Растения сои, устойчивой к гербицидам, и способы их идентификации

Растения сои, устойчивой к гербицидам, и способы их идентификации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет согласно предварительной заявке на патент США No 61/367251, поданной 23 июля 2010 г.; предварительной заявке на патент США No 61/263707, поданной 23 ноября 2009 г.; и предварительной заявке на европейский патент No EP 09014565.7, поданной 23 ноября 2009 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, растительному материалу и семенам сои, характеризующимся содержанием по меньшей мере двух специфических трансформационных событий, в частности, присутствием по меньшей мере двух наборов генов, кодирующих белки, придающие устойчивость к гербицидам, каждый из которых характеризуется специфическим положением в геноме сои. Растения сои, согласно изобретению, объединяют фенотип устойчивости к гербицидам с агрономической продуктивностью, генетической стабильностью и функциональностью в различном генетическом окружении, эквивалентными нетрансформированной линии сои при отсутствии гербицида(ов). Кроме того, настоящее изобретение представляет способы и наборы для идентификации присутствия растительного материала, включающего специализированные трансформационные события EE-GM3 и EE-GM2 или EE-GM1, в биологических образцах.

Уровень техники

Фенотипическая экспрессия трансгена в растениях определяется как структурой гена или генов самих по себе, так и его или их положением в геноме растения. В то же время присутствие трансгенов или "чужеродной ДНК" по различным положениям в пределах генома различными путями влияет на общий фенотип растения. Агрономически или промышленно успешное внедрение путем генетической манипуляции в организм растения признака, представляющего интерес с коммерческой точки зрения, в зависимости от различных факторов, может представлять собой продолжительную процедуру. Фактическая трансформация и регенерация генетически трансформированного растения является лишь первым этапом селекции, которая включает расширенное исследование генетических характеристик, скрещивание и полевые испытания, в конечном итоге приводящие к селекции элитного события.

Важность однозначной идентификации элитного события возрастает в свете обсуждения новых пищевых продуктов/кормов, разделения продуктов на основе генетически модифицированных и немодифицированных организмов и идентификации патентованных материалов. В идеале такой способ идентификации является как быстрым, так и простым, не требующим масштабного лабораторного оборудования. Кроме того, этот способ должен обеспечивать результаты, позволяющие однозначно определить элитное событие без экспертной интерпретации, однако, при необходимости, выдерживающие экспертную оценку. Специализированные инструменты для идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM1 или EE-GM2 в биологических образцах описаны в настоящей заявке.

В настоящем изобретении EE-GM3 идентифицировали как элитное событие из популяции трансгенных растений сои при разработке сои культурной (Glycine max), устойчивой к гербицидам, включающей ген, кодирующий устойчивость к глифосату, в комбинации с геном, придающим устойчивость к ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), каждый из которых находится под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.

EE-GM1 и EE-GM2 ранее идентифицировали как элитные события из популяции трансгенных растений сои при разработке сои культурной (Glycine max), устойчивой к гербицидам, включающей ген, кодирующий устойчивость к глюфосинату, находящийся под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке, и описали в заявках W02006/108674 и W02006/108675 (обе публикации включены в настоящий документ посредством ссылки).

В литературе описаны растения сои, содержащие ген устойчивости к гербицидам. Однако, ни одна из известных публикаций не сообщает о настоящем изобретении.

В данной области техники известно, что получение коммерческого элитного трансформационного события устойчивых к гербицидам растений сои, обладающих приемлемой агрономической продуктивностью без ухудшения урожайности и достаточной устойчивостью к гербицидам трех различных классов, является далеко не простой задачей.

В действительности, сообщалось, что первое событие сои (событие 40-3-2), поступившее на рынок как устойчивое к гербицидам, характеризовалось значительным ухудшением урожайности по сравнению с изогенными или приблизительно изогенными линиями (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412).

Кроме того, была выведена соя Optimum™GAT™ (событие 356043), объединявшая свойства устойчивости к глифосату с устойчивостью к гербицидам, действующим на ацетолактатсинтазу, однако, сообщалось, что эта соя сама по себе не соответствовала стандартам устойчивости к глифосату (вне комбинации с другим событием устойчивости сои к глифосату (например, событием 40-3-2) (см., например, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сои или их семенам, клеткам и тканям, содержащим стабильно интегрированную в их геном экспрессионную кассету, включающую ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность гена 2mEPSPS, и еще один ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность HPPD-PF W336 (в соответствии с описанием в Примере 1.1 настоящей заявки и как представлено в SEQ ID No 1), а также вторую экспрессионную кассету, включающую ген устойчивости к гербициду, содержащий кодирующую последовательность фосфинотрицинацетилтрансферазы согласно описанию в Примере 1 настоящей заявки и как представлено в SEQ ID No 11. Трансгенные растения сои или их семена, клетки или ткани устойчивы к гербицидам на основе глифосата, глюфосината и гербициду-ингибитору HPPD, например, изоксафлютолу, а при отсутствии гербицидов - обладают агрономической продуктивностью, в значительной степени эквивалентной продуктивности нетрансгенной изогенной линии. После применения одного или более гербицидов, к которым растение обладает устойчивостью, оно демонстрирует агрономический фенотип, превосходящий фенотип нетрансгенного растения.

Согласно настоящему изобретению растения сои или их семена, клетки или ткани содержат элитное событие EE-GM3 и EE-GM1 или EE-GM3 и EE-GM2.

В частности, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сои, их семенам, клеткам или тканям, геномная ДНК которых характеризуется тем, что ее анализ, согласно протоколу ПЦР-идентификации, как описано здесь, с использованием двух праймеров к 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3 и чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам в EE-GM-3, соответственно, обнаруживает фрагмент, специфический для EE-GM3, и, кроме того, анализ, согласно протоколу ПЦР-идентификации, как описано здесь, с использованием двух праймеров к 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM1 или EE-GM2 и чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к глюфосинату, соответственно, обнаруживает фрагмент, специфический для EE-GM1 или EE-GM2. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM3 могут являться 5’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 2 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM3, например, праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 5 и SEQ ID No: 4 или SEQ ID No: 7, соответственно, также могут являться 3’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 3 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно, и праймеры обнаруживают фрагмент ДНК размером от 100 до 800 п.о., например, фрагмент размером приблизительно 263 п.о. или приблизительно 706 п.о. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM1 могут являться 5’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 12 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM1, например, праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, соответственно, также могут являться 3’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 13 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно, и праймеры обнаруживают фрагмент ДНК размером от 100 до 500 п.о., например, фрагмент размером приблизительно 183 п.о. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM2 могут являться 5’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 14 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно. Мишенью праймеров для обнаружения EE-GM2, например, праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 18 и SEQ ID No: 19, соответственно, также могут являться 3’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 15 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно, при этом праймеры обнаруживают фрагмент ДНК размером от 100 до 500 п.о., например, фрагмент размером приблизительно 151 п.о.

Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM3, согласно изобретению, депонированы в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659. Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM1, согласно изобретению, депонированы в NCIMB под номером доступа NCIMB 41658. Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM2, согласно изобретению, депонированы в NCIMB под номером доступа NCIMB 41660. Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM3 и EE-GM1, были депонированы в АТСС под номером доступа РТА-11041. Эталонные семена, содержащие элитное событие EE-GM3 и EE-GM2, были депонированы в АТСС под номером доступа РТА-11042.

Один из вариантов воплощения изобретения представляет собой семена, содержащие элитное событие EE-GM3 (эталонные семена, содержащие указанное событие и депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659), и, кроме того, содержащие элитное событие EE-GM1 (эталонные семена, содержащие указанное событие и депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41658), или семена, содержащие событие EE-GM3 и EE-GM1 (эталонные семена, содержащие указанные события и депонированные в АТСС под номером доступа РТА-11041), которые вырастают в растения сои, устойчивые по меньшей мере к трем гербицидам, в частности, устойчивые к глифосату и/или ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу и/или ингибиторам глутаминсинтазы, например, глюфосинату.

Еще один из вариантов воплощения изобретения представляет собой семена, содержащие элитное событие EE-GM3 (эталонные семена, содержащие указанное событие и депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659), и, кроме того, содержащие элитное событие EE-GM2 (эталонные семена, содержащие указанное событие и депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41660), или семена, содержащие событие EE-GM3 и EE-GM2 (эталонные семена, содержащие указанные события и депонированные в АТСС под номером доступа РТА-11042), которые вырастают в растения сои, устойчивые по меньшей мере к трем гербицидам, в частности, устойчивые к глифосату и/или ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу и/или ингибиторам глутаминсинтазы, например, глюфосинату.

Семена, депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659, представляют собой партию семян, состоящую по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, содержащих элитное событие EE-GM3, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глифосату и/или изоксафлютолу. Семена или потомство семян, получаемые или полученные из депонированных семян (например, после скрещивания с другими растениями сои с другим генетическим окружением), можно высеять и обработать растущие растения глифосатом или ингибиторами HPPD, например, изоксафлютолом, как описано здесь, получая растения, устойчивые к глифосату или изоксафлютолу, содержащие элитное событие EE-GM3. Семена, депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41658 и NCIMB 41660, представляют собой партии семян, состоящие по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, содержащих элитные события EE-GM1 или EE-GM2, соответственно, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глтофосинату. Эти семена можно высеять и обработать растущие растения глюфосинатом, получая растения, устойчивые к глюфосинату, содержащие элитные события EE-GM1 или EE-GM2.

Семена, депонированные в АТСС под номером доступа РТА-11041, представляют собой партию семян, состоящую по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, содержащих элитное событие EE-GM3 и элитное событие EE-GM1 в гомозиготной форме, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глифосату, глюфосинату и/или изоксафлютолу. Семена или потомство семян, получаемые или полученные из депонированных семян (например, после скрещивания с другими растениями сои с другим генетическим окружением), можно высеять и обработать растущие растения глифосатом, глюфосинатом или ингибиторами HPPD, например, изоксафлютолом, как описано здесь, получая растения, устойчивые к глифосату, глюфосинату или изоксафлютолу, содержащие элитное событие EE-GM3 и EE-GM1.

Семена, депонированные в АТСС под номером доступа РТА-11042, представляют собой партию семян, состоящую по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, содержащих элитное событие EE-GM3 и элитное событие EE-GM2 в гомозиготной форме, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глифосату, глюфосинату и/или изоксафлютолу. Семена или потомство семян, получаемые или полученные из депонированных семян (например, после скрещивания с другими растениями сои с другим генетическим окружением), можно высеять и обработать растущие растения глифосатом, глюфосинатом или ингибиторами HPPD, например, изоксафлютолом, как описано здесь, получая растения, устойчивые к глифосату, глюфосинату или изоксафлютолу, содержащие элитное событие EE-GM3 и EE-GM2.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к клеткам, тканям и потомству растения, содержащего элитное событие EE-GM3 и, кроме того, содержащего элитное событие EE-GM1, которые можно получить путем выращивания растения, содержащего элитное событие EE-GM3 и EE-GM1, депонированного в АТСС как РТА-11041, или выращивания растения, содержащего элитное событие EE-GM3, из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659, и скрещивания указанного растения с растением, содержащим элитное событие EE-GM1, выращенным из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41658. Настоящее изобретение также относится к клеткам, тканям и потомству растения, содержащего элитное событие EE-GM3 и, кроме того, содержащего элитное событие EE-GM2, которые можно получить путем выращивания растения, содержащего элитное событие EE-GM3 и EE-GM2, депонированного в АТСС как РТА-11042, или выращивания растения, содержащего элитное событие EE-GM3, из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659, и скрещивания указанного растения с растением, содержащим элитное событие EE-GM2, выращенным из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41660. Настоящее изобретение, кроме того, относится к растениям, которые можно получить из (например, путем размножения и/или скрещивания с) растения или семени сои согласно описанию непосредственно перед этим. Настоящее изобретение также относится к растениям сои, содержащим элитное событие EE-GM3 и EE-GM1 или EE-GM3 и EE-GM2.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации трансгенного растения или его клеток, или тканей, содержащих элитное событие EE-GM3 и EE-GM1 или EE-GM3 и EE-GM2, основанному на идентификации присутствия характерных последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей, кодируемых такими последовательностями ДНК трансгенного растения, клеток или тканей. Согласно предпочтительному варианту воплощения настоящего изобретения такие характерные последовательности ДНК представляют собой последовательности длиной по меньшей мере 15 п.о., 15 п.о., по меньшей мере 20 п.о., 20 п.о. или 30 п.о., или более, содержащие сайты инсерции события, т.е. как фрагмент вставленной чужеродной ДНК, содержащей гены устойчивости к гербицидам, так и фрагмент генома сои (5’- или 3’-фланкирующую область), состыкованные друг с другом, что дает возможность специфической идентификации элитного события.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM 1 или элитных событий EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, способам, основанным на использовании праймеров или зондов, специфически распознающих 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3 и EE-GM1 или EE-GM3 и EE-GM2, включающей гены устойчивости к гербицидам.

В частности, настоящее изобретение относится к способу, включающему амплификацию двух нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологических образцах, с помощью двух полимеразных цепных реакций и по меньшей мере четырех праймеров, причем первый праймер распознает 5'- или 3'-фланкирующую область чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, второй праймер распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, третий праймер распознает 5’- или 3’-фланкирующую область чужеродной ДНК в EE-GM1 или EE-GM2, включающей гены устойчивости к гербицидам, а четвертый праймер распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM1 или EE-GM2, включающей гены устойчивости к гербицидам, предпочтительно для получения двух фрагментов ДНК размером между 100 и 800 п.о. Праймеры для идентификации EE-GM3 могут распознавать последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM3 (SEQ ID No 2, от положения 1 до положения 1451) или в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM3 (комплементарную SEQ ID No 3 от положения 241 до положения 1408) и последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам (комплементарную SEQ ID No 2 от положения 1452 до 1843 или SEQ ID No 3 от положения 1 до положения 240, или SEQ ID No 20 от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарную цепь), соответственно. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область, может включать нуклеотиднуто последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No: 7, описанные здесь. Праймеры для идентификации EE-GM1 могут распознавать последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM1 (SEQ ID No 12, от положения 1 до положения 209) или в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM1 (комплементарную SEQ ID No 13 от положения 569 до положения 1000) и последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей ген устойчивости к гербициду EE-GM1 (комплементарную SEQ ID No 12 от положения 210 до положения 720 или SEQ ID No 13 от положения 1 до положения 568), соответственно. Праймер, распознающий 5’-фланкирующую область EE-GM1, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 16, а праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК EE-GM1, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No: 17, описанную здесь. Праймеры для идентификации EE-GM2 могут распознавать последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM2 (SEQ ID No 14, от положения 1 до положения 311) или в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM2 (комплементарную SEQ ID No 15 от положения 508 до положения 1880) и последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей ген устойчивости к гербициду EE-GM1 (комплементарную SEQ ID No 14 от положения 312 до положения 810 или SEQ ID No 15 от положения 1 до положения 507), соответственно. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область EE-GM2, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 18, а праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК EE-GM2, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 19, описанную здесь. ПЦР-амплификацию можно выполнять одновременно или последовательно.

В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации элитного события EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах, причем этот способ включает амплификацию по меньшей мере двух нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 263 п.о., либо два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 7, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 706 п.о., и полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 16 и SEQ ID No 17, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 183 п.о. Эти две полимеразные цепные реакции можно осуществлять одновременно или последовательно.

В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации элитного события EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, причем этот способ включает амплификацию по меньшей мере двух нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 263 п.о., либо два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 7, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 706 п.о., и полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 18 и SEQ ID No 19, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 151 п.о. Эти две полимеразные цепные реакции можно осуществлять одновременно или последовательно.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к специфическим фланкирующим последовательностям EE-GM3, описанным здесь, в комбинации со специфическими фланкирующими последовательностями EE-GM1, которые можно использовать для разработки специфических способов идентификации одновременного присутствия EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах. Такие комбинированные специфические фланкирующие последовательности также можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации. В частности, настоящее изобретение относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3 в комбинации с 5’- и/или 3’-фланкирующими областями EE-GM1, которые можно использовать для разработки специфических праймеров и зондов, как описано далее здесь. Кроме того, в качестве эталонного материала можно использовать молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно, длиной приблизительно 150-850 п.о., включающие последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 7 и SEQ ID No 5 или SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, в комбинации с молекулами нуклеиновых кислот, включающими последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 16 и SEQ ID No 17; в частности, такие молекулы нуклеиновых кислот получают при использовании таких праймеров в материале, включающем EE-GM3 и EE-GM1.

Настоящее изобретение, кроме того, также относится к специфическим фланкирующим последовательностям EE-GM3, описанным здесь, в комбинации со специфической фланкирующей последовательностью EE-GM2, которые можно использовать для разработки специфических способов идентификации одновременного присутствия EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах. Такие комбинированные специфические фланкирующие последовательности также можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации. А именно, настоящее изобретение относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3 в комбинации с 5’- и/или 3’-фланкирующими областями EE-GM2, которые можно использовать для разработки специфических праймеров и зондов согласно дальнейшему описанию здесь. Кроме того, в качестве эталонного материала можно использовать молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно, длиной приблизительно 150-850 п.о., включающие последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 7 и SEQ ID No 5 или SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, в комбинации с молекулами нуклеиновых кислот, включающими последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 18 и SEQ ID No 19; в частности, такие молекулы нуклеиновых кислот получают при использовании таких праймеров в материале, включающем EE-GM3 и EE-GM2.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации одновременного присутствия EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах, основанным на использовании таких специфических праймеров или зондов. Праймеры для обнаружения EE-GM3 могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, в комбинации с праймерами, включающими, состоящими из или главным образом состоящими из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 1, например, нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Праймеры для обнаружения EE-GM1 могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 12, от нуклеотида 1 до нуклеотида 209, или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID 13, от нуклеотида 569 до нуклеотида 1000, в комбинации с праймерами, включающими, состоящими из или главным образом состоящими из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 11, например, нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 12, от нуклеотида 219 до нуклеотида 720, или нуклеотидной последовательности SEQ ID No 13, от нуклеотида 1 до нуклеотида 568. Праймеры также могут включать указанные нуклеотидные последовательности, расположенные непосредственно на их 3’-конце, и, кроме того, включать неродственные последовательности или последовательности, являющиеся производными упомянутых нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствия.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации одновременного присутствия EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, основанным на использовании таких специфических праймеров или зондов. Праймеры для обнаружения EE-GM3 могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов согласно описанию в предыдущем абзаце. Праймеры для обнаружения EE-GM2 могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 14, от нуклеотида 1 до нуклеотида 311, или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 15, от нуклеотида 508 до нуклеотида 1880, в комбинации с праймерами, включающими, состоящими из или главным образом состоящими из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 11, например, нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 14, от нуклеотида 312 до нуклеотида 810, или нуклеотидной последовательности SEQ ID No 15, от нуклеотида 1 до нуклеотида 507. Праймеры также могут включать указанные нуклеотидные последовательности, расположенные непосредственно на их 3’-конце, и, кроме того, включать неродственные последовательности или последовательности, являющиеся производными упомянутых нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствия.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам для идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах, включающим по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, и по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM1, включающей гены устойчивости к гербицидам.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам для идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, включающим по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в ЕЕ-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, и по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в ЕЕ-GM2, включающей ген устойчивости к гербициду.

Наборы, согласно изобретению, могут включать, кроме праймера, специфически распознающего 5’- или 3’-фланкирующую последовательность EE-GM3 и 5’- или 3’-фланкирующую последовательность ЕЕ-GM1, дополнительный праймер, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, и дополнительный праймер, специфически распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM1, включающей гены устойчивости к гербицидам, для использования согласно протоколу ПЦР-идентификации.

Наборы, согласно изобретению, могут также включать, кроме праймера, специфически распознающего 5’- или 3’-фланкирующую последовательность EE-GM3 и 5’- или 3’-фланкирующую последовательность EE-GM2, дополнительный праймер, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, и дополнительный праймер, специфически распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM2, включающей гены устойчивости к гербицидам, для использования согласно протоколу ПЦР-идентификации.

Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область EE-GM3, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий трансгены чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или 7, либо любой другой праймер или комбинация праймеров для обнаружения EE-GM3, как описано здесь, в комбинации с праймером, распознающим 5’-фланкирующую область EE-GM1, который может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 16, и праймером, распознающим трансгены чужеродной ДНК в EE-GM1, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 17.

Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область EE-GM3, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий трансгены чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или 7, либо любой другой праймер или комбинация праймеров для обнаружения EE-GM3, как описано здесь, в комбинации с праймером, распознающим 5’-фланкирующую область в EE-GM2, который может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 18, и праймером, распознающим трансгены чужеродной ДНК в EE-GM2, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 19.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору для идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах, включающим праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 4, и праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 16 и SEQ ID No 17, для использования при идентификации EE-GM3/EE-GM1 на основе ПЦР.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору для идентификации элитных событий EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, включающим праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 4, и праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 18 и SEQ ID No 19, для использования при идентификации EE-GM3/EE-GM2 на основе ПЦР.

Настоящее изобретение также относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 и EE-GM1 в биологических образцах, включающему два специфических зонда, первый из которых включает или состоит (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM3, а второй включает или состоит (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM1. В предпочтительном случае последовательность первого зонда соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3, а второй зонд соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM1. В наиболее предпочтительном случае ЕЕ-СМ3-специфичный зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 1441-1462 SEQ ID No 2, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 220-260 ID No 3, a EE-GM1-специфичный зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 199-220 SEQ ID No 12, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 558-579 SEQ ID No 13.

Настоящее изобретение также относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 и EE-GM2 в биологических образцах, включающему два специфических зонда, первый из которых включает или состоит (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM3, а второй включает или состоит (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM2. В предпочтительном случае последовательность первого зонда соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3, а второй зонд соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM2. В наиболее предпочтительном случае ЕЕ-ОМ3-специфичный зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 1441-1462 SEQ ID No 2, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 220-260 ID No 3, а ЕЕ-СМ2-специфичный зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 301-322 SEQ ID No 14, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеоти