Библиотека fv на основе комбинаций белков и способ ее получения

Библиотека fv на основе комбинаций белков и способ ее получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к способу конструирования библиотеки Fv, который основан на комбинации белков, способу скрининга желаемого антитела с использованием сконструированной библиотеки Fv, антителу Fv, выбранному этим способом скрининга, и библиотеке Fv, сконструированной способом конструирования библиотеки Fv.

Уровень техники

Антитела являются белками, продуцируемыми В-лимфоцитами иммунной системы в ответ на антигены, они узнают эти антигены и связываются с ними. Такие антитела считаются потенциальными новыми лекарственными средствами для лечения заболеваний. Для нахождения антител желаемой функциональности конструировали различные библиотеки антител и путем скрининга отбирали функциональные антитела из них. Такие библиотеки антител конструируют с использованием технологии рекомбинации генов. Как правило, гены, кодирующие белки антител, экстрагируют из В-клеток человека для конструирования библиотек генов антител, и антитела, имеющие желаемую специфичность связывания антигена, отбирают скринингом из этих библиотек. Технология библиотек антител оказалось революционной в конструировании антител, таких как антитела человека. Наиболее примечательной характеристикой антительного ответа является то, что антитело, специфичное к определенному типу или форме антигена, может быть получено в пределах одной недели, если этот антиген является чужеродным веществом, отличающимся от компонентов in vivo. Антитела продуцируются В-лимфоцитами, и один В-лимфоцит продуцирует только один тип антитела. Известно, что в теле человека существует множество В-лимфоцитов и каждый В-лимфоцит на своей клеточной мембране экспрессирует антитело, имеющее уникальную антигенсвязывающую специфичность. В общем, известно, что в теле человека существует антигенсвязывающее разнообразие примерно 10⁸. При внедрении антигена в тело быстро пролиферируют только те В-лимфоциты, которые экспрессируют антитело, специфически связывающееся с этим антигеном, при этом продуцируя большое количество этого антитела, и в результате концентрация этого антитела в сыворотке быстро увеличивается, тем самым быстро элиминируется внедрившийся антиген. Таким образом, в теле человека существует разнообразие антител в нескольких сотен миллионов, и это разнообразие антител называют репертуаром антител. Когда путем сбора крови отбирают достаточное количество В-лимфоцитов из тела человека, после чего из этих клеток выделяют мРНК и синтезируют кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, можно относительно простым образом сконструировать репертуар антител человека в форме генов in vitro. Ключ технологии библиотеки антител заключается в экспрессии (или дисплее) этого репертуара генов антител в виде белков, при этом «привязав» каким-либо образом к ним ген, кодирующий данное антитело (связывание генотип-фенотип), благодаря чему можно тестировать отобранное из библиотеки антитело на связывание со специфическим антигеном и получить ген, кодирующий это специфическое антитело. Здесь не требуется идеальное повторение иммунитета, и этот репертуар может либо быть отображен в виде Fab антител, имеющих антигенсвязывающую функцию, либо в виде фрагментов антитела, называемых scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), в котором вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи (V_H и V_L) соединены. В данном документе дисплей классифицируют как фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей и т.п. в соответствии с типом среды, которая используется для связи генотип-фенотип, и антитело, имеющее желаемые антигенсвязывающие характеристики, может быть получено без индукции иммунного ответа введением антигена. Однако имеются дефекты, заключающиеся в том, что требуется хорошее знание специальных методов и технологий для конструирования библиотек антител и их скрининга, и при этом нелегко получать высокоаффинные антитела, и, следовательно, после скрининга антител часто выполняются процедуры оптимизации антител, такие как созревание аффинности. Кроме того не может быть выполнен функциональный анализ в клетках млекопитающих вследствие таких проблем, как токсичность, в частности во время первой стадии скрининга. Такие дефекты становятся барьером для развития терапевтических антител, так как терапевтические антитела должны не просто связываются с антигенами, но и иметь терапевтические функции.

Среди библиотек антител в настоящее время наиболее часто используют библиотеки фагового дисплея. Собственно Humira (моноклональное антитело человека к TNF-альфа), которое сейчас является доступным в продаже терапевтическим агентом для лечения ревматоидного артрита, является терапевтическим антителом, полученным с использованием технологии фагового дисплея. Идеальная библиотека антител должна содержать огромное разнообразие антител, чтобы путем скрининга могли быть выявлены высокоаффинные клоны антител, имеющие желаемую антигенсвязывающую специфичность. Для этой цели следует сконструировать библиотеку, содержащую примерно 10¹⁰-10¹¹ антител. Однако очень трудно сконструировать библиотеку, имеющую подобный размер, клонированием генов антител, и это считается наиболее значительной проблемой в создании библиотек фагового дисплея. Кроме того, имеется следующий недостаток, заключающийся в том, что функциональный анализ не может быть непосредственно выполнен, так как сами фаги действуют так, что они являются токсичными.

Наиболее большим преимуществом технологии рибосомного дисплея является бесклеточная система, и, теоретически, с помощью данной технологии могут быть легко сконструированы библиотеки, имеющие большой размер, примерно 10¹³. Таким образом, технология рибосомного дисплея является выгодной для поиска высокоафинных антител (обычно когда размер библиотеки антител больше, возможность наличия в ней антител с высокой аффинностью тоже больше). Кроме того, поскольку ПЦР-амплификация выполнима в технологии рибосомного дисплея, может быть использована склонная к ошибкам ПЦР-амплификация и т.п., и, следовательно, введение мутации для искусственного индуцирования является очень легким. Однако технология рибосомного дисплея также имеет проблемы токсичности и различные проблемы с постановкой эксперимента. По этой причине технологию рибосомного дисплея используют в основном для конструирования библиотек антител нативного происхождения.

В технологии дрожжевого дисплея имеются много технических ограничений для приготовления библиотек антител, имеющих разнообразие 10⁹ или более, так как требуется процесс введения рекомбинантного вектора в штамм S.cerevisiae и размер клеток дрожжей является большим. Поэтому технологию дрожжевого дисплея используют в основном для конструирования мутантной библиотеки уже установленных антигенспецифических антител, для скрининга высокоаффинных антител и для отбора скринингом высокоаффинных антител из мутантной библиотеки.

Однако во всех таких библиотеках антител антитела не разделены индивидуально, а смешаны все вместе. Кроме того, подобные библиотеки антител имеют недостатки, которые заключаются в том, что скрининг антитела к антигену-мишени, основанный на его функции (активности), фактически является невозможным, и можно лишь скринировать антитела на основе их связывания с антителом. Первые антитела-кандидаты, полученные в этой процедуре, испытывают на их функцию в следующей стадии для отбора антител, имеющих нужные функции. В большинстве случаев в этой стадии отбора получают антитела, которые легко связываются, но не имеют функции. Таким образом, требуется новый способ, который преодолевает этот недостаток данного способа скрининга. Другими словами, требуется способ скрининга антител на основе их функции с самого начала. Однако существующие библиотеки находятся в состоянии, в котором различные антитела смешаны вместе, и невозможно отбирать скринингом индивидуальные антитела на основе их функции. Таким образом, если будет возможно индивидуально очищать и хранить все антитела в специальной адресуемой библиотеке, подобной библиотекам низкомолекулярных соединений, можно будет подвергать скринингу антитела на основе их функции. Однако, поскольку антитела являются белками, требуются процессы для экспрессии и очистки антител, получается, что фактически невозможно сконструировать библиотеку 100000 или 1000000 различных антител. Другими словами, общепринятые способы имеют недостатки, заключающиеся в том, что когда в состав библиотеки входит 1000000 белков, требуется очистка 1000000 белков, и количество требуемых очисток белка увеличивается экспоненциально по мере увеличений разнообразия. Общепринятые технологии конструирования библиотек включают в себя технологию конструирования библиотеки объединением V_H и V_L на уровне ДНК в векторе (U.S. Pat No. 8,178,320), технологию конструирования библиотеки легких цепей и тяжелых цепей на уровне ДНК (U.S. Pat No. 7,858,559), etc. Однако эти технологии конструирования библиотек имеют недостатки, заключающиеся в том, что требуется очистка желаемого количества белков для конструирования библиотеки, имеющей разнообразие, удовлетворяющего комбинации этих белков на уровне ДНК. Кроме того, функции этих антител в сконструированной библиотеке не могут быть немедленно проанализированы вследствие огромного количества этих антител, и по этой причине требуется дополнительная стадия уменьшения количества антител, которые предполагается скринировать на связывание с антигенами и затем анализировать их функцию, и нужное антитело может быть упущено во время этого скрининга. В частности, в общепринятых способах конструирования библиотек Fv должны экспрессироваться с комбинациями на уровне ДНК, и, следовательно, требуется очистка белков, соответствующая разнообразию библиотеки. Таким образом, общепринятыми способами конструирования библиотек нельзя сконструировать библиотеку, содержащую индивидуальные разделенные антитела.

