Устойчивые к бактериям трансгенные растения

Устойчивые к бактериям трансгенные растения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение в некоторых вариантах своего осуществления связано с растениями, устойчивыми к бактериям, и способами создания таких растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ralstonia solanacearum (Rs), широко распространенная грамотрицательная почвенная патогенная бактерия, относящаяся протеобактериям β-класса, вызывает заболевания и приводит к гибели более чем 200 видов растений, в том числе экономически важных сельскохозяйственных культур, таких как томат, картофель и банан. Бактерия проникает через раны на корнях растения, внедряется в сосуды ксилемы и быстро распространяется по надземным органам растения посредством сосудистого транспорта. Вскоре обнаруживаются популяции более чем из 10¹⁰ бактериальных клеток на растение. Основной фактор вирулентности Rs - это экзополисахарид (ЭПС), длинный (более 106 Да) углеводный полимер, который закупоривает сосуды ксилемы, вызывает симптомы увядания и приводит в конечном итоге к гибели растения.

Rs демонстрируют удивительную способность секретировать более чем 100 белков. Например, система секреции II типа (T2SS) выделяет факторы, которые включают пектиназы, эндоглюканазы, разрушающие клеточную стенку растений, а позднее и вирулентный ЭПС (Фиг.1А-С). Система секреции III типа (T3SS) выделяет вызывающие инфекцию эффекторные белки (ТЗЕ) в клетки хозяина, чтобы изменить внутреннюю среду хозяина и подавить защитный ответ при заражении (Фиг.1А-С).

Система секреции III типа (T3SS) - это сложная молекулярная машина грамотрицательных бактерий, используемая для того, чтобы «впрыскивать» (переносить) бактериальные белки (эффекторы) в эукариотические клетки. Для этого T3SS должна собраться в мультибелковый комплекс, который состоит из различных частей: базальной части, соединяющей две бактериальные мембраны, связанной с цитоплазматическим пространством; закрепленной игольчатой структуры, сравнимой с молекулярным шприцем (инжектисома/пили); и дистального наконечника игольчатой структуры, преобразующегося затем в «транслокон», белковый комплекс, который вводится в мембрану клетки хозяина. Пили построены из белковых субъединиц только одного типа. Многочисленные субъединицы олигомеризуются в структуру пил ей. Такая игольчатая структура обеспечивает транспорт бактериальных белков по внутреннему каналу, «трубопроводу» инжектисомы на пути в клетку хозяина (Фиг.1А-С).

Таким образом, самым большим внеклеточным компонентом T3SS является инжектисома, которая тянется от участка молекулярной машины, расположенного на внешней мембране, а внутри нее проходит канал диаметром 25 Å, образующий секреторный «трубопровод» (параметры спирали инжектисомы: 5,5 субъединиц на оборот, увеличение длины спирали составляет 4,6 Å на субъединицу). Инжектисома формируется как спиральный комплекс из множества (порядка 100-150) копий единственного небольшого (9 кДа) белка. Несмотря на то, что между первичными последовательностями строительных блоков пилей большинства грамотрицательных бактерий наблюдается низкая степень гомологии, предполагается, что они имеют высокую степень структурной гомологии. У бактерий, патогенных для растений, T3SS кодируется генами hrp (hypersensitive response and pathogenicity, реакции гиперчувствительности и патогенности), которые получили такое название в связи с тем, что они необходимы бактериям, чтобы индуцировать заболевания у чувствительных к ним растений и вызывать реакцию гиперчувствительности у резистентных растений. Hrp гены были обнаружены почти во всех основных грамотрицательных патогенных для растений бактериях (например, Pseudomonas syringae, Xanthomonas spp., Ralstonia solanacearum и Erwinia spp.), что подтверждает ключевую роль T3SS как посредника во взаимодействии различных бактерий и растений. Таким образом, обычно внеклеточная игольчатая структура T3SS собирается в ходе пошаговой полимеризации основного компонента (например, HrpY у R. solanacearum, HrpA у P. syringae и Е. amylovora, HrpE у Xanthomonas campestris, MxiH у Shigella, PrgI у Salmonella и YscF у Yersinia).

