Аналоги фактора комплемента в и их применения

Аналоги фактора комплемента в и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Система комплемента является компонентом врожденной и приобретенной иммунной системы (обзор приведен в Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2. In The Human Complement System in Health in Health and Disease. Edited by J. E. Volanakis, and M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32). Комплемент играет важную роль в уничтожении микробов и в транспорте и выведении иммунных комплексов. Множество продуктов активации системы коплемента ассоциированы также с провоспалительными или иммунорегуляторными функциями. Система коплемента состоит из ассоциированных с плазмой и мембраной белков, организованных в три каскада активации: классический, лектиновый и альтернативный пути (фигура 1). Все три пути могут приводить к формированию терминального комплекса комплемента (TCC) и ряда биологически активных продуктов.

В некоторых случаях, активация комплемента инициируется или посредством распознавания и связывания специфическими антителами множества патогенов и чужеродных молекул, и/или посредством прямого взаимодействия белков комплемента с чужеродными веществами. При активации, эти пути приводят к формированию комплексов протеаз, C3-конвертаз. C3-конвертаза классического пути, C4b2a, и C3-конвертаза альтернативного пути, C3bBb, обе являются способными расщеплять цепь C3, образуя C3b. C3b обладает способностью ковалентно связываться с биологическими поверхностями. Связывание C3b приводит к опсонизации для фагоцитоза полиморфноядерными клетками и макрофагами. Когда доступен дополнительный C3b, C3-конвертазы могут функционировать как C5-конвертазы, расщепляя C5 и инициируя сборку TCC, или мембраноатакующего комплекса (MAC), опосредующего клеточный лизис посредством вставки порообразующих белковых комплексов в мембраны клеток-мишеней.

В классическом пути, как показано на фигуре 1A, C1q, коллагеновый субкомпонент первого компонента (C1), связывается с иммуноглобулинами внутри иммунных комплексов, и ассоциированные с ним сериновые протеазы, C1r и C1s, становятся активированными. Этот каскад реакций комплемента инициируется последующим расщеплением C4 и C2, с последующей активацией C3. Полученный фрагмент C3b не только действует как опсонин, но также приводит к формированию мембраноатакующего комплекса (MAC) в литическом пути. Во врожденном иммунитете, комплекс, состоящий из узнающей молекулы (лектина) и сериновых протеаз, названный сериновой протеазой, ассоциированной со связывающим маннозу лектином (MBL) (MASP), активирует C4 и C2 при связывании с углеводами на поверхности микроорганизмов через лектиновый путь. Это связывание происходит в отсутствие иммуноглобулинов. Узнающие молекулы из лектинового пути, обнаруженные у челюстноротых позвоночных, представляют собой MBL и фиколины, которые оба характеризуются присутствием коллагеноподобного домена, подобно C1q, и связывающего углевод домена, обладающего общей специфичностью связывания для GlcNAc. MASP и C1r/C1s разделяют одинаковую доменную организацию и формируют подсемейство сериновых протеаз.

Лектиновый путь комплемента во врожденном иммунитете является близко родственным классическому пути активации комплемента в приобретенном иммунитете, например, по отношению к структурам и функциям их компонентов. Оба пути, как правило, инициируют комплексы, состоящие из коллагеновых белков и сериновых протеаз семейства ассоциированной со связывающим маннозу лектином (MBL) сериновой протеазы (MASP)/C1r/C1s. Выдвинуто предположение, что классический путь возник в ходе эволюции после лектинового пути.

Активация альтернативного пути комплемента, показанного на фигуре 1B, как правило, начинается со связывания белка C3b (или C3i) с клеткой и другими компонентами поверхности, например, микроорганизмов. C3b может также связываться с антителами иммуноглобулином G (IgG). Белок фактор B альтернативного пути затем объединяется с белком C3b с формированием C3bB. Затем белок фактор D расщепляет связанный белок фактор B на фрагменты Bb и Ba, образуя C3bBb. Затем пропердин связывается с Bb с образованием C3bBbP, который функционирует как C3 конвертаза, способная к ферментативному расщеплению, как правило, сотен молекул C3 на C3a и C3b. Некоторые из C3b затем связываются с некоторыми из C3bBb с образованием C3bBbC3b, C5 конвертазы, способной расщеплять молекулы C5 на C5a и C5b.

