Молекулы нуклеиновых кислот, которые придают устойчивость к насекомым-вредителям отряда жесткокрылых

Молекулы нуклеиновых кислот, которые придают устойчивость к насекомым-вредителям отряда жесткокрылых

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

Данной заявкой заявлен приоритет даты подачи Предварительной Патентной Заявки Соединенных Штатов № 61/428592 от 30 декабря 2010 г., «Молекулы Нуклеиновых Кислот, Которые Придают Устойчивость к Насекомым-Вредителям Отряда Жесткокрылых».

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в основном относится к генетическому контролю за повреждением растений, вызванным насекомыми-вредителями отряда жесткокрылых. В конкретных воплощениях настоящее изобретение относится к идентификации кодирующих и некодирующих последовательностей-мишеней, и к применению технологий рекомбинантных ДНК для посттранскрипционной супрессии и ингибирования экспрессии кодирующих и некодирующих последовательностей-мишеней в клетках насекомых-вредителей отряда жесткокрылых с получением защитного эффекта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Западный кукурузный жук (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, представляет собой наиболее опустошительный вид кукурузных жуков в Северной Америке, и это особенно касается областей выращивания кукурузы Среднего Запада Соединенных Штатов. Северный кукурузный жук (NCR), Diabrotica barberi Smith and Lawrence, является близкородственным видом, который обитает на большей части той же области распространения, что и WCR. Существует несколько других родственных подвидов Diabrotica, которые являются существенно-значимыми насекомыми-вредителями в Северной Америке: мексиканский кукурузный жук (MCR), D. virgifera zeae Krysan and Smith; южный кукурузный жук (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; и D. u. undecimpunctata Mannerheim. По оценкам Департамента Сельского Хозяйства Соединенных Штатов в настоящее время кукурузные жуки каждый год вызывают потери годового дохода 1 биллион долларов, включая $800 миллионов от потери урожая и $200 миллионов затрат на обработку.

Оба WCR и NCR летом находятся в почве в виде яиц. Насекомые остаются на стадии яиц на протяжении зимы. Яйца имеют продолговатую форму, белые и длиной менее чем 0,004 дюйма (0,010 см). Личинки выводятся в конце мая или в начале июня с точным временем выведения яиц, которое варьируется от года к году из-за температурных различий и в зависимости от местоположения. Только что выведенные личинки представляют собой белых червяков длиной менее чем 0,125 дюйма (0,3175 см). После выведения личинка начинает питаться на кукурузных корнях. Кукурузные жуки проходят через три личиночные стадии. После питания в течение нескольких недель личинка линяет до стадии куколки. Они окукливаются в почве, и затем они выходят из почвы в виде зрелых личинок в июле и в августе. Зрелые личинки достигают длины около 0,25 дюйма (0,635 см).

Личинки кукурузного жука завершают развитие на кукурузе и на некоторых других видах трав. Личинки, которые выводятся на желтом лисохвосте, появляются позже и в зрелом состоянии имеют меньший размер головной капсулы, чем у личинок, которые выводятся на кукурузе. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Зрелые WCR питаются кукурузными рыльцами, пыльцой и зернами на открытых початках кукурузы. Если зрелые WCR появляются перед тем как появятся репродуктивные ткани кукурузы, они могут питаться тканями листьев, замедляя таким образом рост растения и периодически убивая растение-хозяин. Однако зрелые особи быстро переключаются на предпочтительные пыльцу и кукурузные рыльца, когда они становятся доступными. Зрелые NCR также питаются репродуктивными тканями кукурузного растения, но в отличие от других редко питаются листьями кукурузы.

Большинство повреждений кукурузы личинками вызвано их питанием. Только что вылупившиеся личинки сначала питаются тонким кукурузным корневым волоском и проникают в корневые кончики. По мере увеличения роста личинок они питаются и проникают в первичный корень. Когда кукурузных жуков в избытке, то личиночное питание часто приводит к подрезанию корней по всей длине до основания стебля кукурузы. Серьезные корневые повреждения мешают способности корня транспортировать воду и питательные вещества в растение, снижается рост растения, и это приводит к снижению производства зерна, и часто таким образом значительно снижается общий урожай. Серьезные корневые повреждения также часто приводят к полеганию кукурузных растений, что затрудняет сбор урожая и дополнительно его снижает. Кроме того, питание зрелых особей на репродуктивных тканях кукурузы может привести к подрезанию рылец на верхушке початка кукурузы. Если это достаточно серьезное «срезание рыльца» происходит в процессе сброса пыльцы, то опыление может быть нарушено.

Могут осуществляться попытки контроля за кукурузным жуком с помощью ротации культур, химических инсектицидов, биопестицидов (например, спорообразующей грамположительной бактерии, Bacillus thuringiensis) или с помощью их комбинации. Ротация культур страдает значительным недостатком нежелательных ограничений размещения при использовании сельскохозяйственной земли. Кроме того, откладка яиц некоторых видов кукурузных жуков может осуществляться на соевых полях, ослабляя таким образом эффективность ротации культур, которую практикуют для кукурузы и сои.

Химические инсектициды представляют собой наиболее надежную стратегию достижения контроля за кукурузным жуком. Применение химических инсектицидов, тем не менее, представляет собой несовершенную стратегию контроля за кукурузным жуком; около $1 биллиона может быть потеряно в Соединенных Штатах каждый год из-за кукурузного жука, когда затраты на химические инсектициды добавляются к затратам от заражения кукурузным жуком, которые могут иметь место несмотря на использование инсектицидов. Высокая популяция личинок, сильные дожди и не соответствующее применение инсектицида(ов), все вместе может привести к неадекватному контролю за кукурузным жуком. Кроме того, в результате продолжительного применения инсектицидов могут быть выработаны штаммы жуков, устойчивых к инсектицидам, а также существенно повышается влияние экологического фактора благодаря токсичности многих из них по отношению к видам, которые не являются их мишенями.

РНК-интерференция (РНКи) это процесс применения эндогенных клеточных путей, посредством которых молекула интерферирующей РНК (иРНК) (например, молекула дцРНК), которая специфична для всей последовательности или для любой части адекватного размера последовательности гена-мишени, приводит к деградации мРНК, кодируемой им. В последние годы РНКи использовалась для осуществления "нокдауна" гена в ряде видов и в экспериментальных системах, например в C. elegans, в растениях, в эмбрионах насекомых и в клетках тканевых культур. См., например, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

РНКи осуществляет деградацию мРНК посредством эндогенного пути, включающего белковый комплекс DICER. DICER расщепляет длинные молекулы дцРНК до коротких фрагментов размером приблизительно 20 нуклеотидов, называемых короткие интерферирующие РНК (киРНК). киРНК разворачивается в две одноцепочечные РНК: сопровождающая цепь и направляющая цепь. Сопровождающая цепь деградирует, и управляющая цепь инкорпорируется в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC). Молекулы микроингибирующей рибонуклеиновой кислоты (миРНК) могут быть аналогично инкорпорированы в RISC. Посттранскрипционный сайленсинг генов происходит, когда направляющая цепь специфично связывается с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и индуцирует расщепление с помощью Argonaute, каталитического компонента комплекса RISC. Известно, что этот процесс системно распространен в организме несмотря на изначально ограниченные концентрации киРНК и/или миРНК в некоторых эукариотах, таких как растения, нематоды и некоторые насекомые.

Только транскрипты, комплементарные киРНК и/или миРНК, расщепляются и деградируют, и, таким образом, нокдаун экспрессии мРНК является специфичным к последовательности. В растениях существует несколько функциональных групп генов DICER. РНКи-эффект сайленсинга гена сохраняется в течение дней и в экспериментальных условиях может приводить к снижению количества транскрипта-мишени на 90% или более с последующим снижением уровня соответствующего белка.

Патент США 7612194 и патентные публикации США №№ US 2007/0050860, US 2010/0192265 и US 2011/0154545 раскрывают библиотеку из 9112 экспрессирующихся маркерных последовательностей (EST), выделенных из куколок D. v. virgifera LeConte. В патенте США 7612194 и в патентной публикации США № US 2007/0050860 предполагается, что с промотором функционально связана молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна одной из нескольких конкретных неполных последовательностей H⁺-ATPазы (V-ATPаза) D. v. virgifera вакуолярного типа, раскрытых в этих документах, для экспрессии антисмысловой РНК в растительных клетках. Патентная публикация США US 2010/0192265 рассматривает функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна конкретной неполной последовательности гена D. v. virgifera неизвестной и нераскрытой функции (установлено, что неполная последовательность на 58% идентична продукту гена C56C10.3 в C. elegans) для экспрессии антисмысловой РНК в растительных клетках. Патентная публикация США № US 2011/0154545 рассматривает функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна двум конкретным неполным последовательностям генов бета-субъединицы коатомера D. v. virgifera, для экспрессии антисмысловой РНК в растительных клетках. Кроме того, патент США 7943819 раскрывает библиотеку из 906 экспрессирующихся маркерных последовательностей (EST), выделенных из личинок, куколок и рассеченных маленьких насекомых D. v. virgifera LeConte, и рассматривает функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна конкретной неполной последовательности гена белка 4b заряженного мультивезикулярного тела D. v. virgifera, для экспрессии двухцепочечной РНК в растительных клетках.

Никаких других предположений для РНК-интерференции не предлагается в патентах США 7612194 и патентных публикациях США №№ US 2007/0050860, US 2010/0192265 и US 2011/0154545 по поводу применения любой конкретной последовательности из более чем девяти тысяч последовательностей, перечисленных там, за исключением нескольких конкретных неполных последовательностей V-ATPазы и конкретных неполных последовательностей генов неизвестной функции. Кроме того, ни в патенте США 7612194 и ни патентных публикациях США №№ US 2007/0050860 и US 2010/0192265, и US 2011/0154545 не предлагается никакого руководства по поводу того, какие другие из предложенных более девяти тысяч последовательностей будут летальны или применимы другим способом к видам кукурузных жуков при использовании этих последовательностей в виде дцРНК и киРНК. В патенте США 7943819 нет никаких предложений по поводу применения какой-либо конкретной последовательности из более чем девятисот последовательностей, перечисленных там, для РНК-интерференции, за исключением конкретной неполной последовательности гена белка 4b заряженного мультивезикулярного тела. Кроме того, в патенте США 7943819 не предлагается никакого руководства по поводу того, какие другие из предложенных более девятисот последовательностей будут летальны или применимы другим способом при их использовании в виде дцРНК и киРНК по отношению к видам кукурузных жуков.

Подавляющее большинство последовательностей, комплементарных ДНК кукурузного жука (такой как упомянутые выше), не летальны для видов кукурузных жуков при использовании в виде дцРНК и киРНК. Например, Baum et al. (2007) описывают эффекты ингибирования нескольких генов-мишеней WCR с помощью РНКи. Эти авторы сообщили, что 8 из 26 генов-мишеней, которые они протестировали, были не способны обеспечить экспериментально значимую смертность насекомых-вредителей отряда жесткокрылых при очень высокой концентрации иРНК (например, дцРНК) более чем 520 нг/см².

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты (например, гены-мишени, ДНК, дцРНК, киРНК, миРНК и шпРНК) и способы их применения для контроля за насекомыми-вредителями отряда жесткокрылых, включающими, например, D. v. virgifera LeConte (западный кукурузный жук, «WCR»); D. barberi Smith and Lawrence (северный кукурузный жук, «NCR»); D. u. howardi Barber (южный кукурузный жук, «SCR»); D. v. zeae Krysan and Smith (мексиканский кукурузный жук, «MCR»); D. balteata LeConte; D. u. Tenella, и D. u. undecimpunctata Mannerheim. В конкретных примерах раскрыты иллюстративные молекулы нуклеиновых кислот, которые могут быть гомологичны, по меньшей мере, части одной или нескольких нативных последовательностей нуклеиновых кислот генома насекомого-вредителя отряда жесткокрылых.

В этих и других примерах нативная последовательность нуклеиновой кислоты может быть геном-мишенью, продукт которой может быть, например и без ограничения: вовлечен в метаболический процесс; в репродуктивный процесс; или вовлечен в процесс развития личинки. В некоторых примерах посттрансляционное ингибирование экспрессии гена-мишени с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, ей гомологичную, может быть летальным для насекомых-вредителей отряда жесткокрылых или может приводить к снижению их роста и/или репродукции. В конкретных примерах, по меньшей мере, один ген, выбранный из списка, состоящего из D_vir_c47185_Caf1180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_vatpaseH и Contig_01_Rho1_1-191_CDC42, может быть выбран в качестве гена-мишени для посттрансляционного сайленсинга. В конкретных примерах ген-мишень, применяемый для посттрансляционного ингибирования, является новым геном, обозначенным в данном документе как D_vir_c47185_Caf1180. Таким образом, в данном документе раскрыты выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие последовательность D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1), комплементарную ей последовательность и фрагменты каждой из них.

Также раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который, по меньшей мере, на 85% идентичен аминокислотной последовательности продукта гена-мишени (например, продукта гена, выбранного из группы, состоящей из D_vir_c47185_Caf1180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH и Contig_01_Rho1_1-191_CDC42). В конкретных примерах молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который, по меньшей мере, на 85% идентичен аминокислотной последовательности продукта гена D_vir_c47185_Caf1180. Кроме того, раскрыты молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидную последовательность, которая обратно комплементарна нуклеотидной последовательности, кодирующую полипептид, по меньшей мере, на 85% идентичный аминокислотной последовательности в продукте гена-мишени.

Также раскрыты кДНК-последовательности, которые могут использоваться для получения молекул иРНК (например, дцРНК, киРНК, миРНК и шпРНК), которые комплементарны всей последовательности или части гена-мишени насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, например: D_vir_c47185_Caf1180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH и/или Contig_01_Rho1_1-191_CDC42. В конкретных воплощениях могут быть получены дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК in vitro или in vivo с помощью генетически модифицированного организма, такого как растение или бактерия. В конкретных примерах раскрыты кДНК-молекулы, которые могут использоваться для получения молекул иРНК, которые комплементарны всей последовательности или части гена D_vir_c47185_Caf1180.

Кроме того, раскрыты средства ингибирования экспрессии существенного гена в геноме насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, а также средства предоставления растению устойчивости к насекомому-вредителю отряда жесткокрылых. Средства ингибирования экспрессии существенного гена в геноме насекомого-вредителя отряда жесткокрылых представляют собой одноцепочечную или двухцепочечную молекулу РНК, состоящую из любой из SEQ ID NO:7, 8, 10, 11, 49, 50, 86, 87, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 127, 128, 129, 130, 131 или из комплементарных им последовательностей. Средства предоставления растению устойчивости к насекомому-вредителю отряда жесткокрылых представляют собой ДНК-молекулу, включающую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средства ингибирования экспрессии существенного гена в геноме насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, функционально связанного с промотором, где ДНК-молекула способна интегрироваться в геном растения кукурузы.

Раскрыты способы контроля за популяцией насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, включающие предоставление насекомому-вредителю отряда жесткокрылых молекулы иРНК (например, дцРНК. киРНК, миРНК и шпРНК), которая функционирует при поглощении насекомым-вредителем отряда жесткокрылых с ингибированием биологической функции в насекомом-вредителе отряда жесткокрылых, где молекула иРНК включает всю последовательность или часть нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:4; нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica (например, WCR), включающей всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO:1-4; последовательности, комплементарной нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica, включающей всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO:1-4; нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, включающей всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO:1-4; и последовательности, комплементарной нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, включающей всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO:1-4.

В конкретных примерах раскрыты способы контроля за популяцией насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, включающие предоставление насекомому-вредителю отряда жесткокрылых молекулы иРНК (например, дцРНК, киРНК, миРНК и шпРНК), которая функционирует при поглощении насекомым-вредителем отряда жесткокрылых с ингибированием биологической функции в насекомом-вредителе отряда жесткокрылых, где молекула иРНК включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: всей последовательности или части SEQ ID NO:1; последовательности, комплементарной всей последовательности или части SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; последовательности, комплементарной SEQ ID NO:4; всей последовательности или части нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica (например, WCR), включающей SEQ ID NO:1; всей последовательности или части последовательности, комплементарной нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica, включающей SEQ ID NO:1; всей последовательности или части нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, включающей SEQ ID NO:1; и всей последовательности или части последовательности, комплементарной нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, включающей SEQ ID NO:1.

Также в данном документе раскрыты способы, где дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК могут предоставляться насекомому-вредителю отряда жесткокрылых в анализе на основе питания или в генетически модифицированных растительных клетках, экспрессирующих дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК. В этих и в следующих примерах дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК могут поглощаться личинкой насекомого-вредителя отряда жесткокрылых. Поглощение дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК по изобретению может затем привести к РНКи в личинках, которая в свою очередь может привести к сайленсингу гена, существенного для жизнеспособности насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, и к смертности личинок. Таким образом, раскрыты способы, где насекомому-вредителю отряда жесткокрылых предоставляются молекулы нуклеиновой кислоты, включающие иллюстративные последовательности нуклеиновых кислот, применяемые для контроля за насекомыми-вредителями отряда жесткокрылых. В конкретных примерах насекомое-вредитель отряда жесткокрылых, контролируемое с помощью применения молекул нуклеиновых кислот по изобретению, может представлять собой WCR или NCR.

Все вышеописанное и другие признаки изобретения станут более очевидными на основе следующего подробного описания некоторых воплощений, которое начинается со ссылок на сопровождающие их чертежи.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 включает описание стратегии, используемой для получения специфических матриц для получения дцРНК.

ФИГ. 2 включает схему изменчивости ингибирования роста насекомых-вредителей отряда жесткокрылых, обработанных с использованием иллюстративных молекул нуклеиновых кислот.

ФИГ. 3 включает схему изменчивости смертности насекомых-вредителей отряда жесткокрылых, обработанных с использованием иллюстративных молекул нуклеиновых кислот.

ФИГ. 4 включает дополнительную схему изменчивости ингибирования роста насекомых-вредителей отряда жесткокрылых, обработанных с использованием иллюстративных молекул нуклеиновых кислот.

ФИГ. 5 включает динамическое изображение некоторых нуклеотидных последовательностей, которые могут присутствовать в определенных молекулах нуклеиновых кислот по изобретению. Там, где указано «(последовательность)», то это обозначает участок изображенной нуклеотидной последовательности, имеющей любую длину и конкретную последовательность, например и без ограничения непрерывный сегмент одной из SEQ ID NO:1-4. Участки изображенных нуклеотидных последовательностей, отмеченные курсивом, являются необязательными.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот, перечисленные в прилагающемся списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований, определенных в 37 C.F.R. § 1.822. Представлена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но понятно, что комплементарная и обратная комплементарная цепь также включены путем ссылки на представленную цепь. В прилагаемом списке последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет собой иллюстративную кДНК-последовательность Diabrotica, обозначенную в некоторых местах как D_vir_c47185_Caf1180 или Caf1-180.

SEQ ID NO:2 представляет собой иллюстративную кДНК-последовательность Diabrotica, обозначенную в некоторых местах как D_vir_c1229_VatpaseC или VatpaseC.

SEQ ID NO:3 представляет собой иллюстративную кДНК-последовательность Diabrotica, обозначенную в некоторых местах как D_vir_c1319_VatpaseH или VatpaseH.

SEQ ID NO:4 представляет собой иллюстративную кДНК-последовательность Diabrotica, обозначенную в некоторых местах как Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 или Rho1.

SEQ ID NO:5-8 представляют собой иллюстративные, расположенные непоследовательно фрагменты кДНК субъединицы С вакуолярной ATPазы Diabrotica.

SEQ ID NO:9-11 представляют собой иллюстративные, расположенные непоследовательно фрагменты кДНК субъединицы H вакуолярной ATPазы Diabrotica.

SEQ ID NO:12 представляет собой промоторную последовательность фага T7.

SEQ ID NO:13-38 представляют собой праймеры, используемые для амплификации областей кодирующих участков иллюстративных генов-мишеней с помощью ПЦР.

SEQ ID NO:39-48 представляют собой праймеры, используемые для амплификации участков генов Caf1-180 и VatpaseC для синтеза шпилечной РНК.

SEQ ID NO:49 представляет собой последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК Caf1-180, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136) для экспрессирующего вектора версии 1, который содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:50 представляет собой последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseC, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136) для вектора, экспрессирующего шпРНК, версии 1, который содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:51 представляет собой последовательность ДНК участка 1 аннексина.

SEQ ID NO:52 представляет собой последовательность ДНК участка 2 аннексина.

SEQ ID NO:53 представляет собой последовательность ДНК участка 1 бета-спектрина 2.

SEQ ID NO:54 представляет собой последовательность ДНК участка 2 бета-спектрина 2.

SEQ ID NO:55 представляет собой последовательность ДНК участка 1 mtRP-L4.

SEQ ID NO:56 представляет собой последовательность ДНК участка 2 mtRP-L4.

SEQ ID NO:57 представляет собой последовательность ДНК, кодирующей YFP.

SEQ ID NO:58-85 представляют собой праймеры, используемые для амплификации участков генов аннексина, бета-спектрина 2, mtRP-L4, и YFP, для синтеза дцРНК.

SEQ ID NO:86 представляет собой иллюстративный амплифицированный 260 п.о.-фрагмент кДНК D_vir_c47185_Caf1-180, который использовали в качестве матрицы для синтеза молекулы дцРНК.

SEQ ID NO:87-90 представляют собой иллюстративные, расположенные непоследовательно фрагменты кДНК Rho1 Diabrotica.

SEQ ID NO:91 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК Caf1-180, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), включающую необязательный сайт клонирования, фланкирующий интрон, для экспрессирующего вектора версии 1, который содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:92 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК Caf1-180, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136) для экспрессирующего вектора версии 2, который не содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:93 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseC, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), включающую необязательный сайт клонирования, фланкирующий интрон, для вектора, экспрессирующего шпРНК, версии 1, который содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:94 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseC, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136) для вектора, экспрессирующего шпРНК, версии 2, который не содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO:95 представляет собой иллюстративный сегмент смысловой цепи ДНК Caf1-180, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:96 представляет собой иллюстративный сегмент антисмысловой цепи ДНК Caf1-180 для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:97 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК Caf1-180, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:98 представляет собой иллюстративный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseC, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:99 представляет собой иллюстративный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseC для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:100 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseC, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 3.

SEQ ID NO:101 представляет собой иллюстративный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseC, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 4.

SEQ ID NO:102 представляет собой иллюстративный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseC для экспрессирующего вектора версии 4.

SEQ ID NO:103 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseC, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 4.

SEQ ID NO:104 представляет собой иллюстративный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseH, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:105 представляет собой иллюстративный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseH для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:106 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК VatpaseH, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:107 представляет собой иллюстративный сегмент смысловой цепи ДНК Rho1, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:108 представляет собой иллюстративный сегмент антисмысловой цепи ДНК Rho1 для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:109 представляет собой иллюстративную последовательность ДНК, образующую шпилечную РНК Rho1, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO:136), для экспрессирующего вектора версии 1.

SEQ ID NO:110 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК Caf-180, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:111 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК участка 1 VatpaseC, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:112 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК участка 1 (короткий) VatpaseC, используемый для матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:113 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК участка 2 VatpaseC, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:114 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК участка 1 VatpaseH, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:115 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК участка 2 VatpaseH, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:116 представляет собой иллюстративный сегмент ДНК Rho1, используемый для обеспечения матрицы для синтеза дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:117 представляет собой иллюстративную смысловую цепь РНК VatpaseC («VatpaseC5’-15»), используемую в качестве дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:118 представляет собой дополнительную иллюстративную смысловую цепь РНК VatpaseC («VatpaseC5’-25»), используемую в качестве дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:119 представляет собой дополнительную иллюстративную смысловую цепь РНК VatpaseC («VatpaseC3’-15»), используемую в качестве дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:120 представляет собой дополнительную иллюстративную смысловую цепь РНК VatpaseC («VatpaseC3’-25»), используемую в качестве дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:121-126 представляют собой праймеры, используемые для амплификации областей гена VatpaseC Diabrotica в качестве матриц для синтеза дцРНК.

SEQ ID NO:127 представляет собой иллюстративную смысловую цепь VatpaseC («VatpaseC5’-50»), используемую в качестве матрицы для дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:128 представляет собой иллюстративную смысловую цепь VatpaseC («VatpaseC5’-100»), используемую в качестве матрицы для дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:129 представляет собой иллюстративную смысловую цепь VatpaseC («VatpaseC-174»), используемую в качестве матрицы для дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:130 представляет собой иллюстративную смысловую цепь VatpaseC («VatpaseC3’-50»), используемую в качестве матрицы для дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:131 представляет собой иллюстративную смысловую цепь VatpaseC («VatpaseC3’-100»), используемую в качестве дцРНК в биоанализе диетического питания.

SEQ ID NO:132-135 представляют собой праймеры, используемые для молекулярных анализов трансгенной кукурузы.

SEQ ID NO:136 представляет собой интрон ST-LS1, который может использоваться в некоторых воплощениях для образования шпилечной РНК.

SEQ ID NO:137-138 представляют собой иллюстративные, расположенные непоследовательно фрагменты кДНК Rho1 Diabrotica.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Обзор некоторых воплощений

В данном документе раскрыты способы и композиции для генетического контроля за заражением насекомым-вредителем отряда жесткокрылых. Также предлагаются способы идентификации одного или нескольких генов, существенных для жизненного цикла насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, для применения в качестве гена-мишени для РНК-опосредованного контроля за популяцией насекомых-вредителей отряда жесткокрылых. ДНК-плазмидные векторы, кодирующие молекулы дцРНК, могут быть сконструированы для подавления одного или нескольких генов-мишеней, существенных для роста, выживания, развития и/или репродукции. В некоторых воплощениях предлагаются способы посттранскрипционной репрессии экспрессии или ингибирования гена-мишени посредством молекул нуклеиновых кислот, которые комплементарны кодирующей или некодирующей последовательности гена-мишени насекомого-вредителя отряда жесткокрылых. В этих и других воплощениях насекомое-вредитель отряда жесткокрылых может поглощать одну или несколько молекул дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК, транскрибированных со всей последовательности или с части молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна кодирующей или некодирующей последовательности гена-мишени, обеспечивая, таким образом, растению защитный эффект.

Таким образом, некоторые воплощения включают специфичное к последовательности ингибирование экспрессии продукта гена-мишени, используя дцРНК, киРНК, миРНК и/или шпРНК, которые комплементарны кодирующим и/или некодирующим последовательностям генов-мишеней, для достижения, по меньшей мере, частичного контроля за насекомым-вредителем отряда жесткокрылых. Раскрыт набор выделенных и очищенных молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеотидную последовательность, например, представленную в одной из SEQ ID NO:1-4, а также их фрагменты. В некоторых воплощениях стабилизированная молекула дцРНК может экспрессироваться с последовательностей, их фрагментов или с гена, включающего одну из этих последовательностей, для посттранскрипционного сайленсинга или ингибирования гена-мишени. В некоторых воплощениях выделенные и очищенные молекулы нуклеиновых кислот включают всю последовательность или часть SEQ ID NO:1.

Некоторые воплощения включают в себя рекомбинантную клетку-хозяина (например, растительную клетку), содержащую в своем геноме, по меньшей мере, одну рекомбинантную последовательность ДНК, кодирующую, по меньшей мере, одну молекулу(ы) иРНК (например, дцРНК). В конкретных воплощениях молекула(ы) дцРНК может экспрессироваться при поглощении насекомым-вредителем отряда жесткокрылых с получением эффекта посттранскрипционного сайленсинга или ингибирования экспрессии гена-мишени у насекомого-вредителя отряда жесткокрылых. Рекомбинантная последовательность ДНК может включать, например, любую из SEQ ID NO:1-4, фрагменты любой из SEQ ID NO:1-4 или неполную последовательность гена, включающую одну из SEQ ID NO:1-4, или комплементарные им последовательности.

Конкретные воплощения включают рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую в своем геноме рекомбинантную последовательность ДНК, кодирующую, по меньшей мере, одну молекулу(ы) иРНК (например, дцРНК), включающую всю последовательность или часть SEQ ID NO:1. При поглощении насекомым-вредителем отряда жесткокрылых молекулы(а) иРНК могут выключать или ингибировать экспрессию гена-мишени, включающего SEQ ID NO:1, у насекомого-вредителя отряда жесткокрылых, что таким образом приводит к прекращению роста, развития, репродукции и/или питания насекомого-вредителя отряда жесткокрылых.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая в своем геноме, по меньшей мере, одну рекомбинантную последовательность ДНК, кодирующую, по меньшей мере, одну молекулу дцРНК, может представлять собой трансформированную растительную клетку. Некоторые воплощения включают в себя трансгенные растения, включающие такую трансформированную растительную клетку. Дополнительно к таким трансгенным растениям предлагается потомство растений любого поколения трансгенного растения, трансгенные семена и продукты трансгенного растения, каждый из которых включает рекомбинантную последовательность(и) ДНК. В конкретных воплощениях молекула дцРНК по изобретению может экспрессироваться в трансгенной растительной клетке. Таким образом, в этих и в других воплощениях молекула дцРНК по изобретению может быть выделена из трансгенной растительной клетки. В конкретных воплощениях трансгенное растение представляет собой растение, выбранное из группы, включающей кукурузу (Zea mays), сою (Glycine max) и растения семейства Poaceae.

Некоторые воплощения включают в себя способ модулирования экспрессии гена-мишени в клетке насекомого-вредителя отряда жесткокрылых. В этих и в других воплощениях может предлагаться молекула нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу дцРНК. В конкретных воплощениях нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу дцРНК, может быть функционально связана с промотором, а также может быть функционально связана с последовательностью терминации транскрипции. В конкретных во