Бис-met-гистоны

Бис-met-гистоны

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящим изобретением обеспечивается молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном. Настоящее изобретение, кроме того, относится к вектору, содержащему указанную молекулу нуклеиновой кислоты, хозяину, трансформированному указанным вектором, полипептидам, кодируемым молекулой нуклеиновой кислоты, и фармацевтическим и диагностическим композициям. Настоящее изобретение также относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты, векторов, хозяев и полипептида настоящего изобретения для приготовления композиции для лечения заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу проверки присутствия молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида в образце и к набору.

По всему этому описанию приводится множество документов. Раскрывающее суть содержание указанных документов, в том числе инструкций производителей, полностью включено сюда посредством ссылки.

В настоящее время существует огромный экономический интерес к продукции на высоком уровне таких рекомбинантных белков, как гистоны. Продукция больших количеств рекомбинантных белков представляет интерес не только с целью обеспечения достаточного количества белка для исследований их свойств и функций, но также для обеспечения больших количеств белка для терапевтического применения.

Огромное количество параметров должно быть учтено для успешных продукции на высоком уровне и очистки рекомбинантных белков. Важные параметры включают условия экспрессии, регуляцию трансляции и стабильность мРНК, направленную доставку и деструкцию белка (Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512).

Одним из подходов для улучшения продукции, выявления и очистки рекомбинантных белков является использование широкого выбора партнеров по слиянию (Makrides, S., Microbiological Reviews, 1996: 512). Были детально разработаны методы для включения аффинных меток для очистки и выявления рекомбинантных белков. В таких аффинных метках объединены выгодные способности делать возможной более эффективную очистку и в то же самое время также делать возможным легкое выявление рекомбинантного белка на основе метки. Однако во многих случаях добавление довольно большой аффинной метки может быть невыгодным из-за нежелательных эффектов на трансляцию, укладку и активность белка. Особенно при употреблении для терапевтических применений часто необходимо последующее удаление аффинной метки, что тем самым ослабляет некоторые положительные эффекты (например, легкое выявление), которые аффинная метка придает белку (Gellissen, G. “Production of Recombinant Proteins”, 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co., KgaA, Weinheim).

Включение остатка метионина на N–конце каждого полипептида в процессе возникновения является частью универсального сигнала инициации трансляции, используемого прокариотами, а также эукариотами. У E.coli удаление этого N-концевого остатка метионина успешно выполняется цитоплазматическим ферментом метионин-аминопептидазой (map) (Hirel et al., Biochemistry, 1998, 86: 8247).

Установлено, что эффективное отщепление N-концевого остатка метионина рекомбинантных эукариотических белков, продуцируемых в прокариотах, например, в E.coli, зависит от смежной с метионином аминокислоты. Хотя существуют противоречивые данные для некоторых аминокислот, кажется, согласны, что вероятность отщепления является наибольшей для небольших и незаряженных аминокислотных остатков Ala, Gly, Pro, Ser, Val, Cys и Thr. По-видимому, большие боковые цепи неблагоприятны для отщепления метионина (Hirel et al., Biochemistry, 1989, 86: 8247; Frottin et al., Mol. & Cell Proteomics, 2006, 12: 2336; Gellissen, G. “Production of recombinant Protein”, 2005, WILEY-VCH Verlag GmbH&Co., KgaA, Weinheim).

Полагают, что отщепление N-концевого метионина играет важную роль в стабильности белка (Giglione et al., EMBO J., 2003, 1: 13), а также в правильном функционировании белка, как установлено, например, для MEF-2C, гемоглобина человека, интерлейкина-2, гомологов РНКазы A или рибонуклеазы лягушки (Meierhans and Allemann, J. Biol. Chem. 1998, 273: 26052; Adachi, K. et al., Protein Expr. Purif., 2000, 20; 37; Endo, S. et al., Biochemistry, 2001, 40: 914; Boix, E. et al., J. Mol. Biol., 1996, 257: 992; Liao, Y.D. et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31: 5247; Varshavsky, A., Proc. Natl. Acad. Sci., 1996, 93: 12142). Дополнительная доктрина, касающаяся того, почему природа сохранила такую специализированную ферментативную систему для удаления остатка метионина, состоит в повторном использовании клеточного пула метионинов для экономного расходования этой незаменимой аминокислоты (Hirel et al., Biochemistry. 1989, 86: 8247).

В ЕР1254166 описывается рекомбинантная продукция белков гистонов в E.coli. Такая рекомбинантная продукция белков человека считается преимущественной для терапевтических применений, а также более эффективной и экономически эффективной по сравнению с препаратами из зобной железы человека или теленка. Кроме того, рекомбинантная продукция белков делает возможным лучший контроль качества во время процесса продукции.

Pyo и др. (Pyo, S.H. et al., Protein Expr. Purif., 2001, 1: 38) описывают продукцию рекомбинантного гистона Н1.5 в E.coli, используя сильно основные свойства гистона для разработки эффективного способа крупномасштабной очистки рекомбинантного белка.

Хотя в предшествующем уровне техники была продемонстрирована продукция на высоком уровне рекомбинантных белков, существует, тем не менее, реальная необходимость в нахождении подходящих способов выявления результирующего рекомбинантного белка. Как обсуждалось выше, применение аффинных меток, таких как His-метки, широко используется в данной области техники, но может быть проблематичным при продукции белков для терапевтического применения.

Таким образом, лежащей в основе настоящего изобретения технической проблемой было обеспечение улучшенных рекомбинантных эукариотических полипептидов, которые, например, позволяют упростить продукцию и выявление.

Решение этой технической проблемы достигается с помощью вариантов осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения.

Соответственно, в первом варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая (а) кодирует полипептид, состоящий из (аа) двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со (ab) зрелым эукариотическим гистоном; (b) кодирует полипептид, состоящий из (ba) двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со (bb) зрелым эукариотическим полипептидом, последовательность которого, по крайней мере, на 80% идентична последовательности зрелого эукариотического гистона (а) и в котором существенным образом сохраняется его биологическая активность; или (с) гибридизуется в жестких условиях с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид (а) или (b), причем указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который имеет, по крайней мере, два N-концевых остатка метионина и в котором существенным образом сохраняется биологическая активность полипептида (а) или (b).

В соответствии с настоящим изобретением молекулы нуклеиновых кислот включают ДНК, например, кДНК или геномную ДНК, РНК (например, мРНК), также в синтетической или полусинтетической форме, дальнейшие синтетические или полусинтетические производные ДНК или РНК (например, ПНК или фосфоротиоаты) и сополимеры, как смысловые, так и антисмысловые цепи. Они могут содержать дополнительные неприродные или производные нуклеотидные основания, как это будет быстро понятно квалифицированным в данной области техники специалистам. В предпочтительном варианте осуществления молекулой нуклеиновой кислоты является ДНК, в том числе геномная ДНК.

Для целей настоящего изобретения пептидо-нуклеиновая кислота (ПНК) является полиамидным типом аналога ДНК, и в продаже имеются мономерные единицы для производных аденина, гуанