Тест-система для днк-идентификации индивида, основанная на полиморфных маркерах х-хромосомы

Тест-система для днк-идентификации индивида, основанная на полиморфных маркерах х-хромосомы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в криминалистической и судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

В практике ДНК-идентификации, в основном, используют тест-системы, основанные на микросателлитных локусах аутосом (PowerPlex® 16 HS System компании Promega, AmpFlSTR® Identifiler® Plus компании Life Technologies, Investigator® IDplex Plus компании QIAGEN и др.), реже маркеры Y-хромосомы (PowerPlex® Y23 System компании Promega, Investigator Argus Y-12 QS Kit компании QIAGEN и др.), маркеры X-хромосомы (Investigator Argus Х-12 Kit компании QIAGEN и др.). Ближайшим аналогом патентуемой тест системы является набор X-SNP маркеров, предложенный Li L. и др., для ДНК-идентификации в популяции китайцев (Li, 2015). Однако панель Li имеет небольшую емкость мультиплексов (17-18 маркеров) и требует 4 отдельных мультиплексных ПЦР и 4 iPLEX-реакции, тогда как в данной панели большее число маркеров собрано лишь в 2 мультиплекса, что экономически выгоднее.

Каждая из тест-систем имеет как ряд преимуществ, так и недостатков. Если сравнить 4 типа возможных маркеров, то можно заметить, что в случаях определения родства между отцом и дочерью, и бабушкой по отцу и внучкой маркеры Х-хромосомы превосходят возможности аутосомных, в два и четыре раза соответственно, Y-хромосомные маркеры в данном случае бесполезны. В случаях определения родства между предполагаемой матерью и сыном возможности Х-хромосомных маркеров в два раза превосходят возможности аутосомных маркеров. Также, Х-хромосомные маркеры информативнее аутосомных, в сложных случаях экспертизы на родство: в случае определения родства между предполагаемым отцом и дочкой, когда ДНК предполагаемого отца не доступна; когда доступна только ДНК предполагаемых сводных сестер по отцу; в случаях определения отцовства между близкими родственниками, например двумя братьями (за исключением монозиготных близнецов) или отцом и сыном, а также в случае инцеста (Szibor, 2007, Jobling, 2014).

Существующие на настоящее время генетические тест-системы, используемые в практике экспертно-криминалистических служб, как за рубежом, так и в России, разработаны на основании данных о генетическом разнообразии Северной Америки и стран Западной Европы. Это является недостатком для проведения генетической экспертизы представителей популяций России.

Ключевым моментом ДНК-идентификации являются вероятностные расчеты совпадения генотипов, основанные на референтных частотах аллелей в популяции, из которой происходит изучаемый ДНК-профиль. К тому же, маркеры, входящие в состав используемой тест-системы, должны обладать рядом характеристик, которые могут варьировать от популяции к популяции. Так наличие равновесия по сцеплению между используемыми локусами является обязательным требованием, предъявляемым к используемой тест-системе. Многочисленные исследования архитектуры неравновесия по сцеплению (LD) в различных популяциях показали, что характер LD выявленный в конкретной популяции не может быть автоматически экстраполирован на другие популяции, поскольку нельзя игнорировать взаимодействие между различными популяционно-специфическими факторами и геноспецифическими механизмами при формировании структуры неравновесия по сцеплению. Таким образом, наиболее информативными для генетической экспертизы в России являются те тест-системы, которые разрабатывались на основе данных о генетическом разнообразии народонаселения РФ или же адаптировались для использования на территории России. Использование генетических систем ДНК-идентификации без учета генетической специфичности популяции, из которой происходит исследуемый ДНК-профиль, снижает достоверность выводов.

Использование определенного типа маркеров также влияет на информативность генетической экспертизы в каждом конкретном случае. Современные тест-системы, основанные на микросателлитных маркерах, наиболее информативны в случаях идентификации индивида, за счет высокого темпа мутирования данного типа маркеров. Однако в случаях экспертизы на родство высокий темп мутации является недостатком. Таким образом, при проведении процедуры ДНК-идентификации с целью определения родственных связей между индивидами целесообразнее использовать однонуклеотидные полиморфные маркеры (SNP).

