Конструкция и способ конструирования синтетического двунаправленного растительного промотора ubi1

Конструкция и способ конструирования синтетического двунаправленного растительного промотора ubi1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

По этой заявке испрашивается приоритет на приоритет по дате подачи временной заявки на патент США с регистрационным № 61/582138, поданной 30 декабря 2011 года. По этой заявке также испрашивается приоритет по дате подачи временной заявки на патент США с регистрационным № 61/617252, поданной 29 марта 2012 года.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение, в общем, относится к области молекулярной биологии растений, и более конкретно, к области стабильной экспрессии множественных генов в трансгенных растениях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многие виды растений могут быть трансформированы трансгенами из других видов, чтобы ввести агрономически требуемые свойства или характеристики, например, повышающие такое качество, как пищевая ценность, увеличивающие урожайность, придающие устойчивость к насекомым-вредителям или заболеваниям, повышающие засухоустойчивость и стрессоустойчивость, улучшающие качества садово-огородной продукции (такие как пигментация и рост), придающие устойчивость к гербицидам, делающих возможным получение промышленно применимых соединений и/или материалов из растений и/или делающих возможным получение фармацевтических средств. Введение трансгены в растительные клетки и последующая регенерация фертильных трансгенных растений, которые содержат стабильно интегрированную копию трансгена, можно применять для получения трансгенных растений, которые обладают требуемыми свойствами.

Контроль и регуляция генной экспрессии может осуществляться разными механизмами. Инициация транскрипции гена является основным механизмом регуляции генной экспрессии. Инициация транскрипции обычно контролируется полинуклеотидными последовательностями, локализованными в 5'-фланкирующей области или области, лежащей выше транскрибируемого гена. Такие последовательности вместе называют промоторами. Промоторы обычно содержат сигналы для РНК-полимеразы к началу транскрипции, так что может быть получена матричная РНК (мРНК). Зрелая мРНК транслируется рибосомой, при этом происходит синтез белков. ДНК-связывающие белки специфично взаимодействуют с промоторными последовательностями ДНК, стимулируя образование транскрипционного комплекса, и инициируют процесс генной экспрессии. Существует множество эукариотических промоторов, выделенных из растений и охарактеризованных, которые являются функциональными, запуская экспрессию трансгена в растениях. Промоторы, которые влияют на генную экспрессию в ответ на стимулы окружающей среды, доступность питательных веществ или неблагоприятные условия, включая тепловой шок, анаэробиоз или присутствие тяжелых металлов, были выделены и охарактеризованы. Также существуют промоторы, которые контролируют генную экспрессию во время развития или специфичным для ткани или органа образом. Кроме того, были выделены и охарактеризованы прокариотические промоторы из бактерий и вирусов, которые являются функциональными, запуская экспрессию трансгена в растениях.

Типичный эукариотический промотор состоит из минимального промотора и других цис-элементов. Минимальный промотор АО существу представляет собой область TATA-бокса, где ДНК-полимераза II (polII), TATA-связывающий белок (TBP) и TBP-ассоциированные факторы (TAF) могут связываться, инициируя транскрипцию. Однако в большинстве случаев другие элементы последовательности, отличные от TATA-мотива, необходимы для точной транскрипции. Было обнаружено, что такие элементы последовательности (например, энхансеры) повышают общий уровень экспрессии близлежащих генов, часто независимым от положения и/или ориентации образом. Другие последовательности вблизи участка старта транскрипции (например, последовательности INR) некоторых генов polII могут обеспечивать альтернативный участок связывания для факторов, которые также вносят вклад в активацию транскрипции, даже альтернативно обеспечивать участки связывания корового промотора для транскрипции в случае промоторов, в которых отсутствуют функциональные TATA-элементы. См., например, Zenzie-Gregory с соавторами (1992) J. Biol. Chem. 267: 2823-30.

Другие элементы регуляции генов включают последовательности, которые взаимодействуют со специфичными ДНК-связывающими факторами. Такие мотивы последовательностей иногда называют цис-элементами, и они обычно зависят от положения и ориентации, хотя они могут быть обнаружены с 5ʹ- или 3ʹ-стороны от колирующей последовательности гена или в интроне. Такие цис-элементы с которыми связываются специфичные для ткани или специфичные для стадии развития факторы транскрипции, отдельно или в сочетании, могут определять пространственно-временную картину экспрессии с промотора на уровне транскрипции. Расположение вышележащих цис-элементов с последующим минимальным промотором обычно обеспечивает полярность конкретного промотора. Промоторы растений, которые были клонированы и широко использованы как для фундаментальных исследований, так и для биотехнологических применений, обычно являются однонаправленными, управляющими только одним геном, который был слит с их 3'-концом (т.е., ниже). См., например, публикации Xie с соавторами (2001) Nat. Biotechnol. 19(7): 677-9; патент США № 6388170.

Множество цис-элементов (или «вышележащих регуляторных последовательностей») было идентифицировано в растительных промоторах. Такие цис-элементы широко варьируют по типу регуляции, которую они оказывают по отношению к оперативно связанным генам. Некоторые элементы действуют, увеличивая транскрипцию оперативно связанных генов в ответ на сигналы окружающей среды (например, температуру, влажность и ранение). Другие цис-элементы могут отвечать на сигналы в ходе развития (например, прорастание, созревание семян и цветение) или на пространственную информацию (например, тканевую специфичность). См., например, Langridge с соавторами (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3219-23. Тип регуляции конкретными промоторными элементами обычно является качеством, присущим промотору; т.е., гетерологичный ген под контролем такого промотора вероятно должен экспрессироваться в соответствие с регуляцией нативного гена, из которого был выделен промоторный элемент. Такие элементы обычно также можно заменить другими элементами и сохранить при этом характерный присущий им тип регуляции генной экспрессии.

Часто необходимо введение множества генов в растения для метаболической инженерии и объединения признаков, и такие гены часто регулируются идентичными или гомологичными промоторами. Однако вероятно возникает основанный на гомологии сайленсинг генов (HBGS) в случае, когда множество введенных трансгенов имеют гомологичные промоторы, которые ими управляют. См., например, Mol с соавторами: (1989) Plant Mol. Biol. 13: 287-94. Сообщалось, что HBGS часто возникает в трансгенных растениях. См., например, Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17: 29-35. Было предложено несколько механизмов для объяснения явления HBGS, и характерным признаком всех таких механизмов является тот факт, что гомология последовательностей в промоторе запускает механизмы клеточного узнавания, которые приводят к сайленсингу повторяющихся генов. См., например, Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; и Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78.

Методики, позволяющие избегать HBGS в трансгенных растениях, часто заключаются в разработке синтетических промоторов, которые функционально эквивалентны, но имеют минимальную гомологию последовательностей. В случае применения таких синтетических промоторов для экспрессии трансгенов в культурных растениях, они помогают избегать или уменьшать HBGS. См., например, публикации Mourrain с соавторами, (2007) Planta 225(2): 365-79; Bhullar с соавторами (2003) Plant Physiol. 132: 988-98. Такие промоторы могут быть созданы встраиванием известных цис-элементов в новый или синтетический участок ДНК или альтернативно «перестановкой доменов», при этом домены одного промотора заменяют функционально эквивалентными доменами других гетерологичных промоторов.

Таким образом, остается необходимость в конструкциях и способах для эффективной стабильной экспрессии множественных трансгенов с минимальным риском рекомбинации или утраты трансгенов в ходе селекции или множества поколений трансгенных растений.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны способы превращения полярного промотора Ubi1 в синтетические двунаправленные промоторы, так чтобы один синтетический промотор мог управлять экспрессией двух генов, фланкирующих промотор. В некоторых вариантах способ превращения полярного промотора Ubi1 в синтетический двунаправленный промотор может включать, например и без ограничения, идентификацию нуклеотидной последовательности минимального промоторного элемента промотора Ubi1; и/или получение нуклеиновой кислоты, содержащей две нуклеотидные последовательности минимального промоторного элемента Ubi1, ориентированные в противоположных направлениях. В конкретных вариантах нуклеиновая кислота может содержать две нуклеотидные последовательности минимального промоторного элемента Ubi1, ориентированные в противоположных направлениях, так что конец каждого минимального промоторного элемента, который расположен ближе всего к соответствующему нативному гену Ubi1, находится дальше от другого минимального промоторного элемента, чем конец нуклеиновой кислоты, который соседствует с кодирующей последовательностью, оперативно связанной с промоторным элементом. В некоторых примерах минимальный промоторный элемент Ubi1 выделяют из кукурузы. Дополнительные элементы нативного промотора Ubi1, которые могут быть сконструированы для включения в синтетический двунаправленный промотор, включают интроны Ubi1, экзоны Ubi1 и/или всю или часть области, лежащей выше промотора Ubi1. В некоторых примерах синтетический двунаправленный промотор может содержать больше одной из описанных выше областей.

Также в настоящем описании описаны минимальные промоторы Ubi1, которые могут быть применимы при конструировании синтетических промоторов (например, синтетических двунаправленных промоторов), и особенно синтетических промоторов, получаемых описанными выше способами. В некоторых вариантах синтетический двунаправленный промотор представляет собой промотор, который способен контролировать транскрипцию оперативно связанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке. Например, в конкретных вариантах синтетический двунаправленный промотор может обладать способностью контролировать транскрипцию в растительной клетке двух оперативно связанных нуклеотидных последовательностей, которые фланкируют промотор.

Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к клеткам (например, растительным клеткам), содержащим минимальный промотор Ubi1 или его функциональный эквивалент. Например, конкретные варианты включают клетку, содержащую синтетический промотор (например, синтетический двунаправленный промотор), который содержит минимальный промотор Ubi1 или его функциональный эквивалент. Растительные клетки согласно конкретным вариантам могут быть представлены в виде культуры клеток, ткани, части растения и/или целого растения. Таким образом, растение (например, однодольное или двудольное), содержащее клетку, которая содержит минимальный промотор Ubi1 или его функциональный эквивалент, включено в некоторые варианты осуществления изобретения.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к средствам для инициации транскрипции независимым от направления образом. Средства для инициации транскрипции независимым от направления образом включают минимальный промотор Ubi1 SEQ ID NO: 1. Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к средствам для инициации транскрипции двух представляющих интерес оперативно связанных нуклеотидных последовательностей. Средства для инициации транскрипция двух представляющих интерес оперативно связанных нуклеотидных последовательностей включают синтетический двунаправленный промотор Ubi1 SEQ ID NO: 5.

Вышеуказанные и другие отличительные признаки будут более понятными из следующего подробного описания нескольких вариантов осуществления изобретения, которое следует далее со ссылкой на прилагаемые фигуры.

Также изобретение относится к конструкциям и способам экспрессии множественных генов в растительных клетках и/или тканях растений. Конструкции по изобретению содержат по меньшей мере один двунаправленный промотор, связанный с несколькими кассетами экспрессии генов. В некоторых вариантах в конструкциях и способах по изобретению используют двунаправленный промотор, основанный на минимальном коровом промоторном элементе гена убиквитина-1 Zea mays или его функциональном эквиваленте. В некоторых вариантах конструкции и способы по изобретению обеспечивают возможность экспрессии от трех до двадцати генов.

В одном аспекте изобретение относится к синтетическому полинуклеотиду, содержащему минимальный коровый промоторный элемент из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В одном варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплементу. В следующем или альтернативном варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-39. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит последовательность SEQ ID NO: 1 или ее комплемент. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплемента. В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит экзон из гена убиквитина-1 и интрон из гена убиквитина-1. В следующем варианте экзон или интрон получены из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians.

В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит вышележащую регуляторную последовательность из гена убиквитина-1. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 4 или ее комплементу. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее комплемент. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 4 или ее комплемента.

В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из списка, содержащего вышележащую регуляторную последовательность (URS), энхансерный элемент, экзон, интрон, участок старта транскрипции, TATA-бокс и консенсусный элемент теплового шока. В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с минимальным коровым промоторным элементом. В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит элемент, выбранный из группы, состоящей из вышележащей регуляторной последовательности (URS), энхансерного элемент, экзона, интрона, участка старта транскрипции, TATA-бокса, консенсусного элемента теплового шока и их сочетания. В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с минимальным коровым промоторным элементом.

В другом варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит второй минимальный коровый промоторный элемент из Zea mays или Zea luxurians, при этом два минимальных коровых промоторных элемента находятся в полинуклеотиде в обратной комплементарной ориентации по отношению друг к другу. В следующем или альтернативном варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит экзон из гена убиквитина-1 и интрон из гена убиквитина-1. В следующем варианте синтетический полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 3 или ее комплементу. В следующем варианте синтетический полинуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO: 3 или ее комплемент. В следующем варианте синтетический полинуклеотид по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 3 или ее комплемента.

В следующем или альтернативном варианте синтетический полинуклеотид дополнительно содержит вышележащую регуляторную последовательность из гена убиквитина-1. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 4 или ее комплементу. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO: 4 или ее комплемент. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 4 или ее комплемента.

В другом варианте синтетический полинуклеотид, содержащий два минимальных коровых промоторных элемента, дополнительно содержит по меньшей мере один элемент выбранный из списка, содержащего вышележащую регуляторную последовательность (URS), экзон, интрон, участок старта транскрипции, TATA-бокс, консенсусный элемент теплового шока и нуклеотидную последовательность старта и/или остановки трансляции. В следующем или альтернативном варианте синтетический полинуклеотид, содержащий два минимальных коровых промоторных элемента, дополнительно содержит элемент, выбранный из группы, состоящей из вышележащей регуляторной последовательности (URS), экзона, интрона, участка старта транскрипции, TATA-бокса, консенсусного элемента теплового шока, нуклеотидной последовательности старта и/или остановки трансляции и их сочетания. В следующем варианте синтетический полинуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO: 5 или ее комплемент. В следующем варианте синтетический полинуклеотид по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 5 или ее комплемента.

В другом варианте синтетический полинуклеотид, содержащий два минимальных коровых промоторных элемента, содержит первую представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с одним из минимальных коровых промоторных элементов. В следующем варианте синтетический полинуклеотид, содержит вторую представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с минимальным коровым промоторным элементом, который оперативно не связан с первой представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

В одном варианте синтетического полинуклеотида по изобретению экзон получен из гена убиквитина-1 видов Zea. В одном варианте предлагаемого синтетического полинуклеотида экзон получен из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В другом варианте интрон получен из гена убиквитина-1 видов Zea. В другом варианте интрон получен из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В следующем или альтернативном варианте видом Zea является Zea mays. В другом варианте видом Zea является Zea luxurians.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения трансгенной клетки. Способы включают трансформацию клетки синтетическим полинуклеотидом, описанным в настоящем описании. В одном варианте клетка является растительной клеткой. В другом аспекте изобретение относится к растительной клетке, содержащей синтетический полинуклеотид, описанный в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к растению, содержащему растительную клетку, содержащую синтетический полинуклеотид, описанный в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растительной клетке. Способ включает введение в растительную клетку представляющей интерес нуклеотидной последовательности, оперативно связанной со средствами для инициации транскрипции независимым от направления образом. В другом аспекте изобретение относится к способу экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растительной клетке. Способ включает введение в растительную клетку представляющей интерес нуклеотидной последовательности, оперативно связанной со средствами для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей. В следующем варианте способ включает введение в растительную клетку нуклеиновой кислоты, содержащей: (a) представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную со средствами для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей; и (b) вторую представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную со средствами для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей.

В следующем или альтернативном варианте средства для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей включают последовательность SEQ ID NO: 5 или ее комплемент. В следующем или альтернативном варианте средства для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей включают последовательность SEQ ID NO: 5. В другом варианте средства для инициации транскрипции двух оперативно связанных представляющих интерес нуклеотидных последовательностей включают комплемент последовательности SEQ ID NO: 5. В другом варианте нуклеиновую кислоту вводят в растительную клетку так, чтобы целенаправленно встроить представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную со средствами для инициации транскрипции двух представляющих интерес оперативно связанных нуклеотидных последовательностей в предварительно определяемый участок в ДНК растительной клетки. В следующем или альтернативном варианте представляющую интерес нуклеотидную последовательность, оперативно связанную со средствами для инициации транскрипции двух представляющих интерес оперативно связанных нуклеотидных последовательностей целенаправленно встраивают в предварительно определяемый участок, используя рекомбинацию, опосредованную нуклеазами с цинковыми пальцами.