При таких обстоятельствах авторы данного изобретения приложили многочисленные усилия для получения библиотеки, в которой антитела индивидуально разделены, так что они могут быть подвергнуты скринингу по функции. Авторы этого изобретения уделяли внимание конструированию библиотеки, в которой комбинации происходили на уровне белков, в отличие от общепринятых технологий конструирования библиотеки, и было обнаружено, что библиотека Fv на основе комбинации белков может быть сконструирована объединением V_H и V_L на уровне белка, завершая тем самым создание данного изобретения.

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Одной целью данного изобретения является обеспечение способа конструирования библиотеки Fv (вариабельный фрагмент) на основе комбинирования белков.

Другой целью данного изобретения является обеспечение способа выявления скринингом желаемого антитела с использованием библиотеки Fv, сконструированной вышеуказанным способом.

Еще одной целью данного изобретения является обеспечение желаемого антитела Fv, выявленного вышеупомянутым способом скрининга.

Еще одной целью данного изобретения является обеспечение библиотеки Fv, сконструированной вышеупомянутым способом конструирования библиотеки Fv на основе комбинирования белков.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанных целей, в первом аспекте, данное изобретение обеспечивает библиотеку Fv (вариабельных фрагментов) на основе комбинирования белков и способ для ее конструирования. В частности, данное изобретение обеспечивает библиотеку Fv, основанную на комбинировании белков, причем эта библиотека Fv содержит белки домена V_H, связанные с белками домена V_L.

Данное изобретение обеспечивает также способ конструирования библиотеки Fv на основе комбинаций белков, причем этот способ конструирования библиотеки Fv основан на комбинировании белков и содержит стадии: (а) приготовления белков домена вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и белков домена вариабельной области легкой цепи (V_L) и (b) спаривания белков домена V_H и белков домена V_L, приготовленных в стадии (а), друг с другом.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 схематически показывает слитые белки, каждый из которых содержит мишень-LPETG-линкер (имеющий различную длину)-Sortase-His тег. (А): линкер, состоящий из 7 аминокислот, (В): линкер, состоящий из 18 аминокислот, и (С) линкер, состоящий из 20 аминокислот.

Фиг. 2 схематически показывает связывание путем спаривания для конструирования библиотеки Fv на основе комбинаций белков по данному изобретению. (А): спаривание между дикими типами; (В): спаривание дисульфидными связями и (С) спаривание суперспиралью.

Фиг. 3 схематически показывает простой процесс очистки белка.

Фиг. 4 показывает результаты SDS-PAGE (ДСН-ПААГ) очищенных мутантов V_L и V_H.

Фиг. 5 показывает, что экспрессия V_H-G44C, который является белком домена V_H, не имеющим метки Flag, Flag-V_H-G44C, имеющим метку Flag на N-конце, и белком Flag-V_H-G44C-Flag, имеющим метку Flag на N-конце и С-конце, увеличивается в присутствии метки Flag.

Фиг. 6 показывает сравнение выходов экспрессии и очистки рекомбинантных белков с присутствием и отсутствием сортазы и присутствием и отсутствием Flag.

Фиг. 7 является схематическим видом, показывающим способ анализа связи V_H-V_L различным типом спаривания.

Фиг. 8 показывает результаты ELISA анализа спаривания V_H-V_L.

Фиг. 9 показывает результаты ELISA анализа спаривания Flag-V_H и Flag-V_L.

Фиг. 10 показывает результаты SDS-PAGE (ДСН-ПААГ) пары V_H-V_L, в которой введены мутации на цистеин.

Фиг. 11 показывает результаты SDS-PAGE, показывающие, что спаривание Flag-V_H и Flag-V_L увеличивает спаривание V_H и V_L.

Фиг. 12 показывает результаты SEC-HPLC V_L-IAALK3, Flag-V_H-IAALE3-Flag и собранного Fv.

Фиг. 13 показывает результаты MALDI-TOF анализа V_L, V_H и собранного Fv дикого типа.

Фиг. 14 показывает результаты анализа MALDI-TOF V_L-Q100C, Flag-V_H-G44C-Flag и собранного Fv.

Фиг. 15 показывает результаты MALDI-TOF анализа V_L-IAALK3, Flag-V_H-IAALE3-Flag и собранного Fv.

Фиг. 16 показывает результаты анализа действия антитела 4D5 Fv на пролиферацию клеток ВТ-47 посредством анализа CCK8 (Dojjindo).

Фиг. 17 показывает результаты мониторинга профилей связывания 4D5 IgG, V_H домена, V_L домена и собранных антител Fv c поверхностью Her2-экспрессирующих клеток ВТ-474 посредством FACS.

Фиг. 18 показывает схему отбора V_H CDR3 и V_L CDR3 для схемы CDR в соответствии с распределением длины аминокислотного остатка.