В состав патентуемого набора маркеров было отобрано 64 SNP-маркера Х-хромосомы, обладающие наибольшей информативностью для ДНК-идентификации в популяциях Российской Федерации. Набор состоит из двух групп маркеров, способных к мультиплексированию. Один мультиплекс включает в себя 35 однонуклеотидных полиморфных маркеров X-хромосомы: rs5953326 (49373567 пар нуклеотидов, р11.23) (здесь и далее в скобках указаны характеристики расположения маркера на Х-хромосоме), rs5974708 (125675579 п.н., q25), rs2694742 (3127322 п.н., р22.33), rs7058109 (113228559 п.н., q23), rs4830049 (126759219 п.н., q25), rs5945770 (102594936 п.н., q22.1), rs9329406 (115740985 п.н., q23), rs5941047 (91431385 п.н., q21.31), rs471205 (66238317 п.н., q12), rs5962008 (6325520 п.н., p22.31), rs1405303 (4120689 п.н., p22.33), rs4826609 (54765913 п.н., p11.22), rs5934683 (9751474 п.н., p22.2), rs11799030 (53056518 п.н., p11.22), rs5974348 (112218701 п.н., q23), rs5973840 (107319029 п.н., q22.3), rs217937 (118511843 п.н., q24), rs1351260 (26948596 п.н., p21.3), rs6624701 (63749154 п.н., q11.2), rs4131729 (51697194 п.н., p11.22), rs222108 (86910110 п.н., q21.31), rs2797125 (130815979 п.н., q26.2), rs5969528 (81668873 п.н., q21.1), rs6609159 (41573566 п.н., p11.4), rs205847 (42791946 п.н., p11.3), rs761913 (37859510 п.н., p11.4), rs2411976 (78383858 п.н., q21.1), rs225067 (29149024 п.н., p21.3), rs5975695 (135268469 п.н., q26.3), rs4898334 (101387968 п.н., q22.1), rs4826682 (5119276 п.н., p22.32), rs5937091 (70745323 п.н., q13.1), rs5909923 (121978166 п.н., q25), rs2404797 (8795378 п.н., p22.31), rs3005641 (34029930 п.н., p21.1). Второй мультиплекс включает в себя 29 однонуклеотидных полиморфных маркеров Х-хромосомы: rs7888207 (11916455 п.н., р22.2), rs5977991 (133429960 п.н., q26.2), rs5915291 (50379075 п.н., p11.22), rs4825213 (143435373 п.н., q27.3), rs5977571 (124496989 п.н., q25), rs5968597 (84946832 п.н., q21.2), rs4484871 (22751065 п.н., p22.11), rs5922869 (83049688 п.н., q21.1), rs1781486 (144674621 п.н., q27.3), rs766117 (43816206 п.н., p11.3), rs614511 (149537834 п.н., q28), rs5919529 (67358208 п.н., q12), rs916208 (127941251 п.н., q25), rs1389433 (28128729 п.н., p21.3), rs926640 (129462353 п.н., q26.1), rs4825002 (140430391 п.н., q27.2), rs4454452 (30985342 п.н., p21.2), rs17391 (131910697 п.н., q26.2), rs2869922 (141490609 п.н., q27.2), rs5949581 (94756278 п.н., q21.33), rs1474970 (90394689 п.н., q21.31), rs2207739 (75644692 п.н., q13.3), rs2504169 (146358005 п.н., q27.3), rs5921682 (100130437 п.н., q22.1), rs2317327 (15407061 п.н., p22.2), rs5963641 (39216082 п.н., p11.4), rs1285715 (106308416 п.н., q22.3), rs5917990 (40387891 п.н., p11.4), rs952076 (13946956 п.н., p22.2).

Статистический анализ данных о генетическом разнообразии популяций России по данному набору маркеров показал, что патентуемый набор обладает высоким идентификационным потенциалом. Информативность патентуемого набора однонуклеотидных полиморфных маркеров х-хромосомы в популяции русских, превосходит возможности существующих систем ДНК-идентификации. Уровень вероятности дискриминации неродственных индивидов (PD) составил 0,99999999999999999999999986 для женщин и 0,999999999999999986 для мужчин.

Возможным способом генотипирования тест-системы является методика проведения MALDI-TOF масс-спектрометрии, предложенная фирмой Agena Bioscience (ранее Sequenom Bioscience). Методика включает в себя ряд реакций (ПЦР, SAP-реакция, iPLEX-реакция) с последующим анализом амплификата с помощью генетического анализатора «MassARRAY Analyzer 4». Данная методика проведения генотипирования обладает высокой чувствительностью, высокой пропускной способностью, а также является экономически выгодной, что является преимуществом для практического применения.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, определяющие маркеры, формирующие патентуемую тест-систему, для генотипирования методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, имеют следующий нуклеотидный состав:

Суммируя все вышесказанное, можно сказать, что патентуемый набор однонуклеотидных полиморфных маркеров Х-хромосомы является высокоинформативной для популяций Российской Федерации тест-системой, особо эффективной в сложных случаях экспертизы на родство. Аналогов в России на настоящее время не существует.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jobling М, Gill P. Encoded evidence: DNA in forensic analysis // Nature reviews. 2004. V. 5. 739-752.

