Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов

Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение испрашивает приоритет по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2013-0126216, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2013 г., и по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2014-0143377, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2014 г., содержание которых полностью включено в материалы настоящей заявки посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста, гепатоцитов или полинуклеотид, кодирующий изоформы, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза.

Предшествующий уровень техники

Боковой амиотрофический склероз (БАС), являющийся заболеванием двигательных нейронов, был впервые описан в 1869 г. французским врачом Жаном-Мартеном Шарко. Обычные люди узнали о БАС, когда в 1939 г. этот диагноз был поставлен Лу Геригу, знаменитому бейсболисту из США, и с этого времени БАС называют болезнью Лу Герига.

Прогноз в случае БАС основан на клинических признаках, результатах электрофизиологических диагностических тестов и исключении других медицинских состояний, сопровождающихся такими же симптомами. Молекулярно-генетический тест, который можно использовать в клинических тестах, связанных с некоторыми генами, участвующими в развитии БАС, играет важную роль в определении генотипа и генетическом консультировании.

БАС может наследоваться по аутосомно-доминантному типу, аутосомно-рецессивному типу или X-сцепленному типу. Генетическое консультирование и оценка риска зависят от точной диагностики конкретных генов.

Рилузол известен как лекарственный препарат, используемый для замедления прогрессирования БАС. Известно, что рилузол может снижать скорость прогрессирования БАС за счет ингибирования избытка глутаминовой кислоты, которую считают одной из причин деструкции двигательных нейронов. Однако клинические эффекты рилузола не облегчают симптомы БАС, и результаты его использования не выявили заметного увеличения продолжительности жизни без трахеостомы у пациентов с БАС, которым не была выполнена трахеостомия. Как указано выше, истинные клинические эффекты рилузола, который помогает пациентам с БАС, оказались очень ограниченными и неопределенными (Stewart et al., 2001). Тем не менее, нет эффективного профилактического или терапевтического средства для БАС, кроме рилузола, имеющего хотя бы сомнительную клиническую эффективность, и поэтому необходима разработка лекарственных средств, оказывающих эффекты предупреждения или лечения БАС.

Между тем, из предшествующего уровня техники известны векторы экспрессии, используемые в качестве системы доставки генов для генетической терапии. Подробное описание вектора рСК, использованного в примере осуществления настоящего изобретения, приведено в публикации PCT/KR1999/000855. Кроме того, в публикации PCT/KR2003/000548 раскрыта композиция, содержащая рекомбинантный вектор pCK-HGFX7, использованный в настоящем изобретении, предназначенная для лечения или предупреждения ишемических болезней или поражений печени. Содержание PCT/KR1999/000855 и PCT/KR2003/000548 полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

В настоящей публикации даны ссылки на многочисленные статьи и патентные документы и приведены цитаты из них. Содержание процитированных статей и патентных документов полностью включено в данную заявку посредством ссылки, а область техники, к которой относится настоящее изобретение, и признаки настоящего изобретения разъяснены более подробно.

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз (БАС). В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF; от англ.: hepatocyte growth factor) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и таким образом выполнили настоящее изобретение.

Поэтому аспектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.

Другим аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.

Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания изобретения, формулы изобретения и графических материалов.

Техническое решение

Согласно первому аспекту настоящего изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза; эта композиция содержит в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.

Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз. В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.

Стратегия терапии по настоящему изобретению может быть грубо классифицирована на два типа: белковая терапия и генная терапия. Согласно стратегии белкового терапевтического агента по настоящему изобретению используют два или более типов изоформ белков HGF. В то же время согласно стратегии генного терапевтического агента по настоящему изобретению используют по меньшей мере одну последовательность нуклеотидов, кодирующую два или более типов изоформ HGF. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, может быть обеспечена одним полинуклеотидом или раздельными полинуклеотидами. Предпочтительно полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, обеспечена одним полинуклеотидом.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «изоформа HGF» относится к полипептиду HGF, содержащему последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична природной последовательности аминокислот HGF у животного, включая все аллельные варианты. Например, термин «изоформа HGF» имеет значение, которое включает нормальную форму или дикий тип HGF и различные варианты HGF (например, сплайсинговые варианты и делегированные варианты).

