Элитное событие ее-gm3 и способы и наборы для идентификации такого события в биологических образцах

Элитное событие ее-gm3 и способы и наборы для идентификации такого события в биологических образцах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на приоритет согласно предварительной заявке на патент США No 61/367227, поданной 23 июля 2010 г.; предварительной заявке на патент США No 61/263690, поданной 23 ноября 2009 г.; и предварительной заявке на европейский патент No EP 09014564.0, поданной 23 ноября 2009 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, растительному материалу и семенам сои, характеризующимся содержанием специфического трансформационного события, в частности, присутствием генов, кодирующих белки, придающие устойчивость к гербицидам, и характеризующихся специфическим положением в геноме сои. Растения сои, согласно изобретению, объединяют фенотип устойчивости к гербицидам с агрономической продуктивностью, генетической стабильностью и функциональностью в различном генетическом окружении, эквивалентными нетрансформированной линии сои при отсутствии гербицида(ов). Кроме того, настоящее изобретение представляет способы и наборы для идентификации присутствия растительного материала, включающего специализированное трансформационное событие EE-GM3 в биологических образцах.

Уровень техники

Фенотипическая экспрессия трансгена в растениях определяется как структурой гена или генов самих по себе, так и его или их положением в геноме растения. В то же время присутствие трансгенов или "чужеродной ДНК" по различным положениям в пределах генома различными путями влияет на общий фенотип растения. Агрономически или промышленно успешное внедрение путем генетической манипуляции в организм растения признака, представляющего интерес с коммерческой точки зрения, в зависимости от различных факторов, может представлять собой продолжительную процедуру. Фактическая трансформация и регенерация генетически трансформированного растения является лишь первым этапом селекции, которая включает расширенное исследование генетических характеристик, скрещивание и полевые испытания, в конечном итоге приводящие к селекции элитного события.

Важность однозначной идентификации элитного события возрастает в свете обсуждения новых пищевых продуктов/кормов, разделения продуктов на основе генетически модифицированных и немодифицированных организмов и идентификации патентованных материалов. В идеале такой способ идентификации является как быстрым, так и простым, не требующим масштабного лабораторного оборудования. Кроме того, этот способ должен обеспечивать результаты, позволяющие однозначно определить элитное событие без экспертной интерпретации, однако при необходимости выдерживающие экспертную оценку. Специализированные инструменты для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах описаны в настоящей заявке.

В настоящем изобретении EE-GM3 идентифицировали как элитное событие из популяции трансгенных растений сои при разработке сои культурной (Glycine max), устойчивой к гербицидам, включающей ген, кодирующий устойчивость к глифосату, в комбинации с геном, придающим устойчивость к ингибиторам 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы (HPPD), каждый из которых находится под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.

В литературе описаны растения сои, содержащие ген устойчивости к гербицидам. Однако ни одна из известных публикаций не сообщает о настоящем изобретении.

В данной области техники известно, что получение коммерческого элитного трансформационного события устойчивых к гербицидам растений сои, обладающих приемлемой агрономической продуктивностью без ухудшения урожайности и достаточной устойчивостью к гербицидам 2 различных классов является далеко не простой задачей.

В действительности, сообщалось, что первое событие сои (событие 40-3-2), поступившее на рынок как устойчивое к гербицидам, характеризовалось значительным ухудшением урожайности по сравнению с изогенными или приблизительно изогенными линиями (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412).

Кроме того, была выведена соя Optimum GAT (TM), объединявшая свойства устойчивости к глифосату с устойчивостью к гербицидам, действующим на ацетолактатсинтазу, однако разработчики сообщали, что эта соя сама по себе не соответствовала стандартам устойчивости к глифосату (вне комбинации с другим событием устойчивости сои к глифосату, например, событием 40-3-2 (см., например, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к трансгенному растению сои или его семени, клеткам и тканям, содержащим стабильно интегрированную в их геном экспрессионную кассету, включающую ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность гена 2mEPSPS и еще один ген устойчивости к гербициду, включающий кодирующую последовательность HPPD-PF W336 (в соответствии с описанием в Примере 1.1 настоящей заявки и как представлено в SEQ ID No 1), устойчивому к глифосату и гербициду-ингибитору HPDD, например, изоксафлютолу, и, при отсутствии гербицида(ов), обладающему агрономической производительностью, практически эквивалентной производительности нетрансгенной изогенной линии. После применения одного или более гербицидов, к которым растение обладает устойчивостью, оно демонстрирует агрономический фенотип, превосходящий фенотип нетрансгенного растения.

