Модифицированные микроорганизмы и способы получения бутадиена с их применением

Модифицированные микроорганизмы и способы получения бутадиена с их применением

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бутадиен (1,3-бутадиен, CH₂=CH-CH=CH₂, CAS 106-99-0) представляет собой неразветвленный, конъюгированный 4-углеродный углеводород, как правило, получаемый (наряду с другими 4-углеродными молекулами) посредством парового крекинга нефтяных углеводородов. Этот процесс включает жесткие условия и высокие температуры (по меньшей мере приблизительно 850°C). Другие способы получения бутадиена включают токсические и/или дорогостоящие катализаторы, легковоспламеняющиеся и/или газообразные источники углерода и высокие температуры. На мировом уровне ежегодно получают несколько миллионов тонн содержащих бутадиен полимеров. Бутадиен можно полимеризовать с получением полибутадиена или подвергать реакции с цианистым водородом (синильной кислотой) в присутствии никелевого катализатора с получением адипонитрила, предшественника нейлона. Однако более часто бутадиен полимеризуют с другими олефинами с получением сополимеров, таких как сополимеры акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS), акрилонитрил-бутадиен (ABR) или стирол-бутадиен (SBR).

СУЩНОСТЬ

Настоящее изобретение в основном относится к микроорганизмам (например, неприродным микроорганизмам, также обозначаемым в настоящем документе как модифицированные микроорганизмы), содержащим один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в одном или нескольких метаболических путей, которые катализируют превращение источника углерода в бутадиен, и к применениям таких микроорганизмов в производственных процессах, включая применение в получении бутадиена и получаемых из него продуктов.

Настоящее изобретение относится к способам получения бутадиена из ферментируемого источника углерода, включающим: получение ферментируемого источника углерода; приведение ферментируемого источника углерода в контакт с микроорганизмом, содержащим один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен в ферментационных средах; и экспрессию одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен в микроорганизме, с получением бутадиена.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, приведены в любой из таблиц 1-3.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, ферменты, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, приведены в любой из таблиц 1-3.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, бутадиен получают через промежуточные соединения ацетил-КоА и пропионил-КоА; промежуточное соединение кротонил-КоА; и/или промежуточное соединение муравьиную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение ацетил-КоА и пропионил-КоА в кетовалерил-КоА, кодируют кетотиолазу, включая, например, кетотиолазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 58-78.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение кетовалерил-КоА в (R) или (S) 3-гидроксиалерил-КоА, кодируют оксидоредуктазу, включая, например, оксидоредуктазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение (R) или (S) гидроксиалерил-КоА в 2-пентеноил-КоА, кодируют дегидратазу, включая, например, дегидратазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 37-55.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение of 2-пентеноил-КоА to 2-пентенов кислота кодируют трансферазу или гидролазу, включая, например, трансферазу или гидролазу, кодируемые полинуклеотидами, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-28 или 29-33, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 2-пентеновой кислоты в бутадиен, кодируют декарбоксилазу, включая, например, декарбоксилазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 79-98.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 2-пентеновой кислоты в 4-пентеновую кислоту, кодируют изомеразу, включая, например, и изомеразу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 99-102.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 4-пентеновой кислоты в бутадиен, кодируют декарбоксилазу, включая, например, декарбоксилазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 79-98.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 2-пентеноил-КоА в пент-2,4-диеноил-КоА, кодируют дегидрогеназу, включая, например, дегидрогеназу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 124-139.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение пент-2,4-диеноил-КоА в пент-2,4-диеновую кислоту, кодируют трансферазу или гидролазу, включая, например, трансферазу или гидролазу, кодируемые полинуклеотидами, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-28 или 29-33, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 2,4-пентеновой кислоты в бутадиен, кодируют декарбоксилазу, включая, например, декарбоксилазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 79-98.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение кротонил-КоА в кротониловый спирт, кодируют оксидоредуктазу, включая, например, оксидоредуктазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение кротонил-КоА в кротоновый альдегид, кодируют оксидоредуктазу, включая, например, оксидоредуктазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение кротонового альдегида в кротониловый спирт, кодируют оксидоредуктазу или КоА-синтетазу, включая, например, оксидоредуктазу или синтетазу, кодируемые полинуклеотидами, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123 или SEQ ID NO: 34-36, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение кротонилового спирта в бутадиен, кодируют дегидратазу, включая, например, дегидратазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 37-55.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение CO₂ в муравьиную кислоту, кодируют дегидрогеназу, включая, например, дегидрогеназу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 124-139.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение пирувата и КоА в ацетил-КоА и муравьиную кислоту, кодируют кетотиолазу, включая, например, кетотиолазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 58-78.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение муравьиной кислоты в формил-КоА, кодируют трансферазу или КоА-синтетазу, включая, например, трансферазу или КоА-синтетазу, кодируемые полинуклеотидами, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-28 или 34-36, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 2 ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, кодируют кетотиолазу, включая, например, кетотиолазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 58-78.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение ацетоацетил-КоА и формил-КоА в 3,5-кетовалерил-КоА, кодируют кетотиолазу, включая, например, кетотиолазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 58-78.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 3,5-кетовалерил-КоА в (R)- или (S)-5-гидрокси-3-кетовалерил-КоА, кодируют оксидоредуктазу, включая, например, оксидоредуктазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение (R)- или (S)-5-гидрокси-3-кетовалерил-КоА в (R)- или (S)-3,5-дигидроксиалерил-КоА, кодируют оксидоредуктазу, включая, например, оксидоредуктазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 103-123.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение (R)- или (S)-3,5-дигидроксиалерил-КоА в (R) или (S) 3-гидрокси-4-пентеноил-КоА, кодируют дегидратазу, включая, например, дегидратазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 37-55.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение (R)- или (S)-3-гидрокси-4-пентеноил-КоА в 3-гидрокси-4-пентеновую кислоту, кодируют трансферазу или гидролазу, включая, например, трансферазу или гидролазу, кодируемые полинуклеотидами, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-28 или 29-33, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение 3-гидрокси-4-пентеновой кислоты в бутадиен, кодируют декарбоксилазу, включая, например, декарбоксилазу, кодируемую полинуклеотидом, как указано в любой из SEQ ID NO: 79-98.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм представляет собой бактерию, выбранную из родов, состоящих из: Burkholderia, Propionibacterium, Propionispira, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Pelobacter или Lactobacillus.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм представляет собой эукариотический организм, представляет собой дрожжи, нитевидные грибы, простейших или водоросли.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis или Pichia pastoris.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, источник углерода представляет собой сок сахарного тростника, патоку сахарного тростника, гидролизованный крахмал, гидролизованный лигноцеллюлозные вещества, глюкозу, сахарозу, фруктозу, лактат, лактозу, ксилозу, пируват или глицерин в любой их форме или смеси.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, источник углерода представляет собой моносахарид, олигосахарид или полисахарид.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм секретирует бутадиен в ферментационные среды.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, способы дополнительно могут включать извлечение бутадиена из ферментационных сред.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм генетически модифицирован так, чтобы экспрессировать один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, превращение ферментируемого источника углерода в бутадиен положительно по АТФ (например, в нем образуется свободный АТФ на моль продуцируемого бутадиена), и его дополнительно можно комбинировать с потребляющим NADH метаболическим путем для обеспечения анаэробного процесса получения бутадиена.

Настоящее изобретение также относится к микроорганизмам, содержащим один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, приведены в любой из таблиц 1-3.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, ферменты, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, приведены в любой из таблиц 1-3.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, бутадиен получают через промежуточные соединения ацетил-КоА и пропионил-КоА; промежуточное соединение кротонил-КоА и/или промежуточное соединение муравьиную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм представляет собой бактерию, выбранную из родов, состоящих из: Burkholderia, Propionibacterium, Propionispira, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Pelobacter или Lactobacillus.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм представляет собой эукариотический организм, представляет собой дрожжи, нитевидные грибы, простейших или водоросли.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis или Pichia pastoris.

В некоторых вариантах осуществления, которые можно комбинировать с любым из указанных выше или ниже вариантов осуществления, микроорганизм генетически модифицирован так, чтобы экспрессировать один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения более подробно описаны далее в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Указанное выше краткое изложение, а также следующее далее подробное описание изобретения, будут лучше понятны при чтении в сочетании с приложенными фигурами. С целью иллюстрации изобретения на фигурах представлены предпочтительные в настоящем изобретении варианты осуществления. Однако следует понимать, что изобретение не ограничено представленными определенными схемами, примерами и средствами.

На фиг. 1 представлен иллюстративный метаболический путь получения бутадиена из ферментируемого источника углерода через промежуточные соединения ацетил-КоА и пропионил-КоА.

На фиг. 2 представлен иллюстративный метаболический путь получения бутадиена из ферментируемого источника углерода через промежуточное соединение кротонил-КоА.

На фиг. 3 представлен иллюстративный метаболический путь получения бутадиена из ферментируемого источника углерода через промежуточное соединение муравьиную кислоту.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретении в основном относится к микроорганизмам (например, неприродным микроорганизмам; модифицированным микроорганизмам), содержащим генетически модифицированный метаболический путь, и к применениям микроорганизмов для превращения ферментируемого источника углерода в бутадиен (см. фиг. 1-3). Такие микроорганизмы содержат один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в бутадиен через новые ферментативные метаболические пути. Необязательно получаемый бутадиен можно затем превращать в полибутадиен или любой ряд других содержащих бутадиен полимеров.

Частично настоящее изобретение относится к открытию новых ферментативных путей, включая, например, новые комбинации ферментативных путей получения бутадиена из источника углерода (например, ферментируемого источника углерода). Ферментативные пути, описываемые в настоящем документе, обеспечивают ферментативное получение бутадиена через: промежуточные соединения ацетил-КоА и пропионил-КоА; промежуточное соединение кротонил-КоА и/или промежуточное соединение муравьиную кислоту.

Предоставляемые в настоящем документе способы обеспечивают конечные результаты, сходные с результатами при стерилизации без высоких капиталовложений и непрерывных повышенных производственных затрат, которые, как правило, необходимы для установления и поддержания стерильности на протяжении всего способа получения. В этом отношении, наиболее промышленно значимые способы получения бутадиен используют в присутствии значительных количеств бактериальных загрязнителей вследствие аэробного характера их процессов. Полагают, что бактериальное загрязнение способов получения бутадиена вызывает снижение выхода продукта и ингибирование роста микроорганизма, продуцирующего бутадиен. В предлагаемых по настоящему заявлению способах такие недостатки предшествующих способов устранены, так как токсичная природа продуцируемого бутадиена уменьшает загрязнители в способе получения.

Ферментативные пути, описываемые в настоящем документе, имеют преимущество над известными предшествующими ферментативными путями получения бутадиена в том, что ферментативные пути, описываемые в настоящем документе, положительны по АТФ, и при комбинации с потребляющим NADH метаболическим путем это может обеспечить анаэробный метаболический путь бутадиена. Хотя для получения бутадиена возможно использовать аэробные процессы, анаэробные процессы являются предпочтительными вследствие риска потерь, когда олефины (которые по своему характеру являются взрывчатыми) в процессе ферментации, особенно при ферментации бутадиена, смешивают с кислородом. Кроме того, подача кислорода и азота в ферментер требует дополнительных инвестиций в воздушный компрессор, ферментеры (барботажная колонна или воздухоструйный ферментер), контроль температуры и азота. Присутствие кислорода также может катализировать полимеризацию бутадиена и может способствовать росту аэробных загрязнителей в ферментируемом бульоне. Кроме того, у процессов аэробной ферментации при получения бутадиена в промышленном масштабе (там, где технически сложно поддерживать асептические условия) существует несколько недостатков, таких как факты того, что: (i) получают большую биомассу, снижая общие выходы углерода для желаемых продуктов; (ii) присутствие кислорода способствуют росту загрязнителей (Weusthuis et al., 2011, Trends in Biotechnology, 2011, Vol. 29, No. 4, 153-158) и (iii) смесь кислорода и газообразных соединений, таких как бутадиен, создают серьезные риски взрыва, (iv) кислород может катализировать нежелательную реакцию полимеризации олефина и, наконец, (v) обеспечена повышенная стоимость ферментации и очистки в аэробных условиях. Кроме того, бутадиен, получаемый способами, описанными в настоящем документе, не разбавлен O₂ и N₂, таким образом, устраняя необходимость в потребляющей средства и время очистке получаемого бутадиена.

Следует понимать, что этапы, включенные в любой и все способы, описываемые в настоящем документе, можно проводить в любом порядке, и их не следует ограничивать лимитировать или ограничивать порядком, в котором они конкретно указаны. Например, настоящее изобретение относится к способам получения бутадиена из ферментируемого источника углерода, включающим: получение ферментируемого источника углерода; приведение ферментируемого источника углерода в контакт с микроорганизмом, содержащим один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, в ферментационных средах; и экспрессию в микроорганизме одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, с получением бутадиена. По существу, экспрессию в микроорганизме одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, с получением бутадиена можно проводить до или после приведения ферментируемого источника углерода в контакт с микроорганизмом, содержащим один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, который катализирует превращение ферментируемого источника углерода в одно или несколько промежуточных соединений в метаболическом пути получения бутадиена, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих ферменты в метаболическом пути, которые катализируют превращение одного или нескольких промежуточных соединений в бутадиен, в ферментационных средах.

Также следует понимать, что микроорганизмы, описываемые в настоящем документе, могут содержать целый метаболический путь, описанный на любой из фиг. 1-3, включая все полинуклеотиды, которые кодируют ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в бутадиен. Альтернативно, также следует понимать, что микроорганизмы, описываемые в настоящем документе, могут содержать один или несколько из полинуклеотидов, кодирующих ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в бутадиен на любой из фиг. 1-3 (например, микроорганизм может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более полинуклеотидов, которые кодируют ферменты, которые катализируют превращение ферментируемого источника углерода в бутадиен, как описано на любой из фиг. 1-3.

В некоторых вариантах осуществления отношение количества грамм получаемого бутадиена к количеству грамм ферментируемого источника углерода составляет 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49, 0,50, 0,51, 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85, 0,86, 0,87, 0,88, 0,89, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 или 1,00.

В некоторых вариантах осуществления количество моль углерода в получаемом бутадиене составляет 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от количества моль углерода в ферментируемом источнике углерода.

Как используют в настоящем документе, "бутадиен" предназначен для обозначения бута-1,3-диена или 1,3-бутадиена (CAS 106-99-0)c общей формулой CH₂=CH-CH=CH₂ и молекулярной массой 54,09 г/моль.

Как используют в настоящем документе, термин "биологическая активность" или "функциональная активность", когда он относится к белку, полипептиду или пептиду, может означать, что белок, полипептид или пептид проявляют функциональность или свойство, полезное в отношении определенного биологического процесса, метаболического пути или реакции. Биологическая или функциональная активность может относиться, например, к способности к взаимодействию или ассоциации (например, связыванию) с другим полипептидом или молекулой, или она может относиться к способности катализировать или регулировать взаимодействие других белков или молекул (например, ферментативные реакции).

Как используют в настоящем документе, термин "культивирование" может относиться к выращиванию популяции клеток, например, микробных клеток, в подходящих условиях роста в жидкой или на твердой среде.

Как используют в настоящем документе, термин "полученный из" может включать термины происходящий из, полученный из, получаемый из, выделяемый из и сделанный из и, как правило, означает, что указанный материал имеет происхождение в другом указанном материале или имеет характеристики, которые можно описать со ссылкой на другой указанный материал.

