9 групп. Статистически значимых различий между весом тел крыс, получавших препараты с пептидом ОБМ, и контрольными группами не выявлено. Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.8. Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) спинного мозга от ЭАЭ-индуцированной модели крысы с РС. Изображения при 10× и 40× увеличении спинного мозга, выделенного из ЭАЭ-индуцированных крыс линии DA, получавших: (A) (крыса 35; группа II), (крыса 53; группа IV), (крыса 69; группа IX); (B) (крыса 71; группа VIII), (крыса 77; группа III), (крыса 79; группа V); (C) (крыса 81; группа I), (крыса 95; группа VII), (крыса 2003; группа VI).

Фиг.9. Экспериментальный план. Экспериментальная модель, включая пептидные идентичности, содержание липосомное и дозировка для всех экспериментальных лекарственных средств, испытанная в примерах 12, 13 и 14. ОБМ1 (SEQ ID NO:1); ОБМ1FL (SEQ ID NO:9); ОБМ1FR (SEQ ID NO:10); ОБМ2 (SEQ ID NO:2); ОБМ3 (SEQ ID NO:3).

Фиг.10. Средний показатель паралича для ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. В течение всего срока периодов исследования мы ежедневно присваивали показатель паралич каждой крысе: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения (всего 36 дней). 54 ЭАЭ-индуцированные крысы линии DA были поровну разделены на 10 групп. Группы I-VIII лечили лекарственными средствами ОБМ F 1-8, IX группу лечили Копаксоном (положительная контрольная группа), X группе вводили инъекции воды (отрицательная контрольная группа). Статистически значимое снижение показателя паралича, в сравнении контрольных групп, наблюдалось у групп III и IV (лечение осуществлялось 200 мг дозой) на 2 и 3 день после лечения (n=5, *p<0,05). Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.11. Средний вес туловища (г) ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. Мы записывали вес всех животных на протяжении всех периодов исследования: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения (всего 36 дней). 54 ЭАЭ-индуцированные крысы линии DA были поровну разделены на 10 групп. Статистически значимых различий между весом тел крыс, получавших препараты с пептидом ОБМ, и контрольными группами не выявлено. Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.12. Средний показатель паралича для ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. В течение всего срока периодов исследования мы ежедневно присваивали показатель паралич каждой крысе: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения. 42 ЭАЭ-индуцированные крысы линии DA были поровну разделены на 7 групп. Группы II-V лечили лекарственными средствами ОБМ F I-IV, группы VI и VII лечили копаксоном (150 мкг и 450 мкг, соответственно; положительная контрольная группа), а I группе вводили инъекции воды (отрицательная контрольная группа). Статистически значимое снижение показателя паралича, в сравнении с отрицательным контролем, наблюдалось для: группа II (лечение осуществлялось липосомной рецептурой ОБМ1; соотношение пептида к липиду 1:330) на 1-4 день после лечения (n=6, *p<0,005); группа III (лечение осуществлялось липосомной рецептурой ОБМ1/2/3; соотношение пептида к липиду 1:330) в 1 день после лечения (n=6, *p<0,05); и группа V (лечение осуществлялось липосомной рецептурой ОБМ1/2/3; соотношение пептида к липиду 1:110) на 1-3 день после лечения (n=6, *p<0,05). Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.13. Средний вес туловища (г) ЭАЭ-индуцированных моделей крыс с РС. Мы записывали вес всех животных на протяжении всех периодов исследования: акклиматизация, введение ЭАЭ, лечение и процедуры после лечения. 42 ЭАЭ-индуцированные крысы линии DA были поровну разделены на 7 групп. Статистически значимых различий между весом тел крыс, получавших препараты с пептидом ОБМ, и контрольными группами не выявлено. Стандартное отклонение измеряется планками погрешностей.