В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (flHGF; от англ.: full-length HGF) и делетированный вариант HGF (dHGF; от англ.: deleted variant HGF). Использование композиции, содержащей полноразмерный HGF и делетированный вариант HGF, может эффективно предотвращать или лечить БАС.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «flHGF» относится к последовательности аминокислот с 1 по 728 белка HGF животного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «dHGF» относится к делетированному варианту белка HGF, полученного посредством альтернативного сплайсинга гена HGF животного, предпочтительно млекопитающего, и более предпочтительно термин относится к HGF человека, содержащему 723 аминокислоты, с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом крингл-домене альфа-цепи последовательности полноразмерного HGF.

В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

В варианте осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению кодируются отдельными последовательностями нуклеотидов или одной последовательностью нуклеотидов. Соответственно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит два или более полинуклеотидов, если различные типы изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, и содержит по меньшей мере один полинуклеотид, включающий единый полинуклеотид, если различные типы изоформ HGF кодируются одной полинуклеотидной последовательностью. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть функционально связан с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью (например, с промотором или энхансером), регулирующей экспрессию изоформ HGF.

Если два или более типов изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, то кассета экспрессии может быть сконструирована двумя способами. Согласно первому способу кассету экспрессии конструируют посредством присоединения последовательности, регулирующей экспрессию, к кодирующей последовательности (CDS; от англ.: coding sequence) каждой изоформы. Согласно второму способу кассету экспрессии конструируют с использованием сайта внутренней посадки рибосом (IRES; от англ.: internal ribosomal entry site) и 2А-пептидов, например - «последовательность, регулирующая экспрессию - первая изоформа CDS - IRES - вторая изоформа CDS - последовательность терминации транскрипции». IRES обеспечивает начало трансляции с последовательности IRES, за счет чего экспрессируются два или более генов, представляющих интерес, в одной и той же конструкции.

Если два или более типов изоформ HGF кодируются одним полинуклеотидом, то полинуклеотид, кодирующий два или более типов изоформ, функционально связан с одной регулирующей экспрессию последовательностью.

В настоящем изобретении изоформы HGF могут кодироваться гибридным геном HGF, который одновременно экспрессирует два или более различных типов изоформ HGF, например-flHGF и dHGF.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит кДНК, соответствующую экзонам с 1 по 18 HGF человека, и интрон 4 гена HGF человека или его фрагмент, который инсерцирован между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК.

Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 3 по SEQ ID NO: 10.

Гибридный ген HGF, содержащий интрон 4, имеет длину, равную 7113 bp (пар оснований; от англ.: base pairs), и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Гибридный ген HGF может избирательно содержать фрагмент интрона 4 между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК HGF.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5, содержит: интрон 4 гена HGF человека, нуклеотиды с 392 по 2247, нуклеотиды с 392 по 727, нуклеотиды с 2229 по 5471, нуклеотиды с 5117 по 5471, нуклеотиды с 3167 по 5471, нуклеотиды с 4167 по 5471, или их комбинацию, из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 3.

Более предпочтительно последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5 терапевтической последовательности нуклеотидов, используемой в настоящем изобретении, является (i) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iv) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (v) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vi) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; или (viii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3.

Терапевтическая последовательность нуклеотидов по настоящему изобретению в зависимости от последовательности, дополнительно инсерцированной между экзоном 4 и экзоном 5, в конечном итоге выглядит следующим образом: (i) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 2297 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (ii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 392 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iv) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (v) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 2229 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vi) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 3167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); и (viii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18).

В данной публикации гибридный ген HGF, содержащий фрагмент интрона 4, называют «HGF-Х», и HGF-X включает HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7 и HGF-X8, которые содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NOs: с 4 по 10. В настоящем изобретении предпочтительно используют HGF-X7. «Изоформа HGF», «HGF-Х» и «HGF-X7» из настоящего изобретения описаны в публикации PCT/KR2003/000548, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.