Фиг. 19 показывает результаты анализа высокой частоты для введения разнообразия V_H CDR и V_L CDR.

Фиг. 20 показывает результаты построения библиотеки, имеющей разнообразие в соответствии с примером данного изобретения.

Фиг. 21 показывает результаты анализа SEC-HPLC 25 Fv, сконструированных объединением 5 V_H с 5 V_L.

Фиг. 22 показывает результаты FACS и анализа SEC-HPLC собранных Fv, приготовленных объединением 4D5 V_H с 5 синтетическими V_L.

Фиг. 23 показывает процесс скрининга библиотек.

Фиг. 24 показывает результаты скрининга взаимодействий между индивидуальными Fv и 10 смешанными антигенами посредством альфа-анализа.

Фиг. 25 показывает результаты скрининга взаимодействий между связыванием Fv со смешанными антигенами и индивидуальными антигенами во второй стадии скрининга.

Фиг. 26 является графиком, показывающим результаты альфа-анализа на Fv, которые связываются в основном с CSF1R.

Фиг. 27 показывает результаты ELISA для взаимодействия Fv, для которых в альфа-анализе было подтверждено, что они в основном связываются с CSF1R.

Фиг. 28 показывает результаты Вестерн-блоттинга для взаимодействия Fv, для которых в альфа-анализе было подтверждено, что они в основном связываются с CSF1R.

Фиг. 29 является графиком, показывающим результаты альфа-анализа для Fv, которые связываются в основном с с-МЕТ.

Фиг. 30 показывает результаты ELISA для взаимодействия Fv, для которых в альфа-анализе было подтверждено, что они в основном связываются с с-МЕТ.

Фиг. 31 показывает результаты Вестерн-блоттинга для взаимодействия Fv, для которых в альфа-анализе было подтверждено, что они в основном связываются с с-МЕТ.

Наилучший способ осуществления данного изобретения

В данном контексте термин "библиотека Fv (вариабельных фрагментов)" относится к коллекции некоторого количества разнообразных Fv. В данном контексте термин "Fv (вариабельный фрагмент)" относится к минимальному фрагменту антитела, который является частью Fab (антигенсвязывающий фрагмент) области этого антитела, который состоит из вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и вариабельной области легкой цепи (V_L). Для целей данного изобретения эта библиотека Fv (вариабельных фрагментов) может быть библиотекой Fv, основанной на комбинировании белков.

Известные библиотеки конструировали путем объединения антител на уровне ДНК для получения репертуара генов антител, которые лежат в основе разнообразия антител. Обычно антитела продуцируются В-лимфоцитами, и один В-лимфоцит продуцирует только один тип антитела. Известно, что в теле человека существуют множество В-лимфоцитов, и каждый В-лимфоцит экспрессирует на клеточной мембране антитело, имеющее уникальную специфичность связывания антигена. Кроме того, известно, что в теле человека существует антигенсвязывающее разнообразие приблизительно 10⁸. Таким образом, разнообразие антител в теле человека составляет нескольких сотен миллионов. Для образования репертуара, который является таким разнообразием антител, должна быть сконструирована комбинация нескольких сотен миллионов ДНК, и из них должны быть приготовлены антитела. Например, когда должна быть сконструирована библиотека, имеющая разнообразие 10⁸, должны быть синтезированы 100,000,000 ДНК и должны быть выполнены 100000000 очисток белков для конструирования библиотеки выделенных антител, но это является фактически невозможным. Однако, в соответствии с данным изобретением, библиотека Fv, содержащая специально адресованные антитела, может быть сконструирована экспрессией и очисткой 10000 V_H доменов и 10000 V_L доменов, то есть экспрессией и очисткой только 20000 доменов. Этот способ конструирования библиотеки Fv, основанный на комбинировании белков, был впервые разработан авторами данного изобретения. Предложенный способ конструирования библиотеки Fv, основанный на комбинировании белков, характеризуется тем, что библиотека Fv, содержащая желаемые комбинации белков, может быть сконструирована спариванием очищенных доменов V_H и доменов V_L вне клеток, а не внутри клеток.

Предпочтительно, библиотека Fv делает возможным функциональный анализ ее индивидуальных членов.

Предпочтительно, функциональный анализ индивидуальных членов может содержать, или, более предпочтительно, может не содержать стадию предварительного скрининга, основанную на связывании с мишенью.