Согласно настоящему изобретению растение сои или его семя, клетки или ткани содержат элитное событие EE-GM3.

В частности, настоящее изобретение относится к трансгенным растениям сои, их семенам, клеткам или тканям, геномная ДНК которых характеризуется тем, что ее анализ согласно протоколу ПЦР-идентификации, как описано здесь, с использованием двух праймеров к 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3 и чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, соответственно, обнаруживает фрагмент, специфический для EE-GM3. Мишенью праймеров могут являться 5’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 2 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно. Мишенью праймеров, например, праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 5 и SEQ ID No: 4 или SEQ ID No: 7, соответственно, также могут являться 3’-фланкирующая область в пределах SEQ ID No: 3 и чужеродная ДНК, включающая гены устойчивости к гербицидам, соответственно, при этом праймеры обнаруживают фрагмент ДНК размером от 100 до 800 п.о., например, фрагмент размером приблизительно 263 п.о. или 706 п.о.

Эталонные семена, содержащие элитное событие согласно изобретению, депонированы в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659. Один из вариантов воплощения настоящего изобретения представляет семя, содержащее элитное событие EE-GM3, депонированное под номером доступа NCIMB 41659 и вырастающее в растение сои, устойчивое к гербицидам, в частности, устойчивое к глифосату и/или ингибиторам HPPD, например, изоксафлютолу. Семена, депонированные в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659, представляют собой партию семян, состоящую по меньшей мере приблизительно на 95% из трансгенных семян, гомозиготных по внедренной ДНК и содержащих элитное событие согласно изобретению, которые вырастают в растения, устойчивые к гербицидам, причем эти растения являются устойчивыми к глифосату и/или изоксафлютолу. Семя или потомство семени, получаемое или полученное из депонированного семени (например, после скрещивания с другими растениями сои с другим генетическим окружением), можно высеять и обработать растущие растения глифосатом или изоксафлютолом, как описано здесь, получая растения, устойчивые к глифосату или изоксафлютолу, содержащие элитное событие согласно изобретению. Настоящее изобретение, кроме того, относится к клеткам, ткани и потомству растения, содержащего элитное событие согласно изобретению, выросшего из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659. Настоящее изобретение, кроме того, относится к растениям, получаемым из (например, путем размножения или скрещивания с) растения сои, содержащего элитное событие согласно изобретению (например, растения, выросшего из семени, депонированного в NCIMB под номером доступа NCIMB 41659). Настоящее изобретение также относится к растениям сои, содержащим элитное событие EE-GM3.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу идентификации трансгенного растения или его клеток или тканей, содержащих элитное событие EE-GM3, основанному на идентификации присутствия характерных последовательностей ДНК или аминокислотных последовательностей, кодируемых такими последовательностями ДНК трансгенного растения, клеток или тканей. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения такие характерные последовательности ДНК представляют собой последовательности длиной 15 п.о. или по меньшей мере 15 п.о., предпочтительно 20 п.о. или по меньшей мере 20 п.о., наиболее предпочтительно 30 п.о. или более, содержащие сайты инсерции события, т.е. как фрагмент вставленной чужеродной ДНК, содержащей гены устойчивости к гербицидам, так и фрагмент генома сои (5’- или 3’-фланкирующую область), состыкованные друг с другом, что дает возможность специфической идентификации элитного события. Настоящее изобретение также относится к растениям, содержащим элитное событие EE-GM3, как описано здесь.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, основанным на использовании праймеров или зондов, специфически распознающих 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам.