Поскольку C3b является свободным в плазме, он может связываться с поверхностью либо клетки-хозяина, либо патогена. Для предотвращения прохождения активации комплемента в клетке-хозяине, существует несколько различных видов регуляторных белков, нарушающих процесс активации комплемента. Рецептор комплемента 1 (CR1 или CD35) и DAF (известный также как CD55) конкурируют с фактором B за связывание с C3b на поверхности клеток и могут даже удалять Bb из уже сформированного комплекса C3bBb. Образование C3 конвертазы можно также предотвращать, когда протеаза плазмы, называемая фактором I, расщепляет C3b до его неактивной формы, iC3b. Фактор I действует со связывающими C3b белок кофакторами, такими как CR1 и мембранный кофактор протеолиза (MCP или CD46). Хотя регуляторным белком комплемента является фактор H, который либо конкурирует с фактором B, вытесняет Bb из конвертазы, действует как кофактор для фактора I, либо предпочтительно связывается с C3b, связанным с клетками позвоночных.

Точная функция системы комплемента зависит от ее регуляции, поскольку активация каскада реакций комплемента приводит к продукции ряда белков, вносящих вклад в воспаление. Это является преимущественным, когда вносит вклад в защиту хозяина, но может являться вредным, если активируется на собственной ткани. Как правило, активация C3 в крови поддерживается на низком уровне, и накопление C3b ограничено поверхностью патогенов.

Белок фактор комплемента B дикого типа человека представляет собой одноцепочечный гликопротеин из 764 аминокислот (приблизительно 93 кДа), состоящий из пяти доменов белка (Mole et al, 1984 The J. Biol Chem, 259:6, 3407-3412). Белок фактор комплемента B (fB) дикого типа человека, как правило, экспрессируется с N-концевым сигнальным пептидом из 25 аминокислот, например, см. SEQ ID NO:1. Аминоконцевая область (Ba) фактора комплемента B дикого типа человека состоит в первую очередь из трех коротких консенсусных повторов. Средняя область представляет собой домен типа A, сходный с доменами, обнаруженными в факторе фон Виллебранда (Colombatti et al., Blood (1991) 77(11):2305-15). Карбоксиконец представляет собой домен сериновой протеазы (SP) (Perkins and Smith, Biochem J. (1993) 295 (Pt 1): 109-14; Hourcade et al, JBC (1998) 273(40):25996-6000; Hourcade et al. J Immunol. (1999) 162(5):2906-11; Xu et al, J Biol Chem. 2000 275(1):378-85; Milder et al Nat Struct Mol Biol (2007) 14(3):224-8).

Аналоги фактора комплемента B и их использование для ингибирования комплемента и лечения опосредованных комплементом заболеваний описаны в Публикации PCT No. WO08/106644 и Публикации патента США No. US20100120665. Например, аналог белка фактора комплемента B, hfB3 (описанный в Публикации патента США No. 20100120665), представляет собой доминантный негативный вариант белка фактора B человека, который эффективно ингибирует альтернативную активность комплемента (AP). Белок hfB3 (SEQ ID NO:4) имеет пять замен аминокислот по сравнению с белком фактором B дикого типа человека (SEQ ID NO:1). Пять замен аминокислот позволяет белку hfB3 (i) более крепко связывать белок C3b, (ii) являться устойчивым к C3b-зависимому расщеплению белком фактором D, и (iii) более крепко связывать белок фактор D по сравнению с белком фактором B дикого типа. Более крепкое связывание белка hfB3 с белком C3b и белком фактором D разделяет два необходимых компонента альтернативного пути комплемента (ACP) на неактивную C3 конвертазу (hfB3), блокируя активность AP. Поскольку связанный с C3b белок hfB3 не может расщепляться белком фактором D, конформационного изменения белка hfB3 не происходит, и сериновая протеаза на C-конце белка hfB3 не активируется.

Как белок фактор комплемента B дикого типа человека, так и hfB3 содержат 23 аминокислоты цистеина. «Активные» формы обоих имеют все цистеины со сформированными дисульфидными связями с одним из других цистеинов, за исключением цистеина, соответствующего C292 SEQ ID NO:1. C292 «активных форм» hfB3 и фактора B дикого типа представляет собой свободный цистеин (Parkes et al. 1983 Biochem J. 213, 201-209) и является высоко консервативным среди различных видов млекопитающих, например, см. таблицу 1, ниже.