Как описано выше, обычные библиотеки являются библиотеками на основе ДНК. В этом случае экспрессия из ДНК и выделение белков антител требуют множества процессов экспрессии и очистки, и, следовательно, эти антитела не разделяются индивидуально в этой библиотеке, но смешиваются вместе в ней. По этой причине требуется стадия выделения и очистки белков для анализа функции этих антител. Однако, как описано выше, эта стадия является практически неосуществимой. По этой причине антитела сначала подвергают скринингу на основе их связывания с веществом-мишенью, таким как антиген, и затем только антитела, связанные с этим веществом-мишенью, испытывают на их функцию во второй стадии скрининга. Однако, когда антитела скринируют на основе их связывания с последовательностью-мишенью, как описано выше, антитело, имеющее желаемую функцию, может в результате отсутствовать. Однако члены библиотеки Fv данного изобретения могут быть индивидуально разделены и, следовательно, могут быть индивидуально проанализированы без предварительной стадии скрининга на основе связывания с мишенью. Соответственно с библиотекой Fv данного изобретения антитела Fv, имеющие практическую функцию, могут быть не упущены и выявлены скринингом.

Для цели данного изобретения библиотека Fv может быть библиотекой Fv, включающей в себя домены V_H и домены V_L и сконструированной комбинированием белков домена вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и белков домена вариабельной области легкой цепи (V_L), но также могут включать иные антигенсвязывающие формы антител, в том числе СН-содержащие фрагменты, имеющие антигенсвязывающую способность (например, Fab', F(ab')2, Fab, Fv и rIgG), а также полноразмерные антитела. Также антитела могут включать рекомбинантные одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), бивалентные или биспецифические молекулы, диатела, триатела и тетратела. Эти бивалентные и биспецифические молекулы, например, описаны Kostelny et al. (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack and Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger et al. (1993, Supra), Gruber et al. (1994, J. Immunol., 5368), Zhu et al. (1997, Protein Sci., 6:781 et al.), Hu et al. (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams et al. (1993, Cancer Res., 53:4026) и McCartney et al. (1995, Protein Eng., 8:301).

Полноразмерные антитела включают IgA, IgD, IgE, IgM и IgG, и IgG, который подразделен на подтипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Fab содержит вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первый константный домен тяжелой цепи (СН1) и имеет один антигенсвязывающий сайт. Fab' отличается от Fab тем, что он содержит шарнирный район, включающий в себя по меньшей мере остаток цистеина С-концевой области домена СН1 тяжелой цепи. Антитело F(ab')₂ получается, когда остатки цистеина в шарнирном районе Fab' образуют дисульфидную связь.

Стадия (а) приготовления белков домена вариабельной области (V_H) тяжелой цепи и белков домена вариабельной области (V_L) легкой цепи могут быть предпочтительно выполнена с введением желаемого разнообразия в белок домена V_H и белок домена V_L. Введение разнообразия может быть выполнено любым известным способом мутации. Кроме того, белки домена V_H и белки домена V_L могут быть получены любым известным способом. Для конструирования библиотеки Fv, включающей в себя белки домена V_H и белки домена V_L, последовательности белков могут быть выбраны с использованием базы данных, включающей в себя все третичные структуры белков человека, такой как PDB (Protein Data Bank) и SCOP (Structural Classification of Protein). Кроме того, последовательности белков для конструирования этой библиотеки могут быть выбраны из различных баз данных, включающих известные последовательности белков человека или не человека, но объем данного изобретения не ограничивается ими. Кроме того, последовательности V_H и V_L могут быть выбраны из известных последовательностей вариабельных районов, таких как последовательности, доступные в базе данных Кабата (www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html) и базе данных NCBI (www.ncbi.nlm.nkh.gov), и из баз данных, таких как UniProt (www.ebi.uniprot.org) и PRF/SEQDB (www.prf.or.jp), для создания библиотеки последовательностей V_H и V_L. Кроме того, они могут быть дополнены коллекцией последовательностей V_H и V_L человека, полученных прямым секвенированием амплифицированной мРНК V_H и V_L из одного или нескольких доноров. Различные комбинации доменов могут быть рассмотрены для проектирования белков доменов V_H и V_L. При селекции последовательностей могут быть отобраны (известным способом) только последовательности доменов антител, исключая Т-клеточные рецепторы или другие Ig-последовательности. В одном примере воплощения данного изобретения, последовательности доменов антитела были отобраны с использованием программы HMMER в PISEC sever (Пример 6).

Белки домена V_H и белки домена V_L могут быть белками человека или белками не-человека.