Как упоминалось ранее, несмотря на то, что основная функция эффекторов III типа заключается в стимулировании чувствительности растений, некоторые эффекторы распознаются белками устойчивости растений, которые, в свою очередь, запускают защитные ответные реакции, в том числе, реакцию гиперчувствительности. Один из способов предлагает возможность борьбы со смертельными растительными инфекциями с помощью грамотрицательных бактерий, несущих в своем составе факторы, усиливающие иммунитет растений к таким патогенам.

В патентной заявке США №20090258825 (Не et al.) раскрыты композиции и способы для усиления защиты растений против патогенов, например, бактериальных патогенов. В соответствии с их методиками, усиление устойчивости растений к вирулентному белку HopM1 Pseudomonas syringae обеспечивается повышением активности ATMIN-ассоциированного защитного белка растений, такого как ATMIN7.

В патентной заявке США №20090044296 (Веег et al.) описываются способы усиления роста растений или передачи устойчивости растений к болезням посредством использования молекул нуклеиновых кислот, направленных на повышение или понижение экспрессии молекул нуклеиновых кислот, кодирующих Невзаимодействующий белок (например, HIPM). Способом делеционного анализа было показано, что 198-аминокислотный N-концевой участок HrpN (harpin) Erwinia amylovora, первый бесклеточный индуктор реакции гиперчувствительности, играющий решающую роль для вирулентности этого патогена, необходим для взаимодействия с HIPM.

Кроме того, увядание, вызванное бактериями, трудно контролировать из-за почвенного происхождения возбудителей. В растениях, инфицированных Rs, развитие заболевания зависит от активности систем секреции типов II и III, и мутации в одной из этих систем приводит к отсутствию патогенности у бактерий [Poueymiro et al., Curr. Opin. Microbiol. (2009) 12:44-52].

Roine и соавторы [Roine et al., FEBS Letters (1997) 417(2): 168-172] показали, что очищенный HrpA, структурный белок пилей Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, уже сам по себе достаточен для образования нитчатых структур путем самосборки.

Taira и соавторы [Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44] произвели мутации путем вставки в гене hrpA (например, пентапептидные вставки) и создали мутантные бактерии, экспрессирующие такие гены. Согласно их исследованиям, С-концевой участок hrpA является ключевым для сборки пилей и для бактериального взаимодействия с поражаемым растением. Кроме того, Wei и соавторы [Wei et al., PNAS (2000) 97(5):2247-2252] определили три единичные аминокислотные мутации в С-концевом участке HrpA, которые влияют на секрецию или регуляторную функцию белка HrpA. Эти результаты демонстрируют важнейшую роль гена структурного белка пилей Hrp в белковой секреции и согласованной регуляции системы секреции III типа Pseudomonas syringae. Более того, Lee и соавторы [Lee et al., J. Bio. Chem. (2005) 280: 21409-17] обнаружили, что некоторые пентапептид-содержащие нефункциональные белки HrpA при экспрессии в бактериях оказывают сильный доминантно негативный эффект на функцию HrpA дикого типа, блокируя способность Pseudomonas syringae вызывать ответ растения-хозяина и болезнь in vivo. Доминантные негативные мутанты HrpA также были способны препятствовать самосборке пилей из HrpA дикого типа in vitro.

Weber и соавторы [Weber and Koebnik, J. Bacteriology (2005) 187(17): 6175-6186] провели анализ гидрофобности нескольких белков пилей Hrp, таких как HrpE и HrpA из Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria и HrpY из R. Solanacearum, и обнаружили общий структурный домен. Учитывая эти данные, можно предположить, что патогенные для растений бактерии создавали структурно схожие белки для преодоления барьера клеточной стенки независимо друг от друга. Weber и соавторы далее сообщают, что мутанты HrpE с пентапептидными вставками в С-концевом участке ингибируют сборку пилей из Hrp у X. campestris pv. Vesicatoria. Морфологические исследования обнаружили, что мутанты со вставкой имеют укороченные Hrp-пили. Этот доминантно негативный эффект наводит на мысль, что мутантные варианты могут препятствовать сборке Hrp-пилей. Патентная заявка США №20100249234 (Yang et al.) описывает способы снижения вирулентности бактерий, такие как системы HrpX/HrpY-типа или T3SS-THna. Данный способ предполагает взаимодействие бактерии с эффективным количеством ингибитора фенилпропаноидного типа.