Цитирование или обсуждение ссылок в настоящем документе не следует рассматривать как допущение, что они являются предпосылками настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к полипептидам, содержащим аналог фактора комплемента B. Изобретение относится также к различным аналогам фактора комплемента B. В некоторых вариантах осуществления, аналог фактора комплемента B содержит мутацию свободной аминокислоты цистеина. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и вирусным векторам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды и аналоги белка фактора комплемента B по изобретению. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к клеткам, где клетки содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог белка фактора комплемента B по изобретению, и где клетки экспрессируют аналог белка фактора комплемента B.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим полипептид или аналог белка фактора комплемента B по изобретению, нуклеиновую кислоту по изобретению, вирусный вектор по изобретению или любую их комбинацию.

Настоящее изобретение относится также к способам лечения опосредованного комплементом заболевания, включающим в себя введение пациенту фармацевтического препарата по изобретению, полипептида по изобретению, аналога белка фактора комплемента B по изобретению, нуклеиновой кислоты по изобретению, вирусного вектора по изобретению или любой их комбинации.

Изобретение относится также к способам получения полипептида, содержащего аналог белка фактора комплемента B, где способ включает в себя: экспрессию в клетке аналога белка фактора комплемента B по изобретению и очистку указанного аналога белка фактора комплемента B.

Полипептиды по изобретению, аналоги фактора комплемента B по изобретению, и нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие их, можно использовать для модуляции пути комплемента и для исследования и/или лечения различных состояний или заболеваний, связанных с путем комплемента.

Изобретение основано на обнаружениях, что мутация или удаление свободного цистеина (i) улучшает выход активного и/или правильно свернутого аналога белка фактора комплемента B (например, см. примеры 9 и 10); (ii) улучшает термостабильность аналога белка фактора комплемента B (например, см. примеры 13 и 14); и/или (iii) снижает агрегацию аналога белка фактора комплемента B (например, см. пример 6).

Это краткое изложение сущности изобретения не обязательно описывает все признаки или необходимые признаки изобретения. Изобретение может также относиться к субкомбинации описанных признаков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

С целью иллюстрации изобретения, на фигурах изображены варианты осуществления изобретения. Однако, изобретение не является ограниченным точными организацией и средствами вариантов осуществления, изображенными на фигурах.

На фигуре 1A изображены классический и лектиновый пути комплемента. Классический путь инициируется посредством C1, в то время как лектиновый путь инициируется посредством связывающего маннозу лектина (MBL). C4bC2a представляет собой протеазу, расщепляющую C3 на C3a и C3b, и называемую C3 конвертазой. Подобным образом, C4bC2aC3b расщепляет C5 на C5a и C5b, и его называют C5 конвертазой. C3a, C4a и C5a обладают воспалительными свойствами и привлекают фагоцитирующие клетки. C5b6-9 формирует мембраноатакующий комплекс (MAC), который образует поры в мембране, которые убивают инфекционные агенты, но могут также повреждать клетки-хозяева. MASP представляет собой ассоциированную со связывающим маннан лектином сериновую протеазу.

На фигуре 1B изображен альтернативный путь комплемента. Этот путь является конститутивно активным на низком уровне посредством спонтанного расщепления C3. В присутствии подходящей поверхности, C3b связывается с фактором комплемента B (fB). Этот комплекс затем расщепляется фактором комплемента D (fD) с образованием C3bBb. Спонтанная диссоциация («разложение») этого комплекса в течение минут приводит к его инактивации, в то время как стабилизация пропердином образует комплекс, расщепляющий C3; то есть, C3 конвертазу. Несколько факторов, ослабляющих пути комплемента, осуществляют это посредством усиления разложения C3 и C5 конвертаз. C3b участвует в C3 конвертазе для получения дополнительного C3b, таким образом создавая петлю положительной обратной связи, как показано большой стрелкой. C3bBb представляет собой C3 конвертазу. C3bBbC3b представляет собой C5 конвертазу.

Фигура 2 представляет собой экспрессирующую конструкцию hfB3-292S. CMV - немедленный ранний промотор цитомегаловируса; IRES - внутренний участок связывания рибосомы; Neo - ген неомицин-фосфотрансферазы; SynPolyA - синтетический полиA; Amp - ген устойчивости к ампициллину. SEQ ID NO:8 представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессирующей конструкции hfB3-292S, показанной на фигуре 2.

На фигуре 3 показан анализ Вестерн-блоттингом неочищенных супернатантов культур клеток, содержащих белок либо hfB3, либо hfB3-292S после инкубации культуры клеток в течение 72 часов (2×10⁶ клеток/мл). Дорожка 1, один мкл среды культуры клеток от наивных нетрансфицированных клеток 293 FreeStyle, служащей отрицательным контролем; Дорожка 2, сто нанограмм фактора B дикого типа человека (Quidel, Santa Clara, CA), очищенного из плазмы, служащего положительным контролем; Дорожка 3, один мкл среды культуры клеток из продуцирующих hfB3 клеток; Дорожка 4, один мкл среды культуры клеток из продуцирующих hfB3-292S клеток. Маркеры молекулярной массы в кДа указаны справа.

На фигуре 4 показаны результаты гемолитического анализа. Эти результаты показывают ингибирование гемолитической активности альтернативного пути комплемента человека неочищенной культуральной средой продуцирующих белок hfB3 или белок hfB3-292S клеток. Относительную гемолитическую активность оценивают по гемоглобину, высвобожденному после гемолиза rRBC посредством активности альтернативного пути комплемента человека. По X-оси слева направо: истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная 0 мкг очищенного белка фактора B человека (контроль, без лизиса rRBC); истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная в каждой реакции смесью 0,5 мкг очищенного белка фактора B человека и 1,0, 0,5, 0,25 или 0,125 мкг белка hfB3 или белка hfB3-292S, как указано, из культуральной среды продуцирующих белок hfB3 или белок hfB3-292S клеток. Примечание: 100% ингибирование представляет отсутствие лизиса rRBC. Y-ось представляет среднее OD405 и стандартное отклонение (SD).

На фигуре 5A показан белок hfB3 (200 нг), очищенный на трех стадиях процесса хроматографии, подвергнутый анализу SDS-PAGE и окрашиванию серебром. На фигуре 5B показано ингибирование гемолитической активности альтернативного пути комплемента человека очищенным белком hfB3. По X-оси слева направо: истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная 0 мкг очищенного белка фактора B дикого типа человека (wt hfB) (контроль, без лизиса rRBC); истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная в каждой реакции смесью 0,5 мкг очищенного белка фактора B человека и 1,0, 0,5, 0,3, 0,2, 0,1 или 0,05 мкг hfB3, как указано. 100% ингибирование представляет отсутствие лизиса rRBC. Y-ось представляет среднее OD405 и SD.

На фигуре 6 показана биологическая активность двух популяций белка hfB3. Показаны результаты хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) очищенного белка hfB3 из пика I и пика II для ингибирования гемолитической активности альтернативного пути комплемента человека. По X-оси слева направо: истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная 0 мкг очищенного белка фактора B человека (контроль, без лизиса rRBC); истощенная по фактору B сыворотка человека, дополненная в каждой реакции смесью 0,5 мкг очищенного белка фактора B человека и различными количествами белка hfB3 в диапазоне 1,0-0,05 мкг. 100% ингибирование представляет отсутствие лизиса rRBC. Y-ось представляет среднее OD405 и SD.

На фигуре 7 показана обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) неочищенных супернатантов культур клеток, содержащих либо белок hfB3, либо белок hfB3-292S после инкубации культуры клеток в течение 72 часов (2×10⁶ клеток/мл). A) Супернатанты из продуцирующих hfB3 клеток (………), продуцирующих белок hfB3-292S клеток (______) и наивных клеток 293 (- - - - -), вносили в систему HPLC Agilent HP1 100 с использованием колонки с микронасадкой Jupiter™ C4 (Phenomenex) и элюировали 50-минутным градиентом вода/ацетонитрил (25-70% ацетонитрил), содержащим 0,1% TFA. Элюцию мониторировали при 215 нм с помощью детектора PDA. Показано также положение белка теплового шока 70 (HSP70), присутствующего во всех трех образцах.

B) Увеличенная область хроматограммы, показанной на фигуре 7A, сфокусированной на области (25-29 минут), содержащей пики I и II белка hfB3 и пик, содержащий белок hfB3-292S.