В другом аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты для экспрессии множественных генов в растительных клетках и/или тканях. Конструкция нуклеиновой кислоты содержит (a) двунаправленный промотор; и (b) две кассеты экспрессии генов на противоположных концах двунаправленного промотора; при этом по меньшей мере одна из кассет экспрессии генов содержит два или больше генов, связанных через переключатель трансляции.

В одном варианте конструкция нуклеиновой кислоты не содержит вирусной последовательности. В другом варианте двунаправленный промотор не содержит вирусной последовательности. В другом варианте двунаправленный промотор содержит по меньшей мере один энхансер. В другом варианте двунаправленный промотор не содержит энхансера. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты содержит бинарный вектор для опосредованной Agrobacterium трансформации.

В одном варианте двунаправленный промотор содержит элемент, выбранный из группы, состоящей из цис-элемента или вышележащей регуляторной последовательности (URS), энхансерного элемента, экзона, интрона, участка старта транскрипции, TATA-бокса, консенсусного элемента теплового шока и их сочетания. В следующем или альтернативном варианте двунаправленный промотор содержит вышележащую регуляторную последовательность (URS) из гена убиквитина. В следующем варианте двунаправленный промотор содержит (i) промотор, отличный от промотора гена убиквитина, и (ii) вышележащую регуляторную последовательность (URS) из гена убиквитина.

В другом варианте двунаправленный промотор содержит минимальный коровый промоторный элемент из гена убиквитина-1 Zea mays или Zea luxurians. В другом варианте двунаправленный промотор дополнительно содержит второй минимальный коровый промотор из Zea mays или Zea luxurians, при этом два минимальных коровых промоторных элемента находятся в обратной комплементарной ориентации по отношению друг к другу. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1 или ее комплементу. В следующем или альтернативном варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-39. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-34. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-29. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-24. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 15-19. В следующем варианте минимальный коровый промоторный элемент содержит полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.

В следующем или альтернативном варианте двунаправленный промотор содержит экзон из гена убиквитина-1 и/или интрон из гена убиквитина. В следующем варианте двунаправленный промотор содержит полинуклеотид по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичный последовательности SEQ ID NO: 3 или ее комплементу. В следующем варианте двунаправленный промотор содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 3 или его комплемент. В другом варианте двунаправленный промотор содержит интрон из гена алкогольдегидрогеназы. В одном варианте конструкцией нуклеиновой кислоты стабильно трансформированы трансгенные растения. В одном варианте растения являются однодольными растениями. В другом варианте растения являются двудольными растениями. В другом варианте растения не являются однодольными растениями. В другом варианте растения не являются двудольными растениями.

В следующем или альтернативном варианте двунаправленный промотор содержит вышележащую регуляторную последовательность из гена убиквитина. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность из гена убиквитина содержит полинуклеотид с последовательностью по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 4 или ее комплементу. В следующем варианте вышележащая регуляторная последовательность из гена убиквитина содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4 или его комплемент. В другом варианте двунаправленный промотор содержит полинуклеотид по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичный последовательности SEQ ID NO: 5 или ее комплементу. В другом варианте двунаправленный промотор содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 5 или его комплемент.

В одном варианте обе кассеты экспрессии генов содержат два или более генов, связанных через переключатель трансляции. В следующем или альтернативном варианте переключатель трансляции выбран из группы, состоящей из внутреннего участка связывания рибосомы (IRES), альтернативного сайта сплайсинга, сайта расщепления рибозимом, полинуклеотидной последовательности, кодирующей пептид 2A, полинуклеотидной последовательности, кодирующей 2A-подобный пептид, полинуклеотидной последовательности, кодирующей интеин, полинуклеотидной последовательности, кодирующей сайт расщепления протеазой и их сочетания. В следующем или альтернативном варианте переключатель трансляции содержит цис-действующий элемент гидролазы (CHYSEL). В следующем варианте CHYSEL представляет собой последовательность пептида 2A или 2A-подобного пептида. В другом варианте ген, расположенный выше переключателя трансляции, не содержит стоп-кодона трансляции. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты позволяет или делает возможной экспрессию по меньшей мере четырех генов. В следующем варианте все четыре гена являются трансгенами. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты обеспечивает возможность экспрессии от трех до двадцати генов. В другом варианте конструкция нуклеиновой кислоты обеспечивает возможность экспрессии от четырех до восьми генов. В следующем или альтернативном варианте гены являются трансгенами. В другом варианте по меньшей мере одна кассета экспрессии содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок. В следующем варианте слитый белок содержит от трех до пяти генов.

В некоторых вариантах экспрессия генов с двунаправленного промотора по меньшей мере в четыре раза выше, чем с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах экспрессия генов с двунаправленного промотора от трех до десяти раз выше, чем с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах экспрессия генов с двунаправленного промотора в четыре-восемь раз выше, чем с однонаправленного промотора. В некоторых вариантах маркерный ген для селекции помещают на дальнем конце от промотора (т.е., на 3ʹ-конце кассеты экспрессии генов ниже другого гена).

В другом аспекте изобретение относится к способу получения трансгенного растения, включающему трансформацию растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к способу получения трансгенной клетки, включающему трансформацию клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к растительной клетке, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В следующем или альтернативном варианте конструкцией нуклеиновой кислоты стабильно трансформирована растительная клетка. В другом аспекте изобретение относится к трансгенному растению, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В следующем или альтернативном варианте конструкцией нуклеиновой кислоты стабильно трансформированы клетки трансгенного растения. В другом аспекте изобретение относится к способу экспрессии множественных генов в растительных клетках и/или тканях, включающему введение в растительные клетки и/или ткани конструкции нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В следующем или альтернативном варианте растительные клетки и/или ткани стабильно трансформированы конструкцией нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к бинарному вектору для опосредованной Agrobacterium трансформации. В одном варианте бинарный вектор содержит конструкцию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В другом варианте бинарный вектор содержит синтетический полинуклеотид согласно настоящему изобретению. В другом аспекте изобретение относится к применению двунаправленного промотора согласно настоящему изобретению для экспрессии множественных трансгенов в растениях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

На фиг. 1 показан примерный (не в масштабе) промотор кукурузы Ubi1 (ZmUbi1), который содержит приблизительно 900 п.н. вышерасположенного элемента, локализованного с 5ʹ-стороны от участка старта транскрипции (TSS). Вышерасположенный элемент содержит TATA-бокс (локализованный приблизительно в положении -30 п.н. от TSS) и два перекрывающихся консенсусных элемента теплового шока (локализованных приблизительно -200 п.н. от TSS). Указанный промотор также содержит примерно 1100 п.н. с 3ʹ-сторонв от области TSS. Такая 3ʹ-область содержит близлежащую лидерную последовательность (экзона ZmUbi1) и интрон.

На фиг. 2 показан примерный вариант предлагаемого синтетического двунаправленного промотора Ubi1, который содержит минимальный коровый элемент minUbi1P, клонированный выше (в обратной комплементарной ориентации) промотора ZmUbi1.

На фиг. 3 показано примерное схематичное изображение кассет экспрессии генов yfp и GUS, каждый из которых оперативно связан с синтетическим двунаправленным промотором Ubi1.

На фиг. 4 показана типичная карта плазмиды pDAB105801.

На фиг. 5 показана типичная карта плазмиды pDAB 108706.

На фиг. 6 показана типичная карта плазмиды pDAB101556.

На фиг. 7A показана последовательность SEQ ID NO: 1, которая содержит область длиной 215 п.н. минимального корового промотора Ubi1 Zea mays (minUbi1P). На фиг. 7B показана последовательность SEQ ID NO: 2, которая содержит интрон Ubi1 Z. mays.

На фиг. 8A показана последовательность SEQ ID NO: 3, которая содержит обратный комплемент полинуклеотида, содержащего минимальный коровый промотор minUbi1P Z. mays (подчеркнут); лидер Ubi1 Z. mays (экзон ZmUbi1; жирным шрифтом); и интрон Ubi1 Z. mays (строчными буквами). На фиг. 8B показана последовательность SEQ ID NO: 4, которая содержит участок вышележащего элемента Ubi1 Z. mays, и такой элемент (и/или его обратный комплемент) может быть локализован в синтетическом промоторе Ubi1, при этом элемент minUbi1P расположен рядом с его 5ʹ- или 3’-концом.

На фиг. 9 показана последовательность SEQ ID NO: 5, которая содержит примерный синтетический двунаправленный промотор Ubi1, при этом обратный комплемент первого minUbi1P и второго minUbi1P подчеркнуты.

На фиг. 10 показана последовательность SEQ ID NO: 6, которая содержит примерную нуклеиновую кислоту, содержащую кассеты экспрессии генов yfp и GUS, управляемые синтетическим двунаправленным промотором Ubi1.

Последовательность SEQ ID NO: 7 содержит прямой праймер: 5ʹ-GATGCCTCAG TGGGAAAGG-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 8 содержит обратный праймер YFP: 5ʹ-CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 9 содержит прямой праймер инвертазы: 5ʹ-TGGCGGACGA CGACTTGT-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 10 содержит обратный праймер инвертазы: 5ʹ-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3ʹ. SEQ ID NO: 11 содержит зонд инвертазы: 5ʹ-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 12 содержит прямой праймер AAD1: 5ʹ-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 13 содержит обратный праймер AAD1: 5ʹ-CAACATCCAT CACCTTGACT GA-3ʹ. Последовательность SEQ ID NO: 14 содержит зонд AAD1: 5ʹ-CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3ʹ (также см. таблицу 7).

На фиг. 11 показан типичный Вестерн-блот-анализ, подтверждающий стабильную экспрессию YFP и GUS, управляемую двунаправленной промоторной конструкцией убиквитина-1 Z. mays (pDAB 108706), в растениях кукурузы T₀. В типичных растениях наблюдали стабильную экспрессию YFP в листе, управляемую минимальным коровым промоторным элементом Min-UbiP1. Количество белка, которое было продуцировано, показано в частях на миллион (ч/млн).

На фиг. 12 показан типичный Вестерн-блот-анализ, показывающий стабильную экспрессию YFP и GUS с контрольной конструкции, содержащей промотор ZmUbi1, который управляет только экспрессией YFP (pDAB101556); кодирующая последовательность GUS не входит в состав такой конструкции. Количество белка, которое было продуцировано указано в частях на миллион (ч/млн).

На фиг. 13A показаны примерные конструкции блоков кассет четырех генов pDAB105843 [видны две кассеты AAD1-2A-YFP (или Phiyfp) плюс Cry34-2A-Cry35] и pDAB105846 [видны две кассеты YFP (или Phiyfp)-2A-AAD1 плюс Cry34-2A-Cry35]. Заштрихованные стрелки указывают направление транскрипции с двунаправленного промотора. Ubi1-minP содержит 200-нуклеотидную последовательность выше участка старта транскрипции промотора Ubi1 кукурузы. Ubi1-URS содержит вышерасположенную регуляторную область промотора Ubi1 кукурузы, состоящую из последовательности выше участка старта транскрипции, за исключением 200-нуклеотидного минимального промотора (показан в виде стрелки). Ubi1-Int содержит интрон промотора Ubi1 кукурузы. На фиг. 13B показаны дополнительные примерные бинарные конструкции блоков четырехгенных кассет из pDAB108717 и pDAB108718.

На фиг. 14 показаны примерные схематичные представления конструкций с множественными генами, предлагаемых в настоящем описании. Переключение трансляции показано с использованием специального символа.

На фиг. 15 показаны типичные карты плазмид pDAB105818 и pDAB 105748.

На фиг. 16 показаны типичные карты плазмид pDAB105803 и pDAB105840.

На фиг. 17 показаны типичные карты плазмид pDAB105841 и pDAB105842.

На фиг. 18 показаны типичные карты п