В частности, настоящее изобретение относится к способу, включающему амплификацию нуклеотидной последовательности, присутствующих в биологических образцах, с помощью полимеразной цепной реакции и. по меньшей мере, двух праймеров, один из которых распознает 5’- или 3’-фланкирующую область чужеродной ДНК в EE-GM3, включающей гены устойчивости к гербицидам, а другой распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, предпочтительно для получения фрагмента ДНК размером между 100 и 800 п.о.. Праймеры могут распознавать последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM3 (SEQ ID No 2, от положения 1 до положения 1451) или в пределах 3’-фланкирующей области EE-GM3 (комплементарную SEQ ID No 3, от положения 241 до положения 1408) и последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербициду (комплементарную SEQ ID No 2, от положения 1452 до положения 1843, или SEQ ID No 3, от положения 1 до положения 240), соответственно. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 7, описанные здесь. Настоящее изобретение также относится к специфическим праймерам и специфической ДНК, амплифицированной с помощью таких праймеров, как описано здесь.

В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, причем этот способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности, присутствующей в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 263 п.о., либо два праймера, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 7, соответственно, и приводящей к получению фрагмента ДНК длиной приблизительно 706 п.о.. Кроме того, настоящее изобретение включает растения, содержащие элитное событие EE-GM3, идентифицированное таким образом.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к специфическим фланкирующим последовательностям EE-GM3, описанным здесь, которые можно использовать для разработки специфических способов идентификации EE-GM3 в биологических образцах. Такие специфические фланкирующие последовательности также можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации. А именно, настоящее изобретение относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3, которые можно использовать для разработки специфических праймеров и зондов согласно дальнейшему описанию здесь. Кроме того, в качестве эталонного материала можно использовать молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно длиной приблизительно 150-850 п.о., включающие последовательность, которую можно амплифицировать с помощью праймеров, включающих или состоящих (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 7 и SEQ ID No 5 или SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам идентификации присутствия EE-GM3 в биологических образцах, основанным на использовании таких специфических праймеров или зондов. Праймеры могут включать, состоять из или главным образом состоять из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, в комбинации с праймерами, включающими, состоящими из или главным образом состоящими из нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, например, нуклеотидной последовательности длиной от 17 до приблизительно 200 последовательных нуклеотидов, выбираемых из комплементарной цепи нуклеотидной последовательности SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Праймеры также могут включать указанные нуклеотидные последовательности, расположенные непосредственно на их 3’-конце, и, кроме того, включать неродственные последовательности или последовательности, являющиеся производными упомянутых нуклеотидных последовательностей, но содержащие несоответствия.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающим по меньшей мере один праймер или зонд, специфически распознающий 5’- и/или 3’-фланкирующую последовательность чужеродной ДИК в EE-GM3.

Наборы, согласно изобретению, могут включать, кроме праймера, специфически распознающего 5’- или 3’-фланкирующую последовательность EE-GM3, второй праймер, специфически распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM3, содержащую гены устойчивости к гербицидам, для использования согласно Протоколу ПЦР-идентификации. Наборы, согласно изобретению, могут включать по меньшей мере два специфических праймера, один из которых распознает последовательность в пределах 5’-фланкирующей области EE-GM3, а второй распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК в EE-GM3, содержащую гены устойчивости к гербицидам. Праймер, распознающий 3’-фланкирующую область, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 5, а праймер, распознающий трансгены или чужеродную ДНК, включающую гены устойчивости к гербицидам, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 или No: 7, или любой другой праймер или комбинацию праймеров, описанные здесь.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающему праймеры для ПЦР, включающие или состоящие (главным образом) из нуклеотидной последовательности SEQ ID No 5 и SEQ ID No 4, для использования согласно Протоколу ПЦР-идентификации EE-GM3, описанному здесь.