Аминокислотные или нуклеотидные последовательности изоформ HGF, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, конструируют так, чтобы они включали аминокислотные или нуклеотидные последовательности, по существу идентичные последовательностям изоформ дикого типа HGF человека. Термин «по существу идентичные» означает, что аминокислотную или нуклеотидную последовательность изоформы дикого типа HGF человека и другую нуклеотидную последовательность выравнивают так, чтобы они как можно больше соответствовали друг другу, и выравненные последовательности анализируют с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области техники. Аминокислотная или нуклеотидная последовательность изоформы дикого типа HGF человека демонстрирует по меньшей мере 80%-ную идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность. Способы выравнивания для сравнения последовательностей хорошо известны в данной области техники. Различные способы и алгоритмы выравнивания раскрыты в публикациях Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Соmр. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992); и Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The Пакет программ NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) можно получить через Национальный центр биотехнологической информации США (NCBI), и его можно использовать в Интернете совместно с такими программами для анализа последовательностей, как blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx. В пакет BLAST можно войти по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Способ сравнения идентичности последовательностей с использованием этого пакета программ можно подтвердить по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «предотвращение» относится к действиям по подавлению бокового амиотрофического склероза или задержке прогрессирования бокового амиотрофического склероза посредством введения композиции по настоящему изобретению.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «лечение» относится к: (а) подавлению прогресса бокового амиотрофического склероза, (b) облегчению бокового амиотрофического склероза или (с) устранению бокового амиотрофического склероза.

Композиция по настоящему изобретению может предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз за счет образования и роста аксонов и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.

Композицию по настоящему изобретению можно применять in vivo с использованием различных способов доставки, которые известны специалистам в области генной терапии.

В варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению является депротеинизированной ДНК или содержится в системе доставки гена. Примерами системы доставки гена являются плазмида, вектор и вирусный вектор.

(i) Плазмида (вектор)

Плазмиду (вектор) можно использовать в качестве системы доставки, которая доставляет полинуклеотид по настоящему изобретению. Полинуклеотид, включенный в вектор, предпочтительно находится в соответствующей кассете экспрессии. Предпочтительно полинуклеотид функционально связан с промотором в кассете экспрессии.

При использовании в контексте настоящего изобретения термин «функционально связан» относится к функциональной связи между регулирующей экспрессию последовательностью нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или последовательностью из фактора регуляции транскрипции) и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, и за счет этой связи регуляторная последовательность регулирует транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности нуклеиновой кислоты.

В настоящем изобретении промотор, связанный с полинуклеотидной последовательностью, может регулировать транскрипцию нуклеотидной последовательности в клетках животных, предпочтительно в клетках млекопитающих, и более предпочтительно в клетках человека, и содержит, например, промоторы, полученные из вирусов млекопитающих, и промоторы, полученные из геномов клеток млекопитающих. Примерами могут служить промотор цитомегаловируса (CMV; от англ.: cytomegalovirus), поздний промотор аденовируса, промотор гена белка 7,5 кДа вируса коровьей оспы, промотор вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40; от англ.: simian virus 40), промотор гена тимидинкиназы (tk; от англ.: thymidine kinase) вируса простого герпеса (HSV; от англ.: herpes simplex virus), промотора вируса саркомы Рауса (RSV; от англ: Rouse sarcoma virus), промотора альфа-субъединицы фактора 1 элонгации трансляции (EF1; от англ: elongation factor 1), промотора металлотионеина, промотора бета-актина, промотора гена интерлейкина-2 (IL-2; от англ.: interleukin-2) человека, промотора гена интерферона (IFN; от англ.: interferon) человека, промотора гена IL-4 человека, промотора гена лимфотоксина человека и промотора гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF; от англ.: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), но не ограничиваются ими. Еще более предпочтительно промотор, используемый в настоящем изобретении, является промотором, полученным из немедленного раннего (IE; от англ.: immediately early) гена CMV человека (hCMV; от англ.: human cytomegalovirus), или промотором альфа-субъединицы EF1, и наиболее предпочтительно - 5'-нетранслируемой областью (UTR; от англ.: untranslated region), включающей промотор/энхансер и полную последовательность экзона 1, непосредственно прилегающую к кодону инициации ATG-последовательности экзона 2 IE-гена hCMV.