Патентная заявка США №20100099674 (Elofsson et al.) раскрывает способы снижения бактериальной вирулентности в растениях посредством ингибирования системы секреции III типа N-замещенным 7-хинолилметиламином и, особенно, производным этого вещества, замещенным по 5-му и 8-му положениям хинольного кольца.

Дополнительно уровень техники включает патентную заявку США №20050076406.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую доминантно негативный T3SS белок и цис-регуляторный элемент, который способен запускать транскрипцию нуклеотидной последовательности в растительной клетке; где доминантно негативный T3SS белок обеспечивает сборку нефункционального комплекса иглы.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены клетки-хозяева, содержащие экспрессионный вектор.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, содержащее экспрессионный вектор.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, экспрессирующее экзогенный полинуклеотид, кодирующий доминантно негативный T3SS белок, приведенный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения растений, имеющих повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированными растениями; этот способ подразумевает введение в растение или растительную клетку экспрессионного вектора, создавая, таким образом растение, имеющее повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением.

Предусмотрен способ оценки устойчивости растения к бактериальным патогенам, где способ подразумевает: (а) экспрессию в растении экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей доминантно негативный T3SS белок и цис-регуляторный элемент, позволяющий запускать транскрипцию нуклеотидной последовательности в растительной клетке; (б) воздействие на растение бактериальных патогенов; (в) сравнение течения заболевания в полученном растении и растении дикого типа при заражении бактериальными патогенами в одних и тех же условиях, что позволяет оценивать, таким образом, устойчивость данного растения к бактериальным патогенам.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9 или 11.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:20-65.В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, приведенный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессионный вектор, кроме того, содержит перед началом последовательности целевого гена дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид эндоплазматического ретикулума.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения цис-регуляторный элемент содержит последовательность промотора.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения промоторная последовательность является конститутивным промотором.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения конститутивным промотором является CaMV 35S промотор.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения доминантно негативный белок T3SS получают путем введения мутации, выбранной из группы, состоящей из вставки, делеции и замены.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения мутация вставкой включает интеркалирующий блокирующий элемент.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения под белком T3SS подразумевается структурный белок T3SS.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения структурный белок T3SS является белком HRP.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок T3SS выбран из группы, состоящей из белков HrpY Ralstonia solanacearum, HrpA Pseudomonas syringae, HrpA Erwinia amylovora, HrpE Xanthomonas campestris, HrpA Erwinia pyrifoliae и HrpE Xanthomonas oryzae.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок T3SS представляет собой белок транслокона Ralstonia solanacearum.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок транслокона Ralstonia solanacearum выбран из группы, состоящей из PopF1 и PopF2.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин относится к растительным клеткам.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение, имеющее повышенную устойчивость к бактериальным патогенам, сравнивают с немодифицированным растением.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения бактериальным патогеном являются грамотрицательные бактерии. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения грамотрицательные бактерии выбраны из группы, состоящей из Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris и Xanthomonas oryzae.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения грамотрицательные бактерии представляют собой Proteobacteria species. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения Proteobacteria представляют собой Ralstonia solanacearum. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение выбрано из группы сельскохозяйственных растений, декоративных растений и деревьев.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения выбранное растение принадлежит семейству Solanaceae.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение выбрано из группы, включающей томат, картофель, баклажан, банан, сладкий перец, маслину, яблоню, грушу, пираканту, цветущую дикую яблоню, боярышник, кизильник, айву, рябину, арабидопсис, герань, имбирь, табак и эвкалипт.

В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения выбранным растением является томат.

Если не оговорено иное, то все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое они обычно имеют в той области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что при практическом применении и тестировании вариантов осуществления этого изобретения могут использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе способам и материалам, примеры способов и/или материалов описаны ниже. В случае конфликтных ситуаций должно быть учтено описание патента, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для обязательного ограничения изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны только в качестве примеров со ссылкой на прилагаемые Фигуры. Что касается непосредственно Фигур, следует подчеркнуть, что они приведены в качестве примера и с целью пояснительного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. Вследствие этого, описание изобретения вместе с Фигурами делает очевидным для специалиста в этой области, как варианты осуществления настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике.

Фиг.1А представляет собой изображение, иллюстрирующее системы секреции II типа (T2SS), III типа (T3SS) и пили IV типа грамотрицательных бактерий. Источник: Donnenberg M.S., Nature (2000) 406: 768-774, с изменениями.

Фиг.1В-С представляет собой изображения с изменениями из Buttner and Не, Plant Physiology (2009) 150: 1656-64, иллюстрирующие T3SS комплекс растительных (Фиг.1В) и животных (Фиг.1С) патогенных бактерий. Секреторный аппарат соединяет обе бактериальные мембраны и сопрягается с цитоплазматической АТФазой. Патогенные бактерии растений используют пили, которые, вероятно, пробивают растительную клеточную стенку. Патогенные бактерии животных имеют короткую игольчатую структуру, которая соединяется с транслоконом посредством так называемого верхушечного комплекса (отсутствует у патогенов растений). Этот транслокон формирует канал в плазматической мембране и обеспечивает транспорт эффекторных белков в цитоплазму клетки хозяина.

Фиг.2A-F представляет собой изображения, иллюстрирующие выравнивание белка HrpY Ralstonia solanacearum (Rs) с мономером MxiH инжектисомы T3SS Shigella (SEQ ID NO:15, Фиг.2A), структурные модели белка MxiH Shigella (Фиг.2B-E) и полную структуру инжектисомы (Фиг.2F). Изображения MxiH и инжектисомы взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.

Фиг.3А-Е иллюстрируют интеркалирующие блокирующие элементы (IBE) 1 (Фиг.3А, SEQ ID NO:2) и 2 (Фиг.3С, SEQ ID NO:4) доминантных негативных белков T3SS, предполагаемую модель структуры IBE1 и 2 T3SS (Фиг.3В и 3D, соответственно), модель взаимодействия с инжектисомой и ее каналом (Фиг.3Е) и растительные сигналы секреции из sp|Q56YT0|LAC3_At лакказы или tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR секреторной лакказы Gossypium arboreum (SEQ ID NO:16 и 17, соответственно). Фиг.3В, 3D, и 3Е взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.

Фиг.4А-С являются изображениями интеркалирующего блокирующего элемента 3 (IBE3) доминантного негативного белка T3SS (Фиг.4А, SEQ ID NO:6), предполагаемой модели структуры IBE3 T3SS (Фиг.4В) и модели взаимодействия с инжектисомой (Фиг.4С). Фиг.4В и 4С взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.

Фиг.5A-C представляет собой это изображения, иллюстрирующие интеркалирующий блокирующий элемент 4 доминантного негативного белка T3SS (Фиг.5А, SEQ ID NO:8), предполагаемую модель блокирующего элемента (Фиг.5С) и инжектисому (Фиг.5В). Фиг.5В и 5С взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Известно, что дуплицированные концевые участки могут взаимодействовать с различными мономерами, разрушая и блокируя канал инжектисомы.

Фиг.6A-D иллюстрируют интеркалирующие блокирующие элементы 5 (Фиг.6А, SEQ ID NO:10) и 6 (Фиг.6С, SEQ ID NO:12) доминантного негативного белка T3SS и, предполагаемую модель структуры IBE5 и 6 T3SS (Фиг.6 В и 6D, соответственно). Известно, что «головка» и концевая α-спираль белка HrpY деструктурируются пролинами, и такие деформации могут блокировать канал и нарушать функциональность инжектисомы. Фиг.6 В и 6D взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.

Фиг.7A-C представляет различные доминантные негативные белки HrpY Ralstonia solanacearum (Rs). На Фиг.7А изображена карта клонирования T-DNA. Каждый IBE был заклонирован между промотором CaMV 35S и терминатором NOS по сайтам Xbal и Sacl. На Фиг.7В представлена модель взаимодействия с инжектисомой, а на Фиг.7С - различные мутантные варианты HrpY (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 и 12). Фиг.7 В взята с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.

Фиг.8 взята с изменениями из Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44; на ней изображены интеркалирующие мутации и их положение в гене hrpA (SEQ ID NO:2). Кратко, положение вставок во фрагменте из 496 пар оснований BamHI±EcoRI, кодирующем HrpA пилей, отмечено кружками с номерами мутаций над ними. Каждая вставка состоит из 10 пар оснований из транспозона и дуплицированной 5-нуклеотидной последовательности идентичной последовательности, расположенной до вставки, вставленной после 10 пар оснований. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:19) приведена под нуклеотидной последовательностью. Hrp-боксы в промоторе помещены в рамку; предполагаемый участок связывания рибосомы подчеркнут. N-концевой сайт процессинга белка помечен стрелками ниже аминокислотной последовательности. Помещенные в рамку номера мутаций со стрелками указывают начальную и конечную точки четырех делеционных мутаций.

Фиг.9 представляет собой выравнивание вариантов полипептида HrpY Ralstonia solanacearum (то есть небольшие отличия в последовательностях различных штаммов, SEQ ID NO:14 и 70-86).

Фиг.10А-С иллюстрируют анализ методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 6 белка HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 6 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.

Фиг.11А-С представляют собой результаты анализа методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 1 HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 1 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.

Фиг.12А-С представляют собой результаты анализа методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 2 HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 2 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в некоторых вариантах своего осуществления относится к растениям, устойчивым к бактериям, и способам создания таких растения.

Принципы и действие настоящего изобретения могут быть лучше поняты с помощью Фигур и прилагаемого описания.

Прежде чем описывать в деталях хотя бы один вариант осуществления настоящего изобретения, должно быть понятно, что это изобретение не обязательно ограничено своим применением в деталях, приведенных в последующем описании, или приведенных в качестве Фиг. в разделе «Примеры». Данное изобретение может быть исполнено в других вариантах или осуществляться на практике или выполняться различными способами. Также должно быть ясно, что формулировки и терминология, используемая в настоящем документе, приведена с целью описания, и их не следует толковать с точки зрения ограничения изобретения.

Приводя некоторые варианты настоящего изобретения к практическому применению, изобретатели сконструировали бактериальные доминантные негативные белки системы секреции III типа (T3SS), которые экспрессируются в растительных клетках и секретируются из них. Новые доминантные негативные белки T3SS настоящего изобретения включаются в структуру инжектисомы T3SS во время ее сборки и блокируют канал бактериальной инжектисомы, защищая, таким образом, растения от бактериальной инфекции.

Конструкция доминантных негативных белков T3SS настоящего изобретения основывается на сохранении и использовании нативных сайтов взаимодействия между субъединицами белков T3SS (например, HrpY), и одновременном встраивании слитых во время трансляции блокирующих канал полипептидов или деформирующих структур в белок T3SS (например, в α-спирали HrpY), которые препятствуют процессу секреции бактериальных эффекторов из бактерий в растительные клетки. Растительные сигналы секреции, добавленные для этой цели, запускают экспрессию доминантных негативных белков в растительных клетках, секрецию из них и доступность доминантных негативных белков T3SS во время сборки бактериальных пилей в пространственной близости к растительной клеточной стенке. Таким образом, например, и, как это указано в разделе «Примеры», следует, что авторы настоящего изобретения производят интеркалирующие блокирующие элементы канала инжектисомы T3SS (IBE-T3SS) грамотрицательных бактерий. IBE-T3SS Ralstonia solanacearum (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 и 12) были сконструированы с применением структурных модификаций мономера белка HrpY (SEQ ID NO:14), строительного блока инжектисомы Rs. Изобретатели далее для трансформации растительных клеток создали экспрессионные векторы, содержащие эти IBE-T3SS. Кроме того, изобретатели проиллюстрировали трансформацию растений томата мутантами 1, 2, и 6 белка HrpY Ralstonia solanacearum и их экспрессию (см. Фиг.11А-С, 12А-С и 10А-С, соответственно). Дополнительно изобретатели провели сверхэкспрессию модифицированных белков транслокона Rs (PopF1) в трансгенных растениях. Сверхэкспрессия этих белков приводит к остановке сборки T3SS из-за взаимодействий с «незрелой» иглой и, следовательно, прекращению этого процесса. Таким образом, модифицированные белки PopF1 встраиваются в ворота транслокона и блокируют его. Просуммировав вышесказанное, можно считать данное изобретение мощным средством в области сельскохозяйственных трансгенных технологий для создания растений, устойчивых к бактериям.

Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается способ получения растения, имеющего повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением; этот способ включает введение в растение или растительную клетку экспрессионного вектора, в результате чего получают растение с повышенной устойчивостью к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением.

Понятие «растение», используемое в этом документе, подразумевает растения целиком, их родительские поколения и потомство, а также части растения, включая семена, побеги, стебли, корни (в том числе, клубни) и растительные клетки, ткани и органы. Этим растением может быть любая форма, в том числе суспензионные культуры, эмбрионы, меристемные области, ткани каллуса, листья, гаметофиты, спорофиты, пыльца и микроспоры. Растения, которые особенно применимы в способах настоящего изобретения, включают все растения, принадлежащие надсемейству Viridiplantae (Зеленые растения), в особенности однодольные и двудольные растения, в том числе фуражные культуры и кормовые бобовые, декоративные растения, сельскохозяйственные культуры, деревья или кустарники, выбранные из следующего списка: Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp., Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp., Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japónica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp., Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp., Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp., Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canadensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sápida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp., Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, амарант, артишок, спаржа, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, морковь, цветная капуста, сельдерей, листовая капуста, лен, кале, чечевица, рапс, окра, лук, картофель, рис, соевые бобы, культуры для соломы, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, томат, тыква, чай, деревья. В качестве альтернативы для данных способов настоящего изобретения могут быть использованы водоросли и другие растения, не относящиеся к над семейству Viridiplantae (Зеленые растения).

В соответствии с определенными вариантами осуществления выбранное растение относится к семейству Пасленовые.

В соответствии с определенными вариантами осуществления выбранное растение относится к роду Паслен.

В соответствии с другими определенными вариантами осуществления выбранное растение - это томат (Lycopersicum esculentum).

В соответствии с другими определенными вариантами осуществления выбранное растение включает картофель (Solanum tuberosum); томат (Lycopersicum esculentum); баклажан (Solanum melongena); банан (Musa spp.); герань (Pelargonium); имбирь (Zingiber officinale); табак (Nicotiana tabacum); сладкий перец (Capsicum spp.); маслину (Olea europea), арабидопсис, эвкалипт, яблоню, цветущую дикую яблоню, грушу, пираканту, боярышник, кизильник, айву или рябину.

Поскольку используемое в настоящем документе понятие «бактериальный патоген» относится к любому типу вирулентных бактерий, то бактериальные виды или штаммы, которые инфицируют растение, включают, но не ограничиваются, Pseudomonas spp., Erwinia-related strains, Ralstonia solanacearum и Xanthomonas campestris. Этой бактерией могут быть Pseudomonas spp., включая P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. marginalis, Pseudomonas syringae, P. tolaasii, P. agarici и P. viridiflava. Этой бактерией могут быть родственные Erwinia штаммы, в том числе Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi), Erwinia carotovora, Erwinia atroseptica и Erwinia amylovora. Этой бактерией могут быть родственные Xanthomonas campestris штаммы, в том числе Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) and Xanthomonas oryzae.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения под бактериями подразумеваются грамотрицательные бактерии.

Согласно определенному варианту осуществления грамотрицательные бактерии представляют собой Proteobacteria species.

Согласно другому определенному варианту осуществления Proteobacteria представляют собой Ralstonia solanacearum.

Согласно другому определенному варианту осуществления грамотрицательные бактерии выбраны из группы, состоящей из Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Erwinia Psidii, Erwinia pyrifoliae, Xanthomonas campestris и Xanthomonas oryzae.

Так как используемое в настоящем документе понятие «повышенная устойчивость» имеет отношение к понижению вирулентности бактерий и, следовательно, понижению чувствительности растения-хозяина, то эффект сравнивается с немодифицированным растением, зараженным тем же бактериальным патогеном. Согласно сути настоящего изобретения понижение бактериальной вирулентности обеспечивается экспрессией доминантных негативных белков, связанных с бактериальной вирулентностью (например, комплексом иглы, что детально описано ниже), и может влиять на любой этап жизненного цикла бактерии во время ее ассоциации с хозяином, включая (но не ограничиваясь) адгезию, инвазию, репликацию, уклонение от защитных механизмов и передачу новому хозяину.