Настоящее изобретение также относится к набору для идентификации элитного события EE-GM3 в биологических образцах, включающему специфический зонд, включающий или состоящий (главным образом) из последовательности, соответствующей (или комплементарной) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности со специфической областью EE-GM3. В предпочтительном случае последовательность зонда соответствует специфической области, включающей часть 5’- или 3’-фланкирующей области EE-GM3. В наиболее предпочтительном случае специфический зонд включает или состоит (главным образом) из (или комплементарен) последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 1431-1472 SEQ ID No 2, или последовательности, обладающей от 80% до 100% идентичности с последовательностью, расположенной между нуклеотидами 220-260 SEQ ID No 3.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения описанные последовательности ДНК включают сайт инсерции события и полинкулеотиды достаточной длины, относящиеся как к геному сои, так и к чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам (трансгену), что обеспечивает возможность их использования в качестве праймера или зонда для обнаружения EE-GM3, и для определения характеристик растений, содержащих событие EE-GM3. Такие последовательности могут включать по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК сои и аналогичное количество нуклеотидов чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам, для EE-GM3 с каждой стороны сайта соединения, соответственно. В наиболее предпочтительном случае такие последовательности ДНК включают по меньшей мере 9 нуклеотидов геномной ДНК сои и аналогичное количество нуклеотидов чужеродной ДНК, включающей гены устойчивости к гербицидам (трансгена), примыкающие к сайту инсерции в SEQ ID No: 2 или SEQ ID No: 3. В одном из аспектов настоящего изобретения представлены растения сои, содержащие такие специфические последовательности ДНК.

Способы и наборы, охваченные настоящим изобретением, можно использовать для различных целей, например, не ограничиваясь этим: идентификации присутствия или определения (нижнего) порогового значения ЕЕ-СМ3 в растениях, растительном материале или продуктах, например, не ограничиваясь этим, в пищевых продуктах или кормах (свежих или обработанных), включающих или происходящих из растительного материала; дополнительно или альтернативно способы и наборы настоящего изобретения можно использовать для идентификации трансгенного растительного материала в целях разделения трансгенных и нетрансгенных материалов; дополнительно или альтернативно способы и наборы настоящего изобретения можно использовать для определения качества (т.е. процентного содержания чистого материала) растительного материала, включающего EE-GM3.

Настоящее изобретение также относится к 5’- и/или 3’-фланкирующим областям EE-GM3, а также к специфическим праймерам и зондам, разработанным на основе 5’- и/или 3’-фланкирующих последовательностей EE-GM3.

Настоящее изобретение также относится к геномной ДНК, полученной из растений, содержащих элитное событие EE-GM3. Такую геномную ДНК можно использовать в качестве эталонного контрольного материала при анализах идентификации, описанных здесь.

Кроме того, здесь представлены растения или клетки, части, семена или потомство трансгенной сои, устойчивой к гербицидам, каждое из которых содержит по меньшей мере одно элитное событие, причем указанное элитное событие включает чужеродную ДНК, включающую:

i) первый химерный ген, включающий модифицированный ген epsps из Zea mays, кодирующий фермент EPSPS, устойчивый к глифосату, под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке, и

ii) второй химерный ген, включающий модифицированный ген hppd из Pseudomonas fluorescens, кодирующий фермент HPPD, устойчивый к гербицидам-ингибиторам, под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.

В одном варианте воплощения указанное элитное событие включает нуклеотиды 1-1451 SEQ ID No 2, примыкающие непосредственно сверху к указанной чужеродной ДНК, и нуклеотиды 241-1408 SEQ ID No 3, примыкающие непосредственно снизу к указанной чужеродной ДНК. В дополнительном варианте воплощения указанное элитное событие можно получить путем скрещивания с растением сои, выросшим из эталонного семени, содержащего указанное событие и депонированного в NCIMB под номером NCIMB 41659.

В еще одном варианте воплощения геномная ДНК указанного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства при анализе согласно протоколу идентификации указанного элитного события с использованием двух праймеров, включающих нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4 и SEQ ID No 5, соответственно, позволяет получить фрагмент ДНК длиной (приблизительно) 263 п.о.

Кроме того, здесь представлен способ идентификации трансгенного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства, устойчивых к глифосату и/или гербициду-ингибитору HPPD, например, изоксафлютолу, в биологических образцах, причем указанный способ включает амплификацию фрагмента ДНК длиной между 100 и 500 п.о. из нуклеиновой кислоты, присутствующей в биологическом образце, с помощью полимеразной цепной реакции, использующей по меньшей мере два праймера, один из которых распознает 5’-фланкирующую область вышеуказанного элитного события, причем указанная 5’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или 3’-фланкирующую область указанного элитного события, причем указанная 3’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, а другой из указанных праймеров распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК, включающей нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240.

Кроме того, здесь представлен набор для идентификации трансгенного растения сои или его клеток, частей, семян или потомства, устойчивых к глифосату и/или гербициду-ингибитору HPPD, например, изоксафлютолу, в биологических образцах, причем указанный набор включает праймер, распознающий 5’-фланкирующую область вышеуказанного элитного события, причем указанная 5’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, или праймер, распознающий 3’-фланкирующую область указанного элитного события, причем указанная 3’-фланкирующая область включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, и праймер, распознающий последовательность в пределах чужеродной ДНК, причем указанная чужеродная ДНК включает нуклеотидную последовательность комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No 3, от нуклеотида 1 до нуклеотида 240.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения чужеродная ДНК элитного события EE-GM3, как используется здесь, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарную цепь. или включает последовательность, обладающую по меньшей мере 95, 98, 99 или 99.5% идентичности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью.

Кроме того, здесь представлены растение, растительная клетка, ткань или семя сои, геном которых содержит молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичности с SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.

Один из вариантов воплощения настоящего изобретения представляет растение, растительную клетку, ткань или семя сои, геном которых содержит молекулу нуклеиновой кислоты, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 1 или ее комплементарной цепью, или гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или гибридизутощуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.

Также здесь представлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную нуклеотидной последовательности SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепи, или нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепи, или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11, от положения 1452 до положения 16638, или ее комплементарной цепью, или гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No 11 или ее комплементарной цепью.

Краткое описание чертежей

Приведенные далее Примеры, не предназначенные для ограничения настоящего изобретения в рамках конкретных описанных вариантов воплощения, можно осмысливать в сочетании с прилагаемыми Фигурами, включенными в настоящий документ посредством ссылок, на которых:

Фиг.1: Схематическое представление взаимодействия между упомянутыми нуклеотидными последовательностями и праймерами. черный прямоугольник: чужеродная ДНК; заштрихованный прямоугольник: ДНК растительного происхождения; стрелка с клетчатой заливкой (а): химерный ген, кодирующий HPPD PF W366 (композицию химерного гена см. в Таблице 1); заштрихованная стрелка (б): химерный ген, кодирующий 2mEPSPS (композицию химерного гена см. в Таблице 1); черные стрелки: олигонуклеотидные праймеры, фигуры под прямоугольниками означают положения нуклеотидов; (в) относится к комплементарной цепи указанной нуклеотидной последовательности; Примечание: схема приведена без учета масштаба.

Фиг.2: Результаты, полученные с помощью протокола ПЦР-идентификации, разработанного для EE-GM3. Последовательность загрузки геля: Дорожка 1: Маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.); дорожки 2 и 3: образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3; дорожки 4-7: образцы ДНК из трансгенных растений сои, не содержащих элитное событие EE-GM3, но содержащих те же гены устойчивости к гербицидам (другие трансформационные события); дорожка 8: образец ДНК из сои дикого типа; дорожка 9: контроль, не содержащий матрицу ДНК; дорожка 10: маркер молекулярной массы.

Фиг.3: Результаты, полученные с помощью протокола ПЦР для оценки зиготности, разработанного для EE-GM3. Последовательность загрузки геля: Дорожка 1: Маркер молекулярной массы (лэддер 100 п.о.); дорожки 2 и 5: образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3 в гомозиготной форме; дорожки 3, 8 и 9; образцы ДНК из растений сои, содержащих трансгенное событие EE-GM3 в гетерозиготной форме; дорожки 4, 6 и 7: контрольный образец ДНК из незиготического растения сои; дорожка 10: контроль, не содержащий матрицу ДНК; дорожка 11: маркер молекулярной массы.

Подробное описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения

Включение молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения обычно является результатом трансформации клетки или ткани. Конкретный сайт встраивания обычно обусловлен случайным встраиванием.

ДНК, включенную в геном растения в результате трансформации растительной клетки или ткани рекомбинантной ДНК, или "трансформирующей ДНК" и происходящую из такой трансформирующей ДНК, здесь и далее называют "чужеродной ДНК", включающей один или более "трансгенов". Трансгены EE-GM3 представляют собой гены устойчивости к глифосату и гербициду-ингибитору HPPD. "Растительная ДНК" в контексте настоящего изобретения относится к ДНК, происходящей из трансформированного растения. Растительная ДНК обычно находится в том же генетическом локусе соответствующего растения дикого типа. Чужеродную ДНК можно характеризовать по положению и конфигурации в сайте встраивания молекулы рекомбинантной ДНК в геном растения. Сайт генома растения, куда встраивают рекомбинантную ДНК, также называют "сайтом инсерции" или "сайтом-мишенью". Инсерция рекомбинантной ДНК в область генома растения, называемую "прединсерционная растительная ДНК" может быть связана с делецией растительной ДНК, называемой "делецией сайта-мишени". "Фланкирующая область" или "фланкирующая последовательность" здесь относится к последовательности длиной по меньшей мере 20 п.о., предпочтительно по меньшей мере 50 п.о., и до 5000 п.о. ДНК, отличающейся от внедренной ДНК, предпочтительно ДНК генома растения, примыкающей к чужеродной ДНК непосредственно сверху или примыкающей к чужеродной ДНК непосредственно снизу. Результатом процедур трансформации, приводящих к случайному встраиванию чужеродной ДНК, является получение трансформантов с различными фланкирующими областями, характерными и уникальными для каждого трансформанта. Если рекомбинантную ДНК внедряют в геном растения путем традиционного скрещивания, сайт ее инсерции в геноме растения или ее фланкирующие области в общем случае не изменяются.

"Выделенная нуклеиновая кислота (последовательность)" или "выделенная ДНК (последовательность)" здесь относится к нуклеиновой кислоте или ДНК (последовательности), которая более не находится в природном окружении, из которого ее выделили, например, нуклеотидной последовательности в геноме растения или другой бактерии-хозяина, или нуклеотидной кислоте или ДНК в составе гибрида с ДНК или нуклеиновой кислотой из другого источника, например, в составе химерного гена под контролем промотора, обеспечивающего экспрессию в растительной клетке.

Событием называют (искусственный) генетический локус, который в результате генно-инженерных манипуляций несет чужеродную ДНК или трансген, включающий по меньшей мере одну копию интересующего исследователя гена или генов. Типичные аллельные состояния события представляют собой наличие или отсутствие чужеродной ДНК. Событие описывают фенотипически по экспрессии трансгена. На генетическом уровне событие является частью генетической композиции растения. На молекулярном уровне событие можно описывать по рестриктазной карте (например, в соответствии с определением с помощью саузерн-блоттинга), по вверх и/или вниз фланкирующим последовательностям трансгена, положению молекулярных маркеров и/или молекулярной конфигурации трансгена. Обычно трансформация растения трансформирующей ДНК, включающей по меньшей мере один интересующий исследователя ген, приводит к получению популяции трансформантов, содержащей совокупность отдельных событий, каждое из которых является уникальным. Событие описывают по чужеродной ДНК и по меньшей мере одной из фланкирующих последовательностей.