2. Li Y., Liu Y. and Lin Y. Typing of 67 SNP Loci on X Chromosome by PCR and MALDI-TOF MS // Research in Genetics. 2015. Vol. 2015 (2015). Article ID 374688, 9 pages.

3. Szibor R.X-chromosomal markers: past, present and future // Forensic Sci Int Genet. 2007. № 1(2). P. 93-99.

Тест-система, содержащая синтетические олигонуклеотидные праймеры, представляющие собой нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-192 и определяющие 64 однонуклеотидных полиморфных маркера Х-хромосомы, где указанная совокупность маркеров обладает достаточной информативностью для проведения генетической экспертизы на территории Российской Федерации и состоит из двух групп маркеров, способных к мультиплексированию, содержащих 35 ((rs5953326 (49373567 пар нуклеотидов), p11.23 (rs5974708 125675579 п.н., q25), rs2694742 (3127322 п.н., р22.33), rs7058109 (113228559 п.н., q23), rs4830049 (126759219 п.н., q25), rs5945770 (102594936 п.н., q22.1), rs9329406 (115740985 п.н., q23), rs5941047 (91431385 п.н., q21.31), rs471205 (66238317 п.н., q12), rs5962008 (6325520 п.н., p22.31), rs1405303 (4120689 п.н., p22.33), rs4826609 (54765913 п.н., p11.22), rs5934683 (9751474 п.н., p22.2), rs11799030 (53056518 п.н., p11.22), rs5974348 (112218701 п.н., q23), rs5973840 (107319029 п.н., q22.3), rs217937 (118511843 п.н., q24), rs1351260 (26948596 п.н., p21.3), rs6624701 (63749154 п.н., q11.2), rs4131729 (51697194 п.н., p11.22), rs222108 (86910110 п.н., q21.31), rs2797125 (130815979 п.н., q26.2), rs5969528 (81668873 п.н., q21.1), rs6609159 (41573566 п.н., p11.4), rs205847 (42791946 п.н., p11.3), rs761913 (37859510 п.н., p11.4), rs2411976 (78383858 п.н., q21.1), rs225067 (29149024 п.н., p21.3), rs5975695 (135268469 п.н., q26.3), rs4898334 (101387968 п.н., q22.1), rs4826682 (5119276 п.н., p22.32), rs5937091 (70745323 п.н., q13.1), rs5909923 (121978166 п.н., q25), rs2404797 (8795378 п.н., p22.31), rs3005641 (34029930 п.н., p21.1)) и 29 ((rs7888207 (11916455 п.н., p22.2), rs5977991 (133429960 п.н., q26.2), rs5915291 (50379075 п.н., p11.22), rs4825213 (143435373 п.н., q27.3), rs5977571 (124496989 п.н., q25), rs5968597 (84946832 п.н., q21.2), rs4484871 (22751065 п.н., p22.11), rs5922869 (83049688 п.н. q21.1), rs1781486 (144674621 п.н., q27.3), rs766117 (43816206 п.н., p11.3), rs614511 (149537834 п.н., q28), rs5919529 (67358208 п.н., q12), rs916208 (127941251 п.н., q25), rs1389433 (28128729 п.н., p21.3), rs926640 (129462353 п.н., q26.1), rs4825002 (140430391 п.н., q27.2), rs4454452 (30985342 п.н., p21.2), rs17391 (131910697 п.н., q26.2), rs2869922 (141490609 п.н., q27.2), rs5949581 (94756278 п.н., q21.33), rs1474970 (90394689 п.н., q21.31), rs2207739 (75644692 п.н., q13.3), rs2504169 (146358005 п.н., q27.3), rs5921682 (100130437 п.н., q22.1), rs2317327 (15407061 п.н., p22.2), rs5963641 (39216082 п.н., p11.4), rs1285715 (106308416 п.н., q22.3), rs5917990 (40387891 п.н., p11.4), rs952076 (13946956 п.н., p22.2)) однонуклеотидных маркеров X-хромосомы.