Как используют в настоящем документе, термин "экспрессирующий вектор" может относиться к конструкции ДНК, содержащей полинуклеотид или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид или белок, такую как кодирующая последовательность ДНК (например, последовательность гена), которая функционально связана с одной или несколькими подходящими контрольными последовательностями, способными влиять на экспрессию кодирующей последовательности у хозяина. Такие контрольные последовательности включают промотор для влияния на транскрипцию, необязательную управляющую последовательность для контроля такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие участки связывания рибосом в мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации в подходящего хозяина, вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина (например, автономный вектор или плазмида) или, в некоторых случаях, может самостоятельно интегрироваться в геном (например, интегрированный вектор). Наиболее широко используемой формой вектора является плазмида. Однако изобретение предназначено для включения других таких форм экспрессирующих векторов, которые выполняют эквивалентные функции и которые известны или станут известны в данной области.

Как используют в настоящем документе, термин "экспрессия" может относиться к процессу, посредством которого образуется полипептид на основе последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды (например, гена). Процесс включает и транскрипцию, и трансляцию.

Как используют в настоящем документе, термин "ген" может относиться к участку ДНК, который участвует в продукции полипептида или белка (например, слитого белка) и включает области предшествующие и следующие за кодирующей областью, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами).

Как используют в настоящем документе, термин "гетерологичный", по отношению к нуклеиновой кислоте, полинуклеотиду, белку или пептиду, может означать нуклеиновую кислоту, полинуклеотид, белок или пептид, которые в природе не встречаются в указанной клетке, например, клетке-хозяине. Следует понимать, что термин включает белки, которые кодируют природные гены, мутантные гены и/или синтетические гены. В отличие от этого, термин гомологичный, в отношении нуклеиновой кислоты, полинуклеотида, белка или пептида относится к нуклеиновой кислоте, полинуклеотиду, белку или пептиду, которые встречаются в клетке в природе.

Как используют в настоящем документе, термин "клетка-хозяин" может относиться к клетке или линии клеток, включая такие клетки, как микроорганизм, которые можно трансфицировать рекомбинантным экспрессирующим вектором для экспрессии полипептида или белка (например, слитого белка). Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство не обязательно может являться полностью идентичным (по морфологии или общей геномной комплементарной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин может включать клетки, трансфицированные или трансформированные экспрессирующим вектором in vivo.

Как используют в настоящем документе, термин "вносимая" в отношении встраиваемой в клетку последовательности нуклеиновой кислоты или полинуклеотидной последовательности, может включать трансфекцию, трансформацию или трансдукцию и относится к внесению последовательности нуклеиновой кислоты или полинуклеотидной последовательности в эукариотическую или прокариотическую клетку, где последовательность нуклеиновой кислоты или полинуклеотидная последовательность может встраиваться в геном клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или экспрессироваться транзиторно.

Как используют в настоящем документе, термин "неприродный", когда его используют по отношению к микробному организму или микроорганизму по изобретению, предназначен для обозначения того, что микроорганизм содержит по меньшей мере одно генетическое изменение, в норме не встречающееся в природном штамме указанного вида, включая штаммы дикого типа указанного вида. Генетические изменения включают, например, модификации с внесением экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей метаболические полипептиды, другие добавления нуклеиновых кислот, делеции нуклеиновых кислот и/или другие функциональные нарушения генетического материала микроорганизма. Такие модификации включают, например, кодирующие области и их функциональные фрагменты для гетерологичных, гомологичных или и гетерологичных, и гомологичных полипептидов для указанного вида. Дополнительные модификации включают, например, некодирующие регуляторные области, в которых модификации изменяют экспрессию гена или оперона. Неприродные микроорганизмы по изобретению могут нести стабильные генетические изменения, что означает микроорганизмы, которые можно культивировать в течение более чем пяти поколений без потери изменения. Как правило, стабильные генетические изменения включают модификации, которые сохраняются более чем у 10 поколений, в частности стабильные модификации могут сохраняться более чем приблизительно у 25 поколений, а более конкретно, стабильные генетические модификации присутствуют более чем у 50 поколений, включая бесконечное количество. Специалисты в данной области понимают, что генетические изменения, включая модификации метаболизма, проиллюстрированные в настоящем документе, описаны в отношении подходящего организма-хозяина, такого как E. coli и соответствующих их метаболических реакций, или подходящего организма-источника для желаемого генетического материала, такого как гены, для желаемого метаболического пути. Однако, учитывая полное секвенирование геномов широкого спектра орг