Элитное событие в настоящем описании представляет собой событие, выбираемое из группы событий, полученных путем трансформации одной и той же трансформирующей ДНК, на основании экспрессии и стабильности трансгена(ов) и его совместимости с оптимальными агрономическими характеристиками растения, содержащего это событие. Таким образом, критерии селекции элитного события представляют собой один или более, предпочтительно два или более, наиболее предпочтительно - все критерии из следующего списка:

а) присутствие чужеродной ДНК не ставит под угрозу другие желательные характеристики растения, например, характеристики, относящиеся к агрономической производительности или коммерческой ценности;

б) событие описывается четко определенной молекулярной конфигурацией, которая стабильно наследуется и для которой можно разработать подходящие инструменты контроля идентичности;

в) ген(ы), интересующий(е) исследователя, демонстрирует(ют) корректную, адекватную и стабильную пространственную и временную фенотипическую экспрессию как в гетерозиготном (или гемизиготном), так и в гомозиготном состоянии события на коммерчески приемлемом уровне в диапазоне условий окружающей среды, при которых возможно нормальное агрономическое использование растений, несущих указанное событие.

В предпочтительном случае чужеродная ДНК ассоциирована с положением в геноме растения, позволяющим легко внедрять чужеродные последовательности в коммерчески желательное генетическое окружение.

Элитный статус события подтверждают интрогрессией элитного события в различные варианты генетического окружения, имеющие отношение к рассматриваемому вопросу, и наблюдением соответствия одному, двум или всем вышеприведенным критериям, например, а, б и в.

Таким образом, "элитное событие" относится к генетическому локусу, содержащему чужеродную ДНК и соответствующему вышеописанным критериям. Растение, растительный материал или потомство, например, семена, могут содержать одно или более элитных событий в составе своего генома.

Разработанные инструменты для идентификации элитного события либо растения, либо растительного материала, содержащего элитное событие, либо продукта, включающего растительный материал, содержащий элитное событие, основаны на специфических геномных характеристиках элитного события, например, специфической рестриктазной карте области генома, содержащей чужеродную ДНК, молекулярных маркерах или последовательности фланкирующей(и) области(ей) чужеродной ДНК.

После секвенирования одной или обеих фланкирующих областей чужеродной ДНК можно разработать праймеры и зонды, специфически распознающие эту (эти) последовательность(и) в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца с помощью молекулярно-биологических методик. Например, можно разработать ПЦР-методику идентификации элитного события в биологических образцах (например, образцах растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал). Такая ПЦР основана по меньшей мере на двух специфических "праймерах", один из которых распознает последовательность в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события, а второй распознает последовательность в пределах чужеродной ДНК. В предпочтительном случае праймеры обладают последовательностью длиной от 15 до 35 нуклеотидов, которая при оптимизированных для ПЦР условиях "специфически распознает" последовательность в пределах 5’- или 3’-фланкирующей области элитного события или чужеродной ДНК элитного события, соответственно, что приводит к амплификации специфического фрагмента ("интегрированного фрагмента" или отличительного ампликона) из образца нуклеиновой кислоты, содержащего элитное событие. Это означает, что при оптимизированных для ПЦР условиях происходит амплификация только интегрированного фрагмента-мишени и никакой другой последовательности, входящей в состав генома растения или чужеродной ДНК.

ПЦР-праймеры, подходящие для изобретения, могут представлять собой:

- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из ДНК растения в составе 5’-фланкирующей последовательности (SEQ ID No 2, от нуклеотида 1 до нуклеотида 1451) (праймеры, распознающие 5’-фланкирующие последовательности); или

- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из ДНК растения в составе 3’-фланкирутощей последовательности (комплементарной цепи SEQ ID No 3, от нуклеотида 241 до нуклеотида 1408) (праймеры, распознающие 3'-фланкирующие последовательности); или

- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие на своем 3’-конце нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из внедренных последовательностей ДНК (комплементарной цепи SEQ ID No 2, от нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843) (праймеры, распознающие чужеродную ДНК); или

- олигонуклеотиды длиной от 17 до приблизительно 200 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбираемых из внедренных последовательностей