Кассета экспрессии, используемая в настоящем изобретении, может включать последовательность полиаденилации, например терминатор бычьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), последовательность полиаденилации, полученную из SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), шпильку polyA ВИЧ-1 (Klasens, В. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), шпильку polyA β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), шпильку polyA HSV TK (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) или шпильку polyA вируса полиомы (Batt, D.В and G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)), но не ограничивается ими.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения векторы рСК, рСР, pVAX1 или pCY могут быть использованы в качестве системы доставки полинуклеотида, и более предпочтительно может быть использован вектор рСК. Вектор рСК подробно описан в публикации WO 2000/040737, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.

(ii) Ретровирус

Ретровирус может внедрять свой ген в геном организма-хозяина для доставки многих экзотических генетических материалов, и спектр инфицируемых им клеток очень широк, так что большинство ретровирусов используют в качестве векторов доставки генов.

Для конструирования ретровирусного вектора полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, но не ретровирусную последовательность, инсерцируют в ретровирусный геном, получая тем самым вирусы с нарушенной репликацией. Для продукции вириона сконструирована пакующая клеточная линия, содержащая gag, pol и env гены, но не содержащая последовательности длинного терминального повтора (LTR; от англ.: long terminal repeat) и ψ-непоследовательности (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)). Если рекомбинантную плазмиду, содержащую полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, LTR-последовательность и ψ-последовательность внедряют в клеточную линию, ψ-последовательность обеспечивает продукцию РНК-транскриптов рекомбинантной плазмиды, и эти транскрипты упаковываются с вирусами, которые выбрасываются в среду (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, собирают и концентрируют, а затем используют в качестве системы доставки гена.

Описана доставка гена с использованием ретровирусных векторов второго поколения. Kasahara et al. получили вариант вируса мышиного лейкоза Молони и химерный белок, обладающий новыми характеристиками связывания, посредством инсерцирования последовательности эритропоэтина (ЕРО; от англ.: erythropoietin) в сайт оболочки вируса (Science, 266: 1373-1376 (1994)). Полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению также можно включить в ретровирус согласно стратегии конструирования ретровирусных векторов второго поколения.

(iii) Аденовирус

Аденовирус обычно использовали в качестве вектора для доставки генов из-за средних размеров его генома, легкости генной инженерии, высокого титра, широкого спектра клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца генома содержат инвертированные терминальные повторы (ITRs; от англ.: inverted terminal repeats) размером 100-200 bp, которые являются цис-элементами, необходимыми для репликации и упаковки ДНК. Область Е1 (Е1А и Е1В) генома кодирует белки, ответственные за регуляцию транскрипции вирусного генома, и транскрипцию генов клетки-хозяина. Область Е2 (Е2А и Е2В) кодирует белки, участвующие в репликации вирусной ДНК.

Кроме разработанных к настоящему времени аденовирусных векторов обычно используют аденовирус с нарушенной репликацией, в котором делетирована область Е1. Однако делетированная Е3 область в нормальных аденовирусных векторах может обеспечить сайт инсерции для экзотических генов (Thimmappaya, В. et al., Cell, 31: 543-551 (1982); и Riordan, J.R. et al., Science, 245: 1066-1073 (1989)). Поэтому полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению предпочтительно инсерцируют либо в делетированную область Е1 (область Е1А и/или область Е1В), либо в делетированную Е3 область. Кроме того, полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно также инсерцировать в делетированную область Е4. В контексте настоящего изобретения термин «делеция», использованный в отношении последовательностей из вирусных геномов, охватывает полную делецию соответствующей последовательности и ее частичную делецию. Кроме того, аденовирус может включать примерно 105% генома дикого типа, обеспечивая емкость для примерно 2 дополнительных kb ДНК (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)). Поэтому указанные экзотические последовательности, инсерцированные в аденовирус, могут быть дополнительно соединены с аденовирусным геномом.