Предпочтительно, может быть введена мутация в CDR (участки, определяющие комплементарность) белка домена V_H или белка домена V_L. Этот CDR может быть выбран из одного или нескольких из CDR1, CDR2 и CDR3. Предпочтительно, CDR может быть одним, двумя или тремя CDR, выбранными из CDR1, CDR2 и CDR3, но не ограничиваясь этим. Более предпочтительно, он может быть CDR3, но мутация может быть введена в любой CDR без ограничения, в зависимости от типа желаемого антитела. В одном примере данного изобретения разнообразие может быть изменено введением мутации в CDR3 при фиксированных CDR1 и CDR2 (Пример 8).

Предпочтительно, мутация может быть введена в каркасную последовательность в белке домена V_H или белке домена V_L.

Предпочтительно, спаривание белок-белок на стадии (b) - это случайное спаривание белков домена V_H и белков домена V_L, полученных на стадии (а), друг с другом, и может быть выбрано из группы, включающей: (i) спаривания между доменами дикого типа; (ii) спаривания за счет дисульфидных связей между цистеинами, вводимыми в белки доменов; (iii) спаривания слиянием между суперспиральными доменами; (iv) спаривания посредством взаимодействия белок-белок и (v) их комбинаций. Здесь, (i)-(iv) включают в себя без ограничения любой известный способ спаривания. Например, спаривание белок-белок может выполняться каждым из (i)-(iv) или комбинацией двух или более из (i)-(iv).

Предпочтительно, вариант (i) спаривания между доменами дикого типа может выполняться известным способом спаривания между белками домена V_H дикого типа и белками домена V_L дикого типа. В одном примере данного изобретения было подтверждено спаривание белков дикого типа (Экспериментальный Пример 2).

Предпочтительно, в варианте (ii) спаривания через дисульфидные связи между цистеинами цистеин может быть введен в каждый из белков домена V_H и белков домена V_L известным способом, так что белки домена V_H и белки домена V_L могут быть спарены посредством образования дисульфидных связей между цистеинами, введенными в них. В одном примере осуществления данного изобретения было подтверждено подобное бисульфидное связывание (спаривание) (Экспериментальные Примеры 1-4).

Предпочтительно, в варианте (iii) спаривание за счет слияния между доменами в виде суперспирали домен суперспирали может быть введен в каждый из белков домена V_H и белков домена V_L, так что белки домена V_H и белки домена V_L могут быть спарены друг с другом связью в виде суперспирали. Этот домен суперспирали может быть получен из известных баз данных и может быть получен с использованием способа, описанного Katja M. Arndt et al. (J. Mol. Biol. (2001) 312, 221-228). Кроме того, могут предпочтительно использоваться последовательности, описанные Jennifer R. et al. (J. Biol. Chem. (2002) 277, 37272-37279), J.R. Litowski (J. peptide Res. (2001) 58, 477-492), Jesus Fernandez-Rodriguez et al. (protein science(2012) 21, 511-591), Katja M. Arndt et al. (Structure(2002) 10, 1235-1248), Katja M. Arndt et al. (J. Biol. Chem. (2000) 295, 627-639), etc., но любые домены с суперспиралью, имеющие регулярность, могут быть использованы в данном изобретении. Домен суперспирали, который используют в данном изобретении, не ограничивается последовательностями, описанными в приведенных выше статьях. В одном примере осуществления данного изобретения было подтверждено спаривание суперспиралью (Экспериментальные Примеры 1-4).

Предпочтительно, вариант (iv) спаривания посредством белок-белковых взаимодействий предусматривает спаривание посредством известного взаимодействия белок-белок. Например, может быть использовано спаривание белок-белок, такое как лещиновая "молния", как у доменов JUN и FOS. Кроме того, могут быть использованы иные известные взаимодействия, в том числе нековалентное взаимодействие, сконструированный домен СН и сконструированная поверхность взаимодействия.

В одном варианте осуществления спаривание в стадии (b) может достигаться случайным спариванием или направленным спариванием.

Предпочтительно, этот способ конструирования библиотеки Fv на основе комбинирования белков может дополнительно содержать стадию (с) идентификации (ID) номеров, присваиваемых индивидуальным компартментам, в которых хранят желаемые собранные Fv.

Эти собранные Fv могут быть получены случайным спариванием или направленным спариванием. В случае направленного спаривания способ может предусматривать конструирование библиотеки таким образом, что домены V_H и домены V_L, информация о которых является известной, не перекрываются. Предпочтительно, в случае направленного спаривания этот способ может предусматривать спаривание известных V_H и V_L для получения собранных Fv, восстановление собранных Fv, хранение этих восстановленных Fv в индивидуальных компартментах с присвоенными номерами ID и подтверждение информации об этих доменах V_H и V_L в индивидуальных компартментах с присвоенными номерами ID.

