Оптимизированные с помощью вычислительных средств антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h5n1 и h1n1

Оптимизированные с помощью вычислительных средств антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h5n1 и h1n1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА HA РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/617815, поданной 30 марта 2012 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к оптимизированным белкам-гемагглютининам вируса гриппа, которые вызывают иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H5N1 и H1N1, и к их применению в качестве вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae. Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемые как вирус гриппа A, вирус гриппа B и вирус гриппа C. Вирион вируса гриппа содержит геном, состоящий из сегментированной отрицательно-полярной нити РНК, который кодирует следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксный белок (M1), белок протонного канала (M2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразного комплекса 1 (PB1), основный белок полимеразного комплекса 2 (PB2), кислый белок полимеразного комплекса (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). Белки HA, NA, M1 и M2 являются белками, ассоциированными с мембраной, тогда как NP, PB1, PB2, PA и NS2 являются белками, ассоциированными с нуклеокапсидом. Белок М1 является наиболее распространенным белком в частицах вируса гриппа. Белки HA и NA являются гликопротеинами оболочки, отвечающими за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, а также являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и для защитного иммунитета. Как белок HA, так и белок NA считаются наиболее важными компонентами профилактических вакцин против гриппа.

Ежегодно сезонные вспышки гриппа являются причиной более 300000 случаев госпитализации и 36000 смертельных случаев только в США (Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). Появление нового вируса гриппа H1N1 в 2009 г. показало, насколько быстро пандемия нового вида гриппа может распространиться по всему миру.

В настоящее время в США лицензированы два типа подходов к вакцинации против гриппа – применение инактивированной сплит-вакцины и применение вакцины на основе живого ослабленного вируса. Инактивированные вакцины могут эффективно индуцировать гуморальные иммунные ответы, но, как правило, вызывают лишь слабый клеточные иммунные ответы. Вакцины на основе живого вируса не могут вводиться пациентам с ослабленным иммунитетом или беременным пациентам в связи с имеющимся у них повышенным риском развития инфекции. Таким образом, существует потребность в вакцине против вируса гриппа, обладающей широким спектром защитной активности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью вычислительных средств полипептидов HA вирусов гриппа H5N1 и H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды НА вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H5N1 или H1N1, при этом полипептид НА включает или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления в полипептиде НА вируса гриппа отсутствует N-концевой метиониновый остаток.

Молекулы выделенных нуклеиновых кислот и векторы, кодирующие рекомбинантные полипептиды НА, также представлены в настоящем раскрытии. Дополнительно представлены выделенные клетки, содержащие такие векторы.

Также представлены вирусоподобные частицы (VLP), сходные с частицами вируса гриппа, и слитые белки, содержащие оптимизированные полипептиды НА, раскрытые в данном документе.

Дополнительно представлены композиции, которые включают оптимизированные полипептиды НА вируса гриппа, слитые белки или VLP, раскрытые в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем раскрытии также представлены способы вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения раскрытых композиций, слитых белков или VLP.

Также представлены способы иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту композиции, содержащей VLP, которая содержит оптимизированный полипептид НА.

Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания, которое следует далее, ссылаясь на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA с использованием 426 изолятов H5N1 человека из клад 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 и 7, которая называется в данном документе как “PATH H5N1 COBRA” HA.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA с использованием 205 изолятов вируса гриппа H1N1 человека и свиньи, которая называется в данном документе как “PATH H1N1 COBRA” HA.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, на которой изображены титры HAI-антител в отношении штаммов клады 1 и клады 2 при контрольном заражении после вакцинации VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA HA вируса гриппа человека клады 2 (COBRA-2 человека), или VLP, содержащими HA вируса гриппа Whooper Swan (A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM).

Фиг. 4 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Indonesia клады 2.1 (A/Indonesia/5/2005). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM); контрольное заражение вирусом осуществляли на протяжении 5 недели.

Фиг. 5 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), и впоследствии подвергшихся контрольному заражению 5000 БОЕ вируса Vietnam клады 1 (A/Vietnam/1203/2004). Вакцинации (3 мкг) выполняли на 0 и 3 неделях с адъювантом (Imject^TM); контрольное заражение вирусом осуществляли на протяжении 5 недели.