Фиг.14. Выравнивание последовательности 7 сплайсированных изоформ ОБМ Идент. номера компании "UniProt": P02686 (SEQ ID NO:13); P02686-2 (SEQ ID NO:14); P02686-3 (SEQ ID NO:15); P02686-4 (SEQ ID NO:16); P02686-5 (SEQ ID NO:17); P02686-6 (SEQ ID NO:18); и P02686-7 (SEQ ID NO:19).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Введение

Рассеянный склероз (РС) - нейродегенеративное заболевание тяжелой степени, имеющее аутоиммунный фон. Хотя уже известно несколько методов лечения по управлению рассеянным склерозом, лекарства от этой болезни не существует. Кроме того, существующие в настоящее время терапии имеют ограниченную эффективность и могут привести к нежелательным побочным эффектам. Соответственно, разработка новых подходов к лечению РС имеет большое значение. В данном документе мы приводим доклад о композициях и использовании В-клеточных эпитопов основного белка миелина (ОБМ), инкапсулированного в небольшие однослойные (SUV) маннозилированные липосомы, в качестве эффективного лекарственного средства для экспериментального лечения аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у крыс линии DA, и принятую в данной области модель РС у людей.

Одновременно, настоящее изобретение предлагает терапевтические композиции антигенных пептидов ОБМ, связанных с вектором, пригодные для лечения рассеянного склероза. В конкретном воплощении терапевтические композиции содержат один, два или три антигенных пептида ОБМ, связанных с вектором (например, липосомы), необязательно содержащих целевую часть (например, маннозилированный липид). При введении пациенту с рассеянным склерозом, терапевтические композиции улучшают когнитивные способности и облегчают симптомы паралича. Таким образом, настоящее изобретение также предлагает способы лечения, управления и профилактики рассеянного склероза у нуждающегося в этом субъекта.

Используя эпитопный банк основного белка миелина, мы смогли проанализировать вяжущий шаблон сывороточных аутоантител (autoAb) ремиттирующих пациентов с РС и сравнить с анти-ОБМ autoAb от швейцарских мышей Джеймса Ламберта (SJL), мышей линии C57 black 6 (C57BL/6) и крыс линии Dark Agouti (DA) с ЭАЭ. На основе спектрального анализа autoAb по отношению к ОБМ фрагментам было обнаружено, что крысы линии DA с ЭАЭ являются наиболее соответствующими моделями грызунов с РС. Для лечения ЭАЭ у крыс линии DA использовались три иммунодоминантных фрагмента ОБМ, инкапсулированного в маннозилированные SUV липосомы. ОБМ (46-62) оказался наиболее эффективным в снижении максимального индекса заболевания во время первой атаки, в то время как ОБМ (124-139) и ОБМ (147-170) предотвратили развитие стадии обострения заболевания. Введение смеси иммунодоминантных пептидов ОБМ, значительно включенных в липосомы, улучшает затянувшийся ЭАЭ. благодаря понижающей регуляции цитокинов Th1 и вызыванию выработки BDNF (нейротрофический фактор головного мозга) в ЦНС. Синергетические эффекты ОБМ пептидов снижают общие показатели течения заболевания при умеренной первой атаке и дают быстрый результат при обострении, предлагая новейшее лечебное воздействие для лечения РС.

II. Определения

В данном контексте понятие "вектор" относится к молекулярной структуре, способной связываться с грузом (например, терапевтические или диагностические малые молекулы, пептиды, нуклеиновые кислоты и белковые биопрепараты). В одном воплощении вектор представляет собой молекулярную структуру, которая "таит" или "пасет" терапевтический груз (например, пептид ОБМ), введенный нуждающемуся субъекту. Вектор может, но вовсе не обязательно: улучшить терапевтический эффект, придаваемый грузом; улучшить или осуществить целевую доставку груза к местоположению в условиях in vivo или клеточному типу; улучшить усвоение груза во всех клетках или отдельных клетках в условиях in vitro или in vivo; увеличить период полураспада груза в условиях in vivo; защитить груз от нежелательных взаимодействий в условиях in vivo; или уменьшить с