Поскольку члены библиотеки Fv данного изобретения могут быть разделены индивидуально, данное изобретение может предоставить библиотеку с членами, которые могут храниться в индивидуальных компартментах. Эти индивидуальные компартменты с присвоенными номерами ID могут находиться в различных устройствах, таких как чашки, тест-пробирки, чипы и т.п., но не ограничивающихся ими. Кроме того, эти компартменты могут дополнительно включать в себя буфер, стабилизатор белка или т.п.

В другом аспекте, данное изобретение предусматривает способ выявления скринингом желаемого антитела Fv, причем этот способ включает стадии: (а) конструирования библиотеки Fv путем комбинирования белков в соответствии с вышеуказанным способом конструирования библиотеки Fv; и (b) выполнения индивидуального функционального анализа на желаемое свойство, характеристику или активность с использованием библиотеки Fv.

Способ конструирования библиотеки Fv является таким, как описанный выше.

Предпочтительно, этими желаемыми свойством, характеристикой или активностью могут быть пролиферация, дифференцировка клеток или смерть клеток.

Этими желаемыми свойством, характеристикой или активностью могут быть агрегация белок-белок, увеличенная стабильность белка, увеличенная растворимость белка, введение сайта гликозилирования, введение сайта конъюгации, уменьшение иммуногенности, увеличение экспрессии белка, увеличение аффинности к антигену, уменьшение аффинности к антигену, изменение аффинности связывания, изменение иммуногенности или усиление специфичности, но не ограничивающиеся ими.

Предпочтительно, этот способ скрининга может дополнительно содержать стадию (с) определения идентификационного номера (ID) компартмента, в котором хранится желаемое антитело Fv.

Предпочтительно, способ скрининга может содержать стадии: (с) определение идентификационного номера (ID) компартмента, в котором хранится желаемое антитело Fv,; и (d) определение белка домена V_H и белка домена V_L антитела Fv из этого идентифицированного компартмента.

Если белок домена V_H и белок домена V_L антитела Fv идентифицированного компартмента идентифицированы, можно амплифицировать только желаемое антитело Fv, содержащее комбинацию белка домена V_H и белка V_L.

Предпочтительно, этот способ скрининга может дополнительно содержать стадии: (с) идентификации ID-номера компартмента, в котором хранится желаемое Fv; и (d) идентификации ДНК-последовательности антитела Fv.

Если антитело Fv из этого идентифицированного компартмента определено и последовательность ДНК или аминокислоты легко анализируется, может быть амплифицировано только желаемое антитело Fv.

В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает желаемое антитело Fv, которое отобрали этим способом скрининга.

В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает библиотеку Fv, основанную на комбинации белков, сконструированную способом конструирования библиотеки Fv, основанным на комбинировании белков.

Примеры

В дальнейшем данное изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Квалифицированному в данной области специалисту будет очевидно, что эти примеры приведены только для иллюстративных целей и не должны толковаться как ограничение объема предложенного изобретения. Соответственно, объем изобретения будет определяться прилагаемыми пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.

Пример 1. Получение экспрессирующего вектора

1-1: Приготовление ВАР-сортаза-LPETG-мишень (V_L)

Условия ПЦР, используемые в Примере 1 данного изобретения, являются следующими.

ПЦР-смесь состояла из 31,5 мкл дистиллированной воды, 10 мкл 5Х PrimeSTAR буфера, 5 мкл dNTP (2,5 мМ), 1 мкл прямого праймера (100 мкМ), 1 мкл обратного праймера (100 мкМ), 1 мкл матрицы (100 нг/мкл) и 0,5 мкл полимеразы PrimeSTAR (2,5 μ/мкл). ПЦР выполняли в течение 30 циклов, каждый из которых содержит нагревание до 98°С в течение 10 с и нагревание до 68°С в течение 1 мин, и продукт ПЦР хранили при 4°С.

В качестве матрицы синтезировали и использовали ВАР, сортазу и последовательность-мишень.

Используемые праймеры являются следующими.

Сначала ДНК-последовательность, кодирующую ВАР (пептид акцептора биотина), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 1_sfi (5'-ccgtggcccaggcggcc GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC АТС TTC GAG GCC-3': SEQ ID NO: 1) или праймера 1 (5'-ATGT CATATG GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC АТС TTC GAG GCC-3': SEQ ID NO: 2) и праймера 2 (5'-CTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT-3': SEQ ID NO: 3).

ДНК-последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислоты 60 - 206 SrtA (GenBank Accession No. AF162687), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 3 (5'-АТС GAG TGG САС GAA ATG CAG GCT AAG CCG CAG ATT CCG-3': SEQ ID NO: 4) и праймера 4 (5'-GCCGGTCTCGGGAAGCTTCTTGACCTCGGTAGCGACAAA-3': SEQ ID NO: 5).