Фиг. 6 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию (3 мкг) выполняли на 0 неделе с адъювантом (Imject^TM) с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

Фиг. 7 представляет собой график, на котором показан процент выживания животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию (3 мкг) выполняли на 0 неделе без адъюванта с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

Фиг. 8 представляет собой график, на котором показана масса тела животных, вакцинированных VLP, содержащими последовательность PATH H5N1 COBRA HA (SEQ ID NO: 1), VLP, содержащими последовательность COBRA-2 HA человека, или VLP с Whooper Swan, и впоследствии подвергшихся контрольному заражению вирусом Vietnam клады 1. Единичную вакцинацию в дозе 0,6 мкг выполняли на 0 неделе с адъювантом (Imject^TM) с последующим контрольным заражением вирусом на протяжении 4 недели.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с помощью трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Перечень последовательностей представлен в виде текстового файла с кодировкой ASCII, созданного 7 февраля 2013 года, 10,0 KB, который включен в данный документ посредством ссылки. В прилагаемом перечне последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность COBRA для HA вируса гриппа H5N1 (“PATH H5N1 COBRA”).

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность COBRA для HA вируса гриппа H1N1 (“PATH H1N1 COBRA”).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Сокращения

COBRA: оптимизированный с помощью вычислительных средств антиген с широким спектром реактивности;

HA: гемагглютинин;

HAI: ингибирование гемагглютинации;

HRP: пероксидаза хрена;

M1: матриксный белок 1;

NA: нейраминидаза;

PFU: бляшкообразующая единица;

VLP: вирусоподобная частица.

II. Выражения и способы

Если не указано иное, технические выражения используются согласно традиционному способу употребления. Определения общепринятых выражений в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованном Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления настоящего раскрытия, представлены следующие объяснения конкретных выражений.

Адъювант. Вещество или среда, которые неспецифически усиливают иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут включать суспензию минеральных веществ (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат алюминия), на которой адсорбируется антиген; или эмульсию типа “вода-в-масле”, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (например, неполный адъювант Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дополнительного усиления антигенных свойств. В качестве адъювантов можно также применять иммуностимулирующие олигонуклеотиды (как, например, содержащие мотив CpG) (например, см. патенты США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; 6339068; 6406705 и 6429199). Адъюванты также включают биологические молекулы, такие как костимулирующие молекулы. Иллюстративные биологические адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L и 41 BBL.

Введение. Как применяется в данном документе, введение композиции субъекту означает предоставление субъекту, нанесение субъекту или приведение композиции в контакт с субъектом. Введение можно осуществлять любым из ряда путей, как, например, местным, пероральным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, подоболочечным и внутрикожным.

Антитело. Молекула иммуноглобулина, вырабатываемая B-лимфоцитами, с определенной аминокислотной последовательностью. Выработка антител у людей или других животных происходит под действием специфического антигена (иммуногена). Антитела характеризуются специфической реакцией с антигеном, происходящей некоторым очевидным образом, при этом каждое из выражений "антитело" и "антиген" определено относительно другого. Выражение "вызывать ответ с формированием антител" относится к способности антигена или другой молекулы индуцировать выработку антител.

Антиген. Соединение, композиция или вещество, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Антиген реагирует с продуктами специфических гуморальных или клеточных иммунных реакций, в том числе с таковыми, индуцируемыми гетерологичными иммуногенами. В некоторых вариантах осуществления раскрытых композиций и способов антиген представляет собой белок НА вируса гриппа.

Подвергнутый оптимизации кодонов. Выражение "нуклеиновая кислота, подвергнутая оптимизации кодонов" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид или группа видов). Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Слитый белок. Белок, полученный путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания слитого белка последовательности нуклеиновых кислот должны находиться в одной той же рамке считывания и не содержать внутренних стоп-кодонов. Например, слитый белок может включать НА вируса гриппа, слитый с гетерологичным белком.

Гемагглютинин (HA). Поверхностный гликопротеин вируса гриппа. HA опосредует связывание вирусной частицы с клетками-хозяевами и последующее проникновение вируса в клетку-хозяина. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности множества белков HA вируса гриппа известны в данной области техники и публично доступны, как, например, через базу данных ресурсов по вирусам гриппа NCBI (Bao et al., J Virol 82:596-601, 2008). HA (наряду с NA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Иммунный ответ. Ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфноядерный лейкоцит, на стимул, такой как антиген или вакцина. Иммунный ответ может затрагивать любую клетку тела, участвующую в защитной реакции организма-хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, которая секретирует интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает без ограничений врожденный иммунный ответ или воспаление. Как применяется в данном документе, защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъект от инфекции (предупреждает инфекцию или предупреждает развитие заболевания, ассоциированного с инфекцией). Способы оценки иммунных ответов хорошо известны в данной области техники и включают, например, оценку пролиферации и/или активности лимфоцитов (таких как B- или Т-клетки), секреции цитокинов или хемокинов, воспаления, выработки антител и т. п.

Иммуноген. Соединение, композиция или вещество, которое в соответствующих условиях способно стимулировать иммунный ответ, такой как выработка антител или Т-клеточный ответ, у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые им. Как применяется в данном документе, “иммуногенная композиция” представляет собой композицию, которая содержит иммуноген (например, полипептид HA).

Иммунизировать. Предоставлять субъекту защиту от инфекционного заболевания, например, путем вакцинации.

Вирус гриппа. Вирус с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа А вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа А, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, источником которого являлись свиньи, появился в 2009 г. и был объявлен Всемирной организацией здравоохранения пандемическим. Этот штамм был назван "вирусом свиного гриппа". Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг.

Выделенный. "Выделенный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, белок или вирус) был практически отделен или очищен от других биологических компонентов (таких как клеточный детрит или другие белки или нуклеиновые кислоты). Биологические компоненты, которые были "выделены", включают компоненты, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Это выражение также охватывает рекомбинантные нуклеиновые кислоты, белки или вирусы (или VLP), а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или пептиды.

Линкер. Одна или несколько аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя полипептидами слитого белка.

Матриксный белок (M1). Структурный белок вируса гриппа, обнаруженный в оболочке вируса. Полагают, что M1 участвует в сборке и отпочковании.

Нейраминидаза (NA). Мембранный гликопротеин вируса гриппа. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к вирусному НА за счет отщепления концевых остатков сиаловой кислоты от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предотвращая агрегацию вирусов. NA (наряду с HA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в том случае, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Оптимизированный белок HA вируса гриппа. Как применяется в данном документе, “оптимизированный белок HA вируса гриппа” относится к консенсусной последовательности белка HA, полученной с помощью выравниваний последовательностей изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1 (как описано в примерах 1 и 2 ниже). Нуклеотидные последовательности, кодирующие оптимизированные белки HA, дополнительно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих посредством оптимизации кодонов и оптимизации РНК (так, чтобы повысить стабильность РНК). Оптимизированные белки HA вируса гриппа, раскрытые в данном документе (и приведенные в данном документе как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) также называют последовательностями “COBRA” (оптимизированного с помощью вычислительных средств антигена с широким спектром реактивности). Оптимизированные полипептиды HA предназначены для того, чтобы вызывать у субъекта иммунный ответ с широким спектром реактивности. В контексте настоящего раскрытия “с широким спектром реактивности” означает, что белковая последовательность вызывает такой иммунный ответ у субъекта, который является достаточным для ингибирования, нейтрализации или предупреждения инфицирования широким спектром вирусов гриппа (таких как большинство или все вирусы гриппа в рамках определенного подтипа). В некоторых случаях оптимизированный белок HA вируса гриппа способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ, в отношении большинства или всех изолятов вируса гриппа H5N1 или большинства или всех изолятов вируса гриппа H1N1.

Вспышка. Как применяется в данном документе, “вспышка” вируса гриппа относится к накоплению изолятов вируса внутри отдельной страны в определенный год.

Фармацевтически приемлемые среды. Фармацевтически приемлемые носители (среды), применимые в настоящем раскрытии, являются традиционными. В Remington’s Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки одной или нескольких терапевтических композиций, таких как одна или несколько вакцин против гриппа, и дополнительные фармацевтические средства.

В целом, природа носителя будет зависеть от конкретного используемого способа введения. Например, составы для парентерального применения обычно содержат инъекционные жидкости, которые в качестве среды включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или подобные. В случае твердых композиций (например, в форме порошка, драже, таблеток или капсул) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической степени чистоты. Вводимые фармацевтические композиции в дополнение к биологически нейтральным носителям могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и буферные средства, поддерживающие pH, и подобные вещества, например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.

Полипептид. Полимер, мономерами в котором являются аминокислотные остатки, соединенные друг с другом посредством амидных связей. Если аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, то можно применять либо L-оптический изомер, либо D-оптический изомер. Выражения “полипептид” или “белок”, применяемые в данном документе, предназначены охватывать любую аминокислотную последовательность и включать модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Выражение “полипептид” конкретно предназначено охватывать белки, встречающиеся в природе, а также белки, полученные рекомбинантным или синтетическим путем. Выражение “остаток” или “аминокислотный остаток” включает ссылку на аминокислоту, которая встроена в белок, полипептид или пептид.

Предупреждение, лечение или уменьшение интенсивности заболевания. “Предупреждением” заболевания называют ингибирование полного развития заболевания. “Лечением” называют терапевтическое вмешательство, которое уменьшает интенсивность признака или симптома заболевания или патологического состояния после начала его развития. “Уменьшением интенсивности” называют снижение числа или уменьшение степени тяжести признаков или симптомов заболевания.

Промотор. Промотор представляет собой совокупность контрольных последовательностей нуклеиновых кислот, управляющих транскрипцией нуклеиновой кислоты. Промотор включают необходимые последовательности нуклеиновых кислот, располагающиеся возле сайта инициации транскрипции. Промотор также необязательно включает дистальные энхансерные или репрессорные элементы. “Конститутивный промотор” представляет собой промотор, который является постоянно активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В отличие от него, активность “индуцибельного промотора” регулируется внешними сигналами или молекулами (например, фактором транскрипции). В некоторых вариантах осуществления, представленных в данном документе, промотор представляет собой промотор CMV.

Очищенный. Выражение “очищенный” не подразумевает абсолютную чистоту; его скорее предполагается использовать как относительное выражение. Таким образом, например, очищенные пептид, белок, вирус, VLP или другое активное соединение представляют собой таковые, которые отделены полностью или частично от белков и других примесей, которые в естественных условиях ассоциированы с ними. В некоторых вариантах осуществления выражение “практически очищенный” относится к пептиду, белку, вирусу, VLP или другому активному соединению, выделенным из клетки, среды для культивирования клеток или другого неочищенного препарата и подвергнутым фракционированию для удаления различных компонентов из исходного препарата, таких как белки, клеточный детрит и другие компоненты.

Рекомбинантный. Рекомбинантные нуклеиновая кислота, белок, вирус или VLP представляют собой таковые, имеющие последовательность, которая не встречается в природе, или имеющие последовательность, полученную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, которые в остальных случаях отделены друг от друга. Это искусственное объединение часто выполняют путем химического синтеза или путем искусственного воздействия на выделенные сегменты нуклеиновых кислот, например, при помощи методик генной инженерии.

Субъект. Живые многоклеточные позвоночные организмы - это категория, которая включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, отличные от человека.

Терапевтически эффективное количество. Количество определенного средства, достаточное для достижения необходимого эффекта у субъекта, подвергающегося лечению с помощью этого средства. Например, это может быть количество вакцины против вируса гриппа, пригодное для вызова иммунного ответа у субъекта и/или предупреждения инфекции или заболевания, вызываемых вирусом гриппа. Идеально, в контексте настоящего раскрытия, терапевтически эффективным количеством вакцины против гриппа является количество, достаточное для повышения резистентности к инфекции, вызываемой вирусом гриппа, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, которое при этом не вызывает значительный цитотоксический эффект у субъекта. Эффективное количество вакцины против гриппа, пригодное для повышения резистентности к инфекции, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, будет зависеть, например, от субъекта, подвергающегося лечению, способа введения терапевтической композиции и других факторов.

Трансформированный. Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую ввели молекулу нуклеиновой кислоты при помощи методик молекулярной биологии. Как применяется в данном документе, выражение “трансформация” охватывает все способы, при помощи которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, в том числе трансфекцию с применением вирусных векторов, трансформацию с применением плазмидных векторов и введение “голой” ДНК путем электропорации, липофекции и ускорения частиц при помощи генной пушки.

Вакцина. Препарат на основе иммуногенного материала, способного стимулировать иммунный ответ, вводимый для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения заболевания, такого как инфекционное заболевание. Иммуногенный материал может включать, например, ослабленные или убитые микроорганизмы (например, ослабленные вирусы) или антигенные белки (в том числе VLP), пептиды или ДНК, полученные из них. Вакцины могут вызвать как профилактический (предупредительный), так и терапевтический ответ. Способы введения варьируют в зависимости от вакцины, но могут включать прививку, проглатывание, ингаляцию или другие формы введения. Прививки можно проводить с помощью ряда различных путей, включая парентеральный, например, внутривенный, подкожный или внутримышечный. Вакцины можно вводить с адъювантом, чтобы усилить иммунный ответ.

Вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая позволяет производить вставку чужеродной нуклеиновой кислоты без нарушения способности вектора к репликации в клетке-хозяине и/или интеграции в клетку-хозяина. Вектор может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точку начала репликации. Инсерционный вектор способен вставляться в нуклеиновую кислоту хозяина. Вектор также может включать один или несколько селектируемых маркерных генов и других генетических элементов. Вектор экспрессии представляет собой вектор, который содержит необходимые регуляторные последовательности для осуществления транскрипции и трансляции вставленного гена или генов. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия вектор кодирует белок HA, NA или М1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США № 2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

Вирусоподобная частица (VLP). Вирусные частицы, образованные одним или несколькими структурными белками вируса, но не имеющие вирусного генома. Поскольку VLP не имеют вирусного генома, они являются неинфекционными. Кроме того, VLP часто могут быть получены путем гетерологичной экспрессии и легко могут быть очищены. Большинство VLP содержат по меньшей мере коровый вирусный белок, который управляет отпочкованием и высвобождением частиц из клетки-хозяина. Одним из примеров такого сердцевинного белка является M1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления, описываемых в данном документе, VLP, сходная с частицей вируса гриппа, содержит белки HA, NA и/или М1. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут быть получены путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, кодирующих белки HA и NA и необязательно белок М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 4 приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине. Другие способы получения VLP, сходных с частицами вируса гриппа, известны в данной области техники (см., например, публикации заявки на патент США №№ 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769 и 2010/0239610).

Если не указано иное, все технические и научные выражения, применяемые в данном документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Выражения в единственном числе включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. “Содержащий A или B” означает включающий А или В или А и B. Также следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в качестве контрольного документа будет выступать настоящее описание, включая пояснения выражений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

III. Обзор некоторых вариантов осуществления

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью вычислительных средств полипептидов HA вирусов гриппа H5N1 и H1N1, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H5N1 и H1N1. Способы, применяемые для получения оптимизированных консенсусных последовательностей HA, описаны в примерах 1 и 2 и показаны на фиг. 1 и 2. Аминокислотные последовательности 2 определенных полипептидов HA приведены в данном документе как SEQ ID NO: 1 (H5N1) и SEQ ID NO: 2 (H1N1). Последовательность H5N1 получали, используя 426 изолятов H5N1 человека из клад 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3 и 7, и она называется в данном документе как HA “PATH H5N1 COBRA”. Последовательность H1N1 получали, используя 205 изолятов вируса гриппа H1N1 человека и свиньи, и она называется в данном документе как “PATH H1N1 COBRA” HA.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, которые имеют оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром активности в отношении вируса гриппа H5N1 или H1N1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида HA включает или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида HA вируса гриппа включает или содержит аминокислотную последовательность из остатков 2-568 из SEQ ID NO: 1 или остатков 2-566 SEQ ID NO: 2.

Дополнительно обеспечиваются молекулы выделенных нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный полипептид HA, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты подвергнута оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Молекула нуклеиновой кислоты необязательно дополнительно оптимизирована для обеспечения стабильности РНК.

Векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные полипептиды HA, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Вектором может быть любой вектор, подходящий для экспрессии полипептида HA, такой как вектор экспрессии у млекопитающих. В конкретных примерах вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США №2002/0106798, которая включена в данный документ посредством ссылки; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

В некоторых примерах вектор содержит промотор, функционально связанный c нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид HA. В конкретных примерах промотор представляет собой промотор CMV.

Также обеспечиваются выделенные клетки, содержащие раскрываемые векторы. В некоторых случаях клетка представляет собой клетку любого типа, подходящего для выработки и экспрессии VLP, такую как клетка млекопитающего.

Дополнительно обеспечиваются VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие оптимизированный полипептид HA, раскрытый в данном документе. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут дополнительно включать любые дополнительные белки вируса гриппа, необходимые для формирования вирусной частицы. В некоторых вариантах осуществления VLP, сходные с частицами вируса гриппа, дополнительно включают белок нейраминидазу (NA) вируса гриппа, матриксный белок (M1) вируса гриппа или оба эти белка.

Также представлены VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие полипептид НА вируса гриппа, раскрытый в данном документе, полученные путем трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, кодирующего полипептид НА, вектора, кодирующего белок NA вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок M1 вируса гриппа, в условиях, достаточных для обеспечения экспрессии белков НА, M1 и NA.

Слитые белки, содержащие оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, дополнительно обеспечиваются настоящим раскрытием.

Также в данном документе обеспечиваются композиции, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа, описанный в данном документе, или слитый белок или VLP, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Дополнительно обеспечивается способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения оптимизированного белка НА вируса гриппа, слитого белка, содержащего оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, VLP, содержащих оптимизированный НА вируса гриппа, или композиций с ними, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирус гриппа представляет собой вирус гриппа H5N1 или H1N1. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок, содержащий НА, или VLP можно вводить с помощью любого подходящего пути введения, такого как, например, внутримышечный, интраназальный или пероральный. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок или VLP вводят в виде композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Также обеспечивается способ иммунизации субъекта