На фигуре 8 показан анализ экспрессии белка hfB3-Fc- посредством подвергания 2 мкл супернатанта культуры клеток, содержащего белок hfB3-Fc-, анализу невосстанавливающим SDS-PAGE и Вестерн-блоттингом. (См. пример 12). Детектировали две полосы белка hfB3-Fc-, маркеры молекулярной массы в кДа указаны слева.

На фигуре 9 показано репрезентативное окрашивание H&E парафиновых срезов суставов правых передних лап мышей из исследования, тестирующего hfB3-292S в модели ревматоидного артрита на мышах - индуцированном антителом против коллагена артрите (CAIA), как описано в примере 16. Группа 1 представляет собой контрольную группу носителя, в которой не вводили коктейля антител против коллагена. Группа 2 представляет собой группу без лечения, в которой вводили коктейль антител против коллагена. Группа 3 представляет собой группу после лечения, в которой вводили коктейль антител против коллагена и которую лечили hfB3-292S.

На фигуре 10 показаны измерения опухания сустава из исследования, тестирующего hfB3-292S в модели ревматоидного артрита на мышах - индуцированном антителом против коллагена артрите (CAIA), как описано в примере 16. Группы являются такими же, как группы на фигуре 8, как описано в разделе. hfB3-292S вызывал статистически значимое (p<0,0003) уменьшение опухания сустава по сравнению с группой без лечения (группа 2).

На фигуре 11 показан анализ Вестерн-блоттингом культуральной среды от клеток, трансфицированных экспрессирующей конструкцией hfB3-292SN480. Этот анализ Вестерн-блоттингом проводили с использованием моноклонального антитела, специфического для hfB3-292S. Левая дорожка содержит hfB3-292S, а правая дорожка представляет собой культуральную среду от клеток, трансфицированных экспрессирующей конструкцией hfB3-292SN480. Анализ детектировал полосу приблизительно 55 кДа из культуральной среды линии клеток hfB3-292SN480 (правая дорожка).

На фигуре 12 показан анализ Вестерн-блоттингом культуральной среды от клеток, трансфицированных экспрессирующей конструкцией hfB3-292S/Fc-mono, как описано в примере 19, ниже. Полосу приблизительно 115 кДа детектировали посредством очищенного антитела козы против фактора B человека после невосстанавливающего SDS-PAGE.

На фигуре 13 показано, что супернатант культуры клеток из клеток, экспрессирующих hfB3-292SN480, ингибировал гемолитическую активность альтернативного пути комплемента человека зависимым от дозы образом.

На фигуре 14 показано, что супернатант культуры клеток из клеток, экспрессирующих hfB3-292S/Fc-mono, ингибировал гемолитическую активность альтернативного пути комплемента человека зависимым от дозы образом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 - аминокислотная последовательность фактора комплемента B дикого типа человека.

SEQ ID NO:2 - аминокислотная последовательность аналога белка фактора комплемента B человека, hfB3-292S, содержащего следующие мутации: K258A, R259A, K260A, D279G, N285D и C292S.

SEQ ID NO:3 - аминокислотная последовательность аналога фактора комплемента B человека, hfB3-292S-740N, содержащего следующие мутации по сравнению с SEQ ID NO:1: K258A, R259A, K260A, D279G, N285D, D740N и C292S.

SEQ ID NO:4 - аминокислотная последовательность аналога фактора комплемента B человека, hfB3, содержащего следующие мутации по сравнению с SEQ ID NO:1: K258A, R259A, K260A, D279G и N285D.

SEQ ID NO:5 - нуклеотидная последовательность экспрессирующей конструкции hfB3,

конструирование которой описано в примере 1.

SEQ ID NO:6-7 - праймеры для сайт-специфического мутагенеза.

SEQ ID NO:8 - нуклеотидная последовательность экспрессирующей конструкции hfB3-292S, конструирование которой описано в примере 2.

SEQ ID NO:9-14 - частичные аминокислотные последовательности белков факторов комплемента B человека, мыши, крысы, свиньи, обезьяны и овцы, соответственно.

SEQ ID NO:15-16 - праймеры для сайт-специфического мутагенеза

SEQ ID NO:17 - аминокислотная последовательность аналога белка фактора комплемента B человека, hfB4.

SEQ ID NO:18 - нуклеотидная последовательность экспрессирующей конструкции hfB3-Fc-, конструирование которой описано в примере 12.

SEQ ID NO:19-20 - праймеры для сайт-специфического мутагенеза.