Повышенная устойчивость к бактериальным патогенам может проявляться в виде уменьшения симптомов у зараженного растения и, таким образом, может быть детектирована в процессе наблюдения за сниженной реакцией растения на соответствующие бактерии. Повышение устойчивости может проявляться как снижение симптомов, связанных с бактериальными патогенами, по меньшей мере, на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, что измеряется любым способом анализа, известным в этой области техники, и это измерение проводят против подходящего контроля (например, немодифицированного растения, выращиваемого в тех же условиях).

Способы настоящего исследования осуществляют при введении в растение экспрессионного вектора, кодирующего доминантно негативный белок T3SS и цис-регуляторный элемент, способный управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности в растительной клетке; где доминантно негативный белок T3SS обеспечивает сборку нефункциональной инжектисомы.

Понятие «T3SS», используемое в настоящем документе, подразумевает под собой систему секреции III типа бактерий (например, грамотрицательных), которая обычно функционирует как игольчатая структура для выделения белков непосредственно из бактериальной клетки. Игольчатая структура T3SS обычно берет начало в цитоплазме бактерии, пересекает две мембраны и выступает из клетки (Фиг.1А). Та часть, что закреплена в мембране, является основанием, или базальным телом, T3SS. Внеклеточная часть представляет собой игольчатую структуру (пили). Конечная структура, выполняющая функцию «ворот» в клетку хозяина, является транслоконом (Фиг.1В-С). Так называемый внутренний стержень соединяет игольчатую структуру с основанием.

Используемое в настоящем документе понятие «белок T3SS» подразумевает под собой белок, который составляет комплекс T3SS. Это понятие включает структурные белки, то есть те, из которых строится основание, внутренний стержень, игольчатая структура, наконечник и транслокон. Игольчатая структура сама по себе обычно состоит из множества субъединиц единственного белка T3SS. Таким образом, большинство разнообразных белков T3SS представляют собой белки, из которых состоит основание, и белки, которые секретируются в клетку хозяина.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения белок T3SS представляет собой такой белок, как HRP (белок реакции гиперчувствительности и патогенности), из которого состоит игольчатая структура T3SS. Типичные белки HRP включают (но не ограничиваются) белки HrpY Ralstonia solanacearum, HrpA Pseudomonas syringe, HrpA Erwinia amylovora, HrpA Erwinia pyrifoliae и HrpE Xanthomonas campestris (Таблица 1, Buttner and Не, Plant Physiology (2009) 150:1656-1664).

Таблица 1.
Типичные белки T3SS.
Вид бактерии	Предполагаемая функция	Белок
Erwinia amylovora	Белок пилей	HrpA
	Белок транслокона	HrpK
Pseudomonas syringae pv tomato	Белок пилей	HrpA
	Белок транслокона	HrpK1
Ralstonia solanacearum	Белок пилей	HrpY
	Белок транслокона	PopF1
		PopF2
Xanthomonas spp.	Белок пилей	HrpExcv
	Белок транслокона	HrpFxcv
		HrpFxoo
Erwinia pyrifoliae	Белок пилей	HrpA
где xcv - X. campestris pv vesicatoria, xoo - X. oryzae pv oryzae.

Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpY дикого типа Ralstonia solanacearum соответствует SEQ ID NO:14.

Согласно другому варианту осуществления полипептид белка HrpY Ralstonia solanacearum включает варианты, приведенные в SEQ ID NO:70-86.

Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpA дикого типа Pseudomonas syringae соответствует SEQ ID NO:19.

Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpA дикого типа Erwinia amylovora соответствует SEQ ID NO:88.

Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpE дикого типа Xanthomonas campestris соответствует SEQ ID NO:90.

Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpE дикого типа Xanthomonas oryzae соответствует SEQ ID NO:92.

Согласно другому варианту осуществления белок T3SS представляет собой белок транслокона, такой как белки PopF1 и PopF2 Ralstonia solanacearum (SEQ ID NO:67 и 69, соответственно).

Согласн