Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1

Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/286924, поданной 16 декабря 2009, включенной в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

[0002] Варианты реализации настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию MBTPS1 и связанных с ним молекул.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] ДНК-РНК и РНК-РНК гибридизации играют важную роль во многих аспектах функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация также играет ключевую роль в различных методиках для обнаружения конкретной нуклеиновой кислоты или изменения ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию гена, гибридизуясь с целевой РНК, тем самым вмешиваясь в сплайсинг, транскрипцию, трансляцию и репликацию РНК. Антисмысловая ДНК обладает дополнительным свойством: ДНК-РНК-гибриды служат субстратом для расщепления рибонуклеазой Н, активности, присутствующей в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае с олигодезоксинуклеотидами (ОДН), или же они могут экспрессироваться эндогенными генами в виде молекул РНК. Управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) недавно одобрило антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE™ (для лечения цитомегаловирусного ретинита), признав возможность применения антисмысловых соединений в терапевтических целях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее описание представляет собой краткое изложение настоящего изобретения, предназначенное для того, чтобы в сжатой форме охарактеризовать предмет и сущность изобретения. Необходимо понимать, что краткое описание изобретения не должно быть использовано для истолкования или ограничения объема или смысла формулы настоящего изобретения.

[0005] Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта с применением антисмыслового(ых) олигонуклеотида(ов), нацеленного(ых) на любой участок природного антисмыслового транскрипта, приводящие к позитивной регуляции соответствующего смыслового гена. Согласно настоящему изобретению также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью миРНК, рибозимов и малых молекул, которые включены в объем настоящего изобретения.

[0006] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий приведение указанных клеток или тканей в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности, обратно комплементарной полинуклеотиду, содержащему 5-30 последовательных нуклеотидов, выбранных в рамках от 1 до 1240 нуклеотида последовательности SEQ ID NO:2, с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0007] Согласно другому варианту реализации действие олигонуклеотида нацелено на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов MBTPS1, например, нуклеотидов, представленных в последовательности SEQ ID NO:2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SEQ ID NO:3-6.

[0008] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину 5-30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную обратно комплементарной последовательности антисмысловой последовательности указанного полинуклеотида MBTPS1; и, таким образом, модулирует функцию и/или экспрессию полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0009] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину 5-30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную антисмысловому олигонуклеотиду антисмысловому полинуклеотиду MBTPS1; с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии полинуклеотида MBTPS1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0010] Согласно одному из вариантов реализации композиция содержит один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами MBTPS1.

[0011] Согласно другому варианту реализации указанные олигонуклеотиды содержат один или более модифицированный или замещенный нуклеотид.

[0012] Согласно другому варианту реализации указанные олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированную связь.

[0013] Согласно еще одному варианту реализации указанные модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфотиоат, метилфосфонат, пептидные нуклеиновые кислоты, 2’-O-метил-, фтор- или углерод, метиленовые или другие молекулы закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК). Предпочтительно, указанные модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытой нуклеиновой кислоты, включая α-L-ЗНК.

[0014] Согласно другому варианту реализации указанные олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

[0015] Согласно другому варианту реализации указанные олигонуклеотиды вводятся в составе фармацевтической композиции. Схема лечения предполагает введение указанных антисмысловых соединений пациенту по меньшей мере однократно; однако эта схема может быть изменена таким образом, чтобы включать введение нескольких доз в течение определенного периода времени. Указанное лечение может сочетаться с одним или несколькими другими видами терапии.

[0016] Согласно другому варианту реализации указанные олигонуклеотиды заключают в липосомы или присоединяют к молекуле-носителю (например, холестерину или ТАТ-пептиду).

[0017] Другие аспекты описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] Фиг.1 представляет собой график результатов ПЦР в режиме реальном времени, показывающий кратность изменения + стандартное отклонение иРНК MBTPS1 после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением реагента липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК MBTPS1 и клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигомеров, сконструированным как антисмысловой к MBTPS1 Hs.568369. Столбцы, помеченные как CUR-1317, CUR-1315, CUR-1316 и CUR-1318 соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO:3-6, соответственно.

[0019] Описание перечня последовательностей - SEQ ID NO:1: сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) Homo sapiens, иРНК (номер доступа в базе NCBI: NM_003791); SEQ ID NO:2: Природная MBTPS1 антисмысловая последовательность (Hs.568369); SEQ ID NO:3-6. Антисмысловые олигонуклеотиды. * означает фосфотиоатную связь.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0020] Ниже описаны некоторые аспекты изобретения со ссылками на примеры применения для наглядности. Следует понимать, что многочисленные конкретные особенности, взаимосвязи и способы изложены с целью обеспечить полное понимание изобретения. Однако для специалиста в соответствующей области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено без одной или более конкретных особенностей или с применением других способов. Настоящее изобретение не ограничивается указанным порядком действий или процессов, так как некоторые действия могут осуществляться в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Кроме того, не все приведенные в качестве примеров действия или процессы необходимы для реализации методики согласно настоящему изобретению.

[0021] Все гены, названия генов и генные продукты, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из любых видов, для которых могут быть применены композиции и способы, описанные в настоящей заявке. Таким образом, указанные термины включают, не ограничиваясь перечисленными, гены и генные продукты человека и мыши. Следует понимать, что описание гена или генного продукта конкретного вида предназначено исключительно для наглядности и не должно быть истолковано как ограничение, если контекст, в котором оно приведено, четко не указывает на это. Таким образом, например, описанные в настоящей заявке гены, которые согласно некоторым вариантам реализации родственны последовательностям нуклеиновых кислот и аминокислот млекопитающих, включают гомологичные и/или ортологичные гены и генные продукты, полученные от других животных, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, других млекопитающих, рыб, амфибий, рептилий и птиц. Согласно вариантам реализации указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот представляют собой гены или последовательности нуклеиновых кислот человека.

Определения

[0022] Терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения настоящего изобретения. В контексте настоящей заявки термины, используемые в единственном числе и термин «указанный(е)» включают также и множественное число, если из контекста ясно не следует обратное. Кроме того, в тех случаях, когда термины «включая», «включает», «имеющий», «имеет», «имеет в составе» или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, предполагается, что такие термины носят охватывающий характер, сходный с термином «содержащий».

[0023] Термин «приблизительно» или «примерно» означает значение в допустимых пределах ошибки для конкретной величины, как очевидно для специалиста в данной области техники, которая частично зависит от того, как измеряется или определяется значение, т.е. от ограничений системы измерений. Например, «приблизительно» может означать величину в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, в соответствии с принятой в данной области техники практикой. Как вариант, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5%, и еще более предпочтительно до 1% от заданного значения. Как вариант, особенно в отношении биологических систем или процессов, указанный термин может означить порядок возрастания величин, предпочтительно в пределах 5-кратного возрастания, и более предпочтительно в пределах 2-кратного возрастания. При указании в настоящей заявке или формуле изобретения конкретных значений, если не указано иное, следует считать, что термин «приблизительно» охватывает величины внутри допустимого для конкретного значения интервала ошибок.

[0024] В контексте настоящей заявки термин «иРНК» означает известный(е) на сегодняшний день иРНК транскрипт(ы) гена-мишени и любые транскрипты, которые могут быть обнаружены в дальнейшем.

[0025] Под «антисмысловыми олигонуклеотидами» или «антисмысловыми соединениями» подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (целевой РНК, ДНК). Например, если она представляет собой РНК-олигонуклеотид, она связывается с другой целевой РНК посредством РНК-РНК взаимодействий и изменяет активность целевой РНК (Eguchi et al., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может повышающе или понижающе регулировать экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Указанное определение включает любые чужеродные РНК или ДНК молекулы, подходящие для целей терапии, диагностики или с любой другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, антисмысловые РНК или ДНК молекулы, интерферирующие РНК (РНКи), микроРНК, молекулы РНК-ловушек, миРНК, ферментативные РНК, терапевтические редактирующие РНК, РНК-агонисты и антагонисты, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), формы альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие соединения могут быть представлены в форме одноцепочечных, двуцепочечных, частично одноцепочечных, или кольцевых олигомерных соединений.

[0026] В контексте настоящего изобретения термин «олигонуклеотид» относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин «олигонуклеотид», также включает линейные или кольцевые олигомеры, состоящие из природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК), фосфотиоатные, метилфосфонатные и т.н. Олигонуклеотиды способны специфически связываться с целевым полинуклеотидом посредством стандартных мономер-мономерных взаимодействий, таких как спаривание оснований по Уотсону-Крику, Хугстиновское или обратное Хугстиновское спаривание оснований или т.п.

[0027] Указанный олигонуклеотид может быть «химерным», то есть состоять из разнородных участков. В контексте настоящего изобретения «химерные» соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химических участка, например, участок(ки) ДНК, участок(ки) РНК, участок(ки) ПИК и т.д. Каждый химический участок состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где указанный олигонуклеотид модифицирован с целью приобретения одного или более необходимого свойства. Необходимые свойства указанного олигонуклеотида включают, но не ограничиваются перечисленными, например: повышенную устойчивость к разложению нуклеазами, повышенное поглощение клетками и/или повышенную связывающую способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Различные участки указанного олигонуклеотида могут, таким образом, обладать различными свойствами. Указанные химерные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям.

[0028] Указанный олигонуклеотид может состоять из участков, которые могут быть связаны по «порядку», то есть мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК, или связаны через спейсеры. Спейсеры предназначены для формирования ковалентного «мостика» между указанными участками и в предпочтительных случаях имеют длину не более чем приблизительно 100 атомов углерода. Указанные спейсеры могут обладать различными функциональными свойствами, например, нести положительный или отрицательный заряд, иметь специфические для связывания нуклеиновых кислот особенности (интеркаляторы, связыватели бороздки, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, включать особые вторичные структуры, например аланин-содержащие белки, включающие альфа-спирали.

[0029] Используемые в настоящей заявке термины «MBTPS1» и «сайт-1 мембраносвязанная пептидаза транскрипционных факторов» включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.

[0030] Используемые в настоящей заявке термины сайт-1 мембраносвязанная пептидаза транскрипционных факторов; MBTPS1, KIAA0091, сайт-1 мембраносвязанная протеаза транскрипционных факторов, MGC138711, MGC138712, PCSK8, S1P, S1P-эндопептидаза, сайт-1 протеаза, SKI1, SKI-1, субтилизин/кексин изозим 1, являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки.

[0031] Используемый в настоящей заявке термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид, нацеленный на» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность (i), способную формировать стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени, или (ii), способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом иРНК транскрипта гена-мишени. Стабильность указанных комплексов и дуплексов может быть определена посредством теоретических расчетов и/или in vitro анализов. Типовые методы анализа для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.

[0032] Используемый в настоящей заявке термин «целевая нуклеиновая кислота» включает ДНК, РНК (включая пре-мРНК и иРНК), транскрибированные с таких ДНК, а также кДНК, полученные с помощью таких РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование указанной нуклеиновой кислоты. Такое модулирование функции целевой нуклеиновой кислоты посредством соединений, которые специфически гибридизуются с ней, обычно называется «антисмысловой». Изменяемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Изменяемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК в сайт трансляции белка, трансляция белка из указанной РНК, сплайсинг указанной РНК с получением одного или более вида иРНК, и каталитическая активность, с которой может быть связана указанная РНК, либо которой она может способствовать. Общим эффектом от такого изменения функции целевой нуклеиновой кислоты является модулирование экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.

[0033] РНК-интерференция «РНКи» опосредована молекулами двуцепочечной РНК (дцРНК), которые обладают сиквенс-специфичной гомологией с «целевыми» последовательностями нуклеиновых кислот (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанные посредники представляют собой дуплексы 5-25-нуклсотидных «малых интерферирующих» РНК (миРНК). Указанные миРНК синтезируются при процессинге дцРНК ферментом-РНКазой, известным как дайсер (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366). Дуплексные продукты миРНК входят в состав мульти-белкового миРНК-содержащего комплекса, называемого RISC (РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга). Без связи с какой-либо конкретной теорией, предполагается, что RISC переносится к целевой нуклеиновой кислоте (подходит иРНК), где указанный миРНК-дуплекс взаимодействует с ней сиквенс-специфичным образом, опосредуя каталитическое расщепление (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11:1776-1780). Малые интерферирующие РНК, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и использованы в соответствии с известными в данной области техники методиками, знакомыми специалистам в данной области техники. Для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, подходят малые интерферирующие РНК, включающие приблизительно от 1 до приблизительно 50 нуклеотидов (нт). Согласно неограничивающим примерам реализации миРНК могут содержать от приблизительно 5 до приблизительно 40 нт, от приблизительно 5 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 10 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 15 до приблизительно 25 нт, или приблизительно 20-25 нуклеотидов.

[0034] Отбор подходящих олигонуклеотидов выполняют с применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GenBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень межвидовой идентичности. Для генов, которые не были секвенированы, выполняют саузерн-блоттинг, что позволяет провести определение степени идентичности генов у нелепого вида и у других видов. Проводя саузерн-блоттинг в условиях различной степени жесткости, согласно известным в данной области техники методикам, возможно с достаточной точностью определить степень идентичности. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот регулируемого объекта и более низкую степень комплементарности соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот из других видов. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения согласно настоящему изобретению.

[0035] Под «ферментативной РНК» подразумевается молекула РНК с ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) сначала связываются с целевой РНК. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает, а потом связывается с целевой РНК посредством спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК.

[0036] Под «РНК-ловушкой» подразумевается молекула РНК, имитирующая природный лиганд-связывающий домен. Указанная РНК-ловушка, таким образом, конкурирует с природной мишенью связывания специфического лиганда. Например, показано, что сверхэкспрессия РНК трансактивируемого регуляторного элемента (TAR) ВИЧ может функционировать в качестве «ловушки» и эффективно связывает tat белок ВИЧ, предотвращая таким образом его связывание с TAR-последовательностями, кодируемыми ВИЧ-РНК (Sullenger et al. (1990) Cell, 63, 601-608). Такой пример является частным. Специалистам в данной области техники будет понятно, что это всего лишь пример, и другие варианты реализации легко могут быть осуществлены с применением общеизвестных в данной области техники методик.

[0037] Используемый в настоящей заявке термин «мономеры» обычно означает мономеры, связанные фосфодиэфирными связями или их аналогами с образованием олигонуклеотидов, варьирующих в размерах от нескольких мономерных единиц, например, приблизительно от 3-4, до приблизительно нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфотиоат, фосфородитиоат, метилфорфорнаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., более подробно описанные ниже.

[0038] Термин «нуклеотид» охватывает нуклеотиды природного происхождения, а также нуклеотиды, не встречающиеся в природе. Для специалиста в данной области техники очевидно, что различные нуклеотиды, ранее считавшиеся «не встречающимися в природе», впоследствии были найдены в природе. Таким образом, термин «нуклеотиды» включает не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративные примеры других типов нуклеотидов представлены молекулами, содержащими аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этанцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(С3-С6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолониридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и «не встречающиеся в природе» нуклеотиды, описанные в патенте США 5432272, Benner et al. Под термином «нуклеотид» подразумеваются все и каждый из приведенных примеров, а также их аналоги и таутомеры. Особенный интерес представляют нуклеотиды, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются нуклеотидами природного происхождения, в отношении терапевтического и диагностического применения у человека. Нуклеотиды включают природные 2’-дезокси и 2’-гидроксил-сахара, например, согласно описанным в Kornberg and Baker, DNA Replication, 2^nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.

[0039] Термин «аналоги» в отношении нуклеотидов включает синтетические нуклеотиды, содержащие фрагменты с модифицированными основаниями и/или модифицированные фрагменты сахара (см., например, общее описание в Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid Res., 25(22), 4429-4443, Toulmé, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139; Freier S.M., (1997) Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2’-O, 3’-C-связанные [3.2.0] бициклоарабинонуклеозиды (см., например, N.K Christiensen., et al, (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7):641-9; Cho EJ, et al. (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, сконструированные с целью увеличения связывающих способностей, например, стабильности дуплексов или триплексов, специфичности или т.п.

[0040] Используемый в настоящей заявке термин «гибридизация» означает спаривание в значительной степени комплементарных цепей олигомерных соединений. В одном из механизмов спаривания задействованы водородные связи, которые могут представлять собой водородные связи по Уотсону-Крику, Хугстиновские или обратные Хугстиновские водородные связи, между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин представляют собой комплементарные нуклеотиды, спаривающиеся при помощи водородных связей. Гибридизация может происходить при различных условиях.

[0041] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ в случае исследований in vitro.

[0042] В контексте настоящей заявки выражение «гибридизация в жестких условиях» или «жесткие условия» относится к условиям, при которых соединение, предложенное в настоящем изобретении, будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью и минимальным числом других последовательностей. Жесткие условия зависят от последовательностей и различаются в зависимости от обстоятельств; в контексте настоящего изобретения, «жесткие условия», при которых олигомерные соединения гибридизуются с целевой последовательностью определяются природой и составом олигомерных соединений и методиками анализа, применяемыми для их исследования. Как правило, при гибридизации в жестких условиях используются низкие концентрации (<0,15М) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ (т.е. с низкой ионной силой), температуры выше 20°C-25°C, но ниже температуры плавления комплекса указанного олигомерного соединения с целевой последовательностью, и присутствие денатурантов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид, или детергента додецилсульфата натрия (SDS). Например, скорость гибридизации снижается на 1,1% на каждый 1% формамида. Примером жестких условий гибридизации является 0,1X цитратно-солевой буфер (SSC)/0,1% (вес/объем) SDS при 60°С в течение 30 минут.

[0043] Используемый в настоящей заявке термин «комплементарный» относится к способности к точному спариванию двух нуклеотидов на одной или двух олигомерных цепях. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородные связи с нуклеиновым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, при этом указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, РНК или олигонуклеотидную молекулу, тогда это положение водородной связи между указанным олигонуклеотидом и указанной целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным положением. Указанное олигомерное соединение и другие ДНК, РНК или олигонуклеотидная молекула комплементарны друг другу, если достаточное количество комплементарных положений в каждой молекуле заняты нуклеотидами, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, термины «специфически гибридизуемый» и «комплементарный» используются для обозначения достаточной степени точности спаривания или комплементарности достаточного количества нуклеотидов обеспечивающих стабильное и специфическое связывание указанного олигомерного соединения и целевой нуклеиновой кислоты.

[0044] Специалистам, в данной области техники будет понятно, что последовательность олигомерного соединения необязательно должна быть на 100% комплементарна таковой ее целевой нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически гибридизуемой. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментом таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлеобразные структуры, некомплементарные или шпилькообразные структуры). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению содержат последовательности, по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 99% комплементарные целевому участку в составе целевой последовательности нуклеиновой кислоты, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов указанною антисмыслового соединения комплементарны целевому участку, и которое, таким образом, будет специфически гибридизоваться, комплементарно на 90%. В данном примере остающиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть объединены или рассеяны между комплементарными нуклеотидами и не обязательно соседствуют друг с другом или с комплементарными нуклеотидами. Соответственно, антисмысловое соединение, составляющее в длину 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, фланкированное двумя участками с полной комплементарностью целевой нуклеиновой кислоте, будет обладать 77,8% общей комплементарности целевой нуклеиновой кислоте и, таким образом, будет входить в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с участком целевой нуклеиновой кислоты может быть определенно стандартной методике с применением программ BLAST (средств поиска основного локального выравнивания) и PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul el al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang и Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности может быть определен, например, при помощи программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с применением параметров по умолчанию, использующей алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).

[0045] Используемый в настоящей заявке термин «температура плавления/точка плавления» относится к температуре, при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, равновесно гибридизуются с целевой последовательностью. Как правило, жесткими условиями являются такие, в которых концентрация солей составляет по меньшей мере приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при pH 7,0-8,3 и температуре по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких олигонуклеотидов (например, из 10-50 нуклеотидов). Жесткие условия могут также достигаться посредством добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.

[0046] Используемый в настоящей заявке термин «модулирование» означает либо повышение (стимуляцию), либо снижение (ингибирование) экспрессии гена.

[0047] Термин «вариант» при использовании в отношении полинуклеотидной последовательности, может охватывать полинуклеотидные последовательности, родственные генам дикого типа. Это определение может также включать, например, «аллельные» «сплайс-» «видовые» или «полиморфные» варианты. Сплайс-вариант может обладать значительной степенью идентичности с шаблонной молекулой, но, как правило, состоит из большего или меньшего числа полинуклеотидов в результате альтернативного сплайсинга экзонов при процессинге иРНК. Соответствующий полипептид может включать дополнительные функциональные домены или какие-то домены могут отсутствовать. Видовые варианты представляют собой полинуклеотидные последовательности, отличающиеся у разных видов. Особенно подходят для применения в настоящем изобретении варианты продуктов гена дикого типа. Варианты могут быть получены в результате по меньшей мере одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к изменениям в иРНК или полипептидов, структура которых может быть изменена или не изменена. Любой природный или рекомбинантный ген может не иметь ни одной, иметь одну или множество аллельных форм. Стандартные мутационные изменения, которые приводят к возникновению вариантов, как правило, происходят в результате естественных делеций, добавлений или замен нуклеотидов. Каждое из таких изменений может происходить отдельно или в комбинации с другими, однократно или многократно в определенной последовательности.

[0048] Получаемые полипептиды, как правило, обладают значительной степенью идентичности аминокислотного состава. Полиморфный вариант представляет собой вариацию полинуклеотидной последовательности конкретного гена у индивидуумов определенного вида. Полиморфные варианты также могут включать «однонуклеотидные полиморфы» (снипы) или мутации одиночных оснований, в которых указанная полинуклеотидная последовательность отличается одним основанием. Присутствие снипов может свидетельствовать, например, о конкретной популяции с определенной склонностью к болезни, то есть предрасположенностью относительно сопротивляемости.

[0049] Производные полинуклеотиды включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, с заменой водорода на алкильную, ацильную или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотидов, могут содержать не встречающиеся в природе фрагменты, такие как видоизмененные фрагменты сахара или внутрисвязанные сахара. Типовыми являются фосфотиоат и другие серосодержащие виды, известные в данной области техники. Производные нуклеиновых кислот могут также содержать метки, включая радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы, и т.п.

[0050] «Производное» полипептида или пептида представляет собой полипептид или пептид, модифицированный, например, гликозилированием, пегилированием, фосфорилированием, сульфатированием, восстановлением/алкилированием, ацилированием, реакцией сочетания или мягкой обработкой формалином. Производное может также быть модифицировано таким образом, чтобы содержать детектируемую метку, прямо или непрямо, включая, но не ограничиваясь перечисленными, радиоизотопные, флуоресцентные и ферментные метки.

[0051] Используемый в настоящей заявке термин «животное» или «пациент» включает, например, человека, овцу, вапити, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадь, рогатый скот, свинью, коз, собаку, кошку, крысу, мышей, птиц, кур, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.

[0052] Под «млекопитающими» понимаются теплокровные животные, как правило, получающие медицинскую помощь