Вторую ДНК-последовательность, кодирующую LPETG-мишень (V_L), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 5 (5'-CAG ТАА GCT ТСС CGA GAC CGG CGAT АТС CAG ATG ACT CAG AGC-3': SEQ ID NO: 6), праймера 6 (5'-ACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT-3': SEQ ID NO: 7) и матрицы-мишени (V_L).

Затем эти три ПЦР-продукта смешивали друг с другом и затем ДНК-последовательность, кодирующую слитый белок BAP-SrtA-kLPETG-target (V_L), имеющий сайт HindIII между SrtAc-LPETG и кодирующей мишень последовательностью, амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 1_sfi или праймера 1 и праймера 7 (5'-taat ggccggcctggcc GC GGC CGC TTAAAGATCTTCTTCACTAATTAACTT-3': SEQ ID NO: 8).

Полученный ДНК-фрагмент расщепляли NdeI и NotI, лигировали в вектор рЕТ23а vector (Novagen), расщепляли SfiI и затем лигировали в вектор pCom3x, который экспрессирует слитый белок ВАР-сортаза-LPETG-мишень.

1-2: Получение мишени (V_L)-kLPETG-другой линкер-Сортаза-Н10

ДНК-последовательность, кодирующую мишень-LPETG-линкер (7 а.к.), где связанный линкер (7 а.к.) представлен (GGSSRSS: SEQ ID NO: 9), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 8 (5'-ATGT CATATG GAC ATT CAG ATG АСА CAG AGT-3': SEQ ID NO: 12) и праймера 9 (5'-ggaaccaccgccggtctcgggaagAAGATCTTCTTCACTAATTAAC-3': SEQ ID NO: 13).

С использованием праймера 8, праймера 10 (5'-GGA AGA ТСТ AGA GGA АСС АСС ССС АСС АСС GCC CGA GCC АСС GCC АСС GGA TGA GCC GGT СТС GGG AAG AAG АТ-3': SEQ ID NO: 14) и продукта ПЦР мишень-LPETG-линкер (7 а.к.) ДНК-последовательность, кодирующую мишень-LPETG-линкер (18 а.к.), связанный с линкером (18 а.к.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSS: SEQ ID NO: 10), амплифицировали посредством ПЦР.

ДНК-последовательность, кодирующую линкер (7 a.к.)-SrtA (60-206), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 11 (5'-gag acc ggc ggt ggt tcc tct aga tct tcc cag gct aag ccg cag att-3': SEQ ED NO: 15) и праймера 12 (5'-taat GC GGC CGC tta atgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3': SEQ ID NO: 16).

ДНК-последовательность, кодирующую линкер (18 a.к.)-SrtA (60-206), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 13 (5'-gtggttcctctagatcttcc tcg aag gtc gcg gga tat att-3': SEQ ID NO: 17) и праймера 14 (5'-taat ggccggcctggcc tta atgatggtgatggtgatgatgatgatggc-3': SEQ ID NO: 18).

ДНК-последовательность, кодирующую линкер (20 а.к.)-SrtA (60-206), связанный с линкером (20 а.к.) (SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS: SEQ ID NO: 11), амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймера 15 (5'-ggt tcc tct aga tct tcc gga agc cag gct aag ccg cag att-3': SEQ ID NO: 19) и праймера 14.

Наконец, мишень (VL)-LPETG-Линкер (7 а.к.)-Sortase-H10 (фиг. 1Α) амплифицировали перекрывающейся ПЦР с использованием праймера 8, праймера 12 и смеси ПЦР-продуктов (мишень-LPETG-линкера (7 а.к.) и линкера (7 а.к.)-SrtA).

Один ген, кодирующий мишень-(VL)-LPETG-линкер (18 а.к.)-Сортаза-Н10 (фиг. 1В), амплифицировали перекрывающейся ПЦР с использованием праймера 8, праймера 14 и смеси ПЦР-продуктов (мишень-LPETG-линкер (18 а.к.) и линкер (18 а.к.)-SrtA).

Ген, кодирующий мишень-(VL)-LPETG-линкер (20 а.к.)-Сортаза-Н10 (фиг. 1С), амплифицировали перекрывающейся ПЦР с использованием праймера 8, праймера 14 и смеси ПЦР-продуктов (мишень-LPETG-линкер (18 а.к.) и линкер (20 а.к.)-SrtA).

Каждый из полученных ДНК-фрагментов рас