SEQ ID NO:21 - аминокислотная последовательность аналога белка фактора комплемента B человека, hfB3-Fc.

SEQ ID NO:22 - аминокислотная последовательность аналога белка фактора комплемента B человека, hfB3-292S-Fc.

SEQ ID NO:23 - аминокислотная последовательность аналога белка фактора комплемента B человека, hfB3-292S-740N-Fc.

SEQ ID NO:24 - нуклеотидная последовательность экспрессирующей конструкции для экспрессии hfB3-292SN480.

SEQ ID NO:25 - нуклеотидная последовательность конструкции для экспрессии гена для hfB3-292S/Fc-mono.

SEQ ID NO:26 - аминокислотная последовательность hfB3-292S/Fc-mono.

SEQ ID NO:27 - аминокислотная последовательность Fc-домена.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В осуществлении настоящего изобретения на практике используют, если не указано иначе, общепринятые способы клеточной биологии, молекулярной биологии, культивирования клеток, вирусологии и т.п., находящиеся в компетенции специалистов в данной области. Эти способы полностью описаны в настоящем документе и/или в современной литературе, например, Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., «Molecular Cloning, A Laboratory Manual», 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Celis J. E. «Cell Biology, A Laboratory Handbook» Academic Press, Inc. (1994) и Bahnson et al, J. of Virol. Methods, 54: 131-143 (1995).

Предусматривают, что любой способ, препарат или композицию, описанные в настоящем документе, можно осуществлять по отношению к любому другому способу, препарату или композиции, описанным в настоящем документе. Использование слова «a» или «an» при использовании в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но оно согласуется также со значением «один или несколько», «по меньшей мере один» и «один или более одного». Использование термина/фразы «и/или» при использовании со списком означает, что можно использовать один или несколько из перечисленных пунктов, например, он не является ограниченным одним или всеми элементами.

В ходе продукции и очистки аналога белка фактора комплемента B, обозначенного hfB3 (SEQ ID NO:4), детектированы две популяции аналога белка фактора комплемента B. Одна популяция обладала желаемой активностью для аналога белка фактора комплемента B (пик I), в то время как другая популяция обладала по существу меньшей, чем желательная, активностью (пик II), например, см. фигуры 6 и 7. Результаты характеризации двух популяций позволяют предполагать, что две популяции различались по характерам их дисульфидных связей. Когда свободный цистеин (положение 292 SEQ ID NO:4) в результате мутации меняли на серин, пик II не поддавался детекции. На фигуре 6 показано, что фракция пика II обладает некоторой способностью ингибировать активность комплемента/гемолитическую активность, но намного меньшей способностью на мкг белка по сравнению с фракцией пика I. Возможно, что активность ингибирования комплемента/гемолиза пиком II является результатом в основном или единственно того, что пик II содержит некоторое количество hfB3 со свободным цистеином в положении 292, возможно, в результате того, что пик I и пик II не полностью отделены друг от друга.

Цистеин, соответствующий положению 292 SEQ ID NO:1 является высоко консервативным среди белков факторов комплемента B различных видов млекопитающих (например, см. таблицу 1). Высоко консервативные последовательности являются, как правило, важными для функционирования белка. «Нейтральная теория молекулярной эволюции гласит, что мутации аминокислот возникают стохастически постоянным образом, пока мутации не оказывают эффекта на функцию продукта гена [Kimura M: The neutral theory of molecular evolution. Sci Am 1979, 241(5):98-100, 102, 108 passim]. С другой стороны, аминокислоты, являющиеся важными для функции и структуры белка, не могут мутировать без вредного эффекта на активность белка. Таким образом, эти аминокислоты будут меняться очень медленно в данном семействе белков в ходе эволюции». (Liu et al. BMC Bioinformatics 2006, 7:37)

Замена мутацией цистеина в аминокислоте 292 аналога белка фактора комплемента B на серин, например, как показано в SEQ ID NO:2 (MB3-292), существенно уменьшала, если не уничтожала, количество в популяции пика II (по существу менее активной) и аналог белка фактора комплемента B hfB3-292S сохранял свою активность, в этом случае, способность ингибировать или снижать активность комплемента. (Например, см. пример 10, ниже.)