Аденовирус может быть любым из 42 различных серотипов и подгрупп A-F. Из них аденовирус типа 5, относящийся к подгруппе C, является наиболее предпочтительным исходным материалом для получения аденовирусного вектора по настоящему изобретению. Биохимическая и генетическая информация относительно аденовируса типа 5 хорошо известна. Экзотические гены, доставленные аденовирусом, реплицируются так же, как в эписоме, и поэтому обладают низкой генотоксичностью для клеток хозяина. Поэтому генная терапия с использованием аденовирусной системы доставки генов определена как безопасная.

(iv) Вектор AAV

Аденоассоциированные вирусы (AAV; от англ.: adeno-associated viruses) способны инфицировать не делящиеся клетки и обладают способностью инфицировать различные типы клеток; поэтому они пригодны для использования в качестве системы доставки генов по настоящему изобретению. Подробные описания применения и получения AAV-вектора приведены в публикациях US 5,139,941 и US 4,797,368.

Результаты исследования AAV как системы доставки генов приведены в публикациях La Face et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp.Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994), и Flotte et al., Gene Therapy, 2: 29-37 (1995). Недавно AAV-вектор был утвержден для клинических исследований Фазы I на человеке с целью лечения муковисцидоза.

В характерном случае AAV-вирус получают посредством котрансфицирования плазмиды, содержащей последовательность целевого гена, фланкированную двумя терминальными повторами AAV (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963-1973 (1988); и Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)), и экспрессирующей плазмиды, содержащей кодирующую последовательность AAV дикого типа без терминальных повторов (McCarty et al., J. Virol., 65: 2936-2945 (1991)).

(v) Другие вирусные векторы

Другие вирусные векторы можно использовать для доставки полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в биологический организм. Векторы, полученные из вирусов, таких как вирус коровьей оспы (Puhlmann М. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) и Coupar et al., Gene, 68: 1-10 (1988)), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): R55-62 (1999)), или вирус простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 1411-1415 (1995)), также можно использовать в качестве системы доставки, способной доставлять полинуклеотид в клетки,

(vi) Липосомы

Липосомы образуются спонтанно из фосфолипидов, суспензированных в водной среде. Опосредованная липосомами доставка экзотической молекулы ДНК оказалась очень успешной, как описано в публикации Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). Липосомы, содержащие полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, доставляют полинуклеотидную последовательность в клетки за счет взаимодействия с клетками по таким механизмам, как эндоцитоз, адсорбция на поверхностях клеток и слияние с плазматическими мембранами клеток.

В тех случаях, когда полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению включена в депротеинизированную рекомбинантную молекулу ДНК или в плазмиду (вектор), полинуклеотидную последовательность можно ввести в клетки посредством микроинъекции (Capecchi, M.R., Cell, 22: 479 (1980); и Harland & Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)), осаждения фосфатом кальция (Graham, F.L. et al., Virology, 52: 456 (1973); и Chen & Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)), электропорации (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982); и Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718 (1986)), опосредованной липосомами трансфекции (Wong, Т.К. et al., Gene, 10: 87 (1980); Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982); и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), обработки диэтиламиноэтил-декстраном (DEAE-dextran; от англ.: diethylaminoethyldextran) (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)) и бомбардировки генами (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)).

Если полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению сконструирована на основе вирусного вектора, полинуклеотидную последовательность можно доставить в клетки различными способами инфицирования вирусами, известными в данной области техники. Инфицирование клеток хозяина с использованием вирусных векторов описано в публикациях, процитированных выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектором по настоящему изобретению является плазмида, и наиболее предпочтительно может быть использован вектор рСК. Примером рекомбинантного вектора, содержащего один полинуклеотид, экспрессирующий два или более изоформ HGF, с использованием вектора рСК, может быть pCK-HGFX7, состав которого подробно описан в публикации PCT/KR 1999/000855 и PCT/KR 2003/000548, как указано выше.

Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, обычно используют для приготовления композиции, и примеры носителей могут включать, но не ограничиваются этим, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазывающее вещество, смачивающее средство, подсластитель, вкусовую добавку, эмульгатор, суспензирующее средство, консервант и т.п., помимо указанного выше ингредиента. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и добавки подробно описано в публикации Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

Предпочтительно фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно ввести парентерально, и, например, можно использовать внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение, интрадермальное введение, интраспинальное введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, паренхимальное введение, интракраниальное введение, внутримышечное введение или местное введение. Наиболее предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена внутримышечно, интраспинально, интратекально, интравентрикулярно, паренхимально или интракраниально.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и введена в форме инъекции. Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от ряда факторов, таких как способ приготовления, способ введения, возраст, масса тела и пол пациента, степень тяжести заболевания, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа, и практикующий врач сможет легко определить и назначить дозу, эффективно обеспечивающую желаемое лечение или предотвращение болезни.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг, а полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг. Если изоформы HGF или полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят повторно один или более раз, то доза при каждом введении может быть одинаковой или разной.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению приготавливают с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя способом, который легко может быть выполнен специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и фармацевтическую композицию можно приготовить в единичной лекарственной форме, или ее можно поместить в многодозовый контейнер. При этом лекарственная форма может быть раствором в масляной или водной среде, суспензией, эмульсией, экстрактом, порошком, гранулами, таблеткой или капсулой, и она может дополнительно содержать диспергатор или стабилизатор.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечен способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, который включает введение млекопитающему композиции, содержащей в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.

В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF по настоящему изобретению включают полноразмерный HGF (flHGF) и делетированный вариант HGF (dHGF).

В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Поскольку способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза по настоящему изобретению включает стадию введения фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, которая является аспектом настоящего изобретения, то перекрывающиеся описания были опущены во избежание чрезмерного усложнения публикации из-за повторных описаний.

Полезные эффекты

Признаки и преимущества настоящего изобретения можно обобщитьследующим образом:

(a) Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.

(b) Настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.

(c) Композицию или способ по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза за счет образования и роста аксонов в эмбриональных нервных клетках и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 изображает эффект pCK-HGFX7 на образование аксонов эмбриональных нервных клеток (ENC; от англ.: embryonic neuronal cells) согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 2 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост эмбриональных нервных клеток согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 3 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 4 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 5 изображает эффект pCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 7 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток, в которые была доставлена hSOD1 с мутацией G93A, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 8 изображает эффект pCK-HGFX7 на силу захвата лапы БАС-мышей согласно варианту осуществления настоящего изобретения.

Описание примеров осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры его осуществления. Эти примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.

Пример 1

Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на созревание эмбриональных нервных клеток (ENC)

Из эмбриона мыши взяли только участок коры головного мозга для разделения на отдельные клетки, после чего к культуральной среде добавили 10 мкМ Ara-С 10 для культивирования только нервных клеток. Для подтверждения эффекта pCK-HGFX7 на созревание ENC высеяли 2×10⁴ клеток и на следующий день клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F (Life Technologies, США), трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки уровня отрастания аксонов, обнаруживаемого в ходе созревания клеток. Уровень отрастания аксонов подтвердили с использованием иммуноцитохимии по экспрессии TUJ-1 - тубулинового белка, специфически экспрессируемого нервными клетками.

Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 1, длина аксонов была значимо большей в группе, обработанной pCK-HGFX7, чем в группе, обработанной рСК с целью контроля.

Пример 2

Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC

Проверили эффект pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC. Для этого высеяли 5×10⁴ ENC, после чего они созревали в течение 6 дней. Через 6 дней клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F, трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток. После 3 дней обработки pCK-HGFX7 был выполнен анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ) для измерения роста клеток.

Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 2, рост клеток значимо увеличивался примерно на 40% в группе, обработанной pCK-HGFX7, по сравнению с группой, обработанной рСК с целью контроля.

Пример 3

Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток и апоптоз двигательных нервн