Без желания быть связанными теорией, менее активная популяция (фракция пика II) белка hfB3 может являться результатом неправильного сворачивания белка hfB3. Возможно, образование большей части популяции пика II было обусловлено комбинацией свободного цистеина и мутаций, введенных в белок hfB3, поскольку когда клетки конструировали для экспрессии белка фактора комплемента B дикого типа человека (SEQ ID NO:1) способом, сходным со способом, используемым для белка hfB3, детектировали только одну популяцию белка фактора B дикого типа человека (данные не представлены).

Эта мутация свободного цистеина позволяет более высокий выход активного аналога фактора комплемента B, поскольку большая часть, если не все, из продуцированного аналога белка фактора комплемента B присутствует в активной форме. Кроме того, мутация свободного цистеина приводит к более стабильному белку, поскольку все из оставшихся не подвергшихся мутации цистеинов являются частью дисульфидной связи, и не остается свободного цистеина, который может участвовать в возможно нежелательных и вредных реакциях. Кроме того, мутация свободного цистеина неожиданно, по-видимому, уменьшает или исключает агрегацию аналога белка фактора комплемента B, например, см. пример 6 и фигуру 3.

Аналоги белка фактора комплемента B, описанные в Публикации PCT No. WO08/106644 или Публикации патента США No. US20100120665 (полное содержание обоих из которых приведено в качестве ссылки), могут обладать мутациями свободного цистеина и еще сохранять их желательную функцию, в то же время извлекая пользу из вышеупомянутых преимуществ мутации. Таким образом, настоящее изобретение относится к любым аналогам белка фактора комплемента B, описанного в Публикации PCT No. WO08/106644 или Публикации патента США No. US20100120665, с мутацией свободного цистеина.

Термин «свободный цистеин» относится к цистеину, который является частью белка или пептида, где свободный цистеин не формирует дисульфидную связь с другим цистеином в том же самом белке или пептиде. В некоторых случаях «свободный цистеин» аналога белка не формирует дисульфидную связь с другим цистеином (в том же самом белке или пептиде), когда аналог белка обладает желательной активностью, но может формировать дисульфидную связь с другим цистеином (в том же самом белке или пептиде) в менее активной или неактивной форме аналога белка.

Термин «опосредованный комплементом» относится к процессу или заболеванию, включающему в себя комплемент. Как правило, «опосредованное комплементом» заболевание или состояние представляет собой то, где активность комплемента является одной из первопричин заболевания или состояния, и где ингибирование или блокирование активности комплемента снижает степень заболевания или состояния. Примеры многочисленных опосредованных комплементом заболеваний или состояний описаны в настоящем документе.

Термин «дикий тип» (или дикого типа), который используют взаимозаменяемо с «природный», относится к встречающемуся в природе белку, кодируемому геномом млекопитающих, к встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, и т.д. В некоторых случаях, в действительности может существовать более одного белка, соответствующего варианту дикого типа, например, из-за аллельных различий; различных изоформ; и/или генетической изменчивости между различными индивидуумами вида.

Термин «аналог» относится к структурному производному белка (исходного белка). Аналог не обязательно сохраняет все свойства исходного белка и в некоторых случаях обладает по меньшей мере одним измененным свойством по сравнению с соответствующим природным исходным белком. В некоторых вариантах осуществления, исходный белок представляет собой природный (встречающийся в природе) белок. Аналог или вариант белка получают заменой, замещением, делецией и/или добавлением аминокислот по отношению к соответствующей природной аминокислотной последовательности белка. Замены или вставки, как правило, вовлекают встречающиеся в природе аминокислоты, но могут также включать в себя синтетические или редкие аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления аналог или вариант получают подверганием белка мутациям, например, подверганием мутациям кодирующей его нуклеиновой кислоты. Аналог может, как правило, сохранять по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% аминокислотной последовательности соответствующего природного исходного белка (например, обладать этим процентом идентичности аминокислотной последовательности по сравнению с встречающимся в природе исходным белком, как определено на протяжении длины целого исходного белка или, в конкретных вариантах осуществления, на протяжении конкретного домена или части исходного белка). Аналоги включают в себя также фрагменты полноразмерных аналогов, которые содержат часть аминокислотной последовательности и либо сохраняют один или несколько видов биологической активности исходного белка или полноразмерного аналога, либо ингибируют один или несколько из этих видов биологической активности.

Термин «соответствует» или «соответствующий» при ссылке на аминокислоту в конкретном белке относится к конкретной аминокислоте в этом конкретном белке, а также к аминокислоте в родственном или сходном белке и может обеспечивать сходную функцию белка. Например, может быть обнаружено, что аминокислота в факторе комплемента B человека соответствует аминокислоте в факторе комплемента B мыши, или в аллельном варианте фактора B человека, как обычно определено посредством выравнивания двух аминокислотных последовательностей. Например, специалист в данной области может выравнивать две или более родственных последовательностей, таких как SEQ ID NO:9-14, для определения соответствующих аминокислот, например, с использованием программы BLAST (например, см. таблицу 1, выше). А также, соответствующие аминокислоты можно определять, например, посредством выравнивания мотивов (например, мотива расщепления протеазой) внутри родственных или неродственных белков. Такое выравнивание можно использовать также для выведения консенсусных последовательностей белка-мишени или его доменов.

Как применяют в настоящем документе, термин «ген», как правило, относится к кодирующей области белка. Однако, в некоторых контекстах в настоящем документе, понятно, что термин «ген» относится также к элементам (например, регуляторным элементам), функционально связанным с кодирующей областью, таким как промоторы, энхансеры, участки сплайсинга (акцепторы и/или доноры), сигналы полиаденилирования, интроны, 5' нетранслируемые области, 3'-нетранслируемые области и т.д.

Термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регулирующими органами федерального или государственного правительства или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для использования для человека.

«Терапевтическая полезность» не обязательно представляет собой излечение конкретного заболевания или состояния (включая любое заболевание или состояние, описанное в настоящем документе), но вместо этого, охватывает результат, который по большей части, как правило, включает в себя облегчение заболевания или состояния, устранение заболевания или состояния, уменьшение одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием, предотвращение или облегчение вторичного заболевания или состояния, возникающего в результате возникновения первичного заболевания или состояния, уменьшение вероятности развития состояния или заболевания, уменьшение тяжести заболевания или состояния, изменение характера заболевания или состояния, сокращение течения заболевания или состояния, замедление или предотвращение прогрессирования или ухудшения заболевания или состояния, и/или предотвращение заболевания или состояния.

Аналоги фактора комплемента B

Настоящее изобретение относится к аналогам белка фактора комплемента B и полипептидам, включающим аналоги фактора комплемента, и их применениям. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к аналогу белка фактора комплемента B, где свободный цистеин подвергали мутации. В некоторых вариантах осуществления эта мутация свободного цистеина может включать в себя делецию свободного цистеина или замену свободного цистеина другой аминокислотой (аминокислотами). Свободный цистеин можно заменять по существу любой аминокислотой, которая еще позволяет аналогу белка фактора комплемента B сохранять по меньшей мере некоторые из желательных характеристик(и), такие как способность к понижающей регуляции, уменьшению или нарушению активности комплемента. Может происходить замена на одну или несколько аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, свободный цистеин заменен на серин. В некоторых вариантах осуществления свободный цистеин заменен на одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аланина, гистидина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, серина, треонина, тирозина и валина. В некоторых вариантах осуществления свободный цистеин соответствует аминокислоте 292 из SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аналогам белка фактора комплемента B, которые не содержат свободный цистеин. Изобретение относится также к способам получения или продукции аналога белка фактора комплемента B, содержащего мутации свободного цистеина.

Мутацию свободного цистеина можно комбинировать с другими мутациями белка фактора комплемента B, например, другими мутациями, как описано в настоящем документе.

Изобретение относится также к аналогам белка фактора комплемента B, где цистеин, соответствующий аминокислоте 292 из SEQ ID NO:l, подвергают мутации. Эта мутация может представлять собой делецию, вставку или замену, такую как замена на серин или другие мутации, как описано в настоящем документе.

Аналоги могут включать в себя различные мутеины последовательности, отличные от встречающейся в природе аминокислотной последовательности. Например, отдельные или множественные замены аминокислот (например, консервативные или не консервативные замены аминокислот) можно выполнять во встречающейся в природе последовательности. Консервативная замена аминокислоты, как правило, не должна по существу изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замененная аминокислота не должна проявлять тенденцию разрушать спираль, возникающую в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, характеризующие исходную последовательность). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden и J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton et al. Nature 354: 105 (1991). Консервативные замены включают в себя, но без ограничения, замены из следующих групп: кислые остатки Asp (D) и Glu (E); основные остатки Lys (K), Arg (R) и His (H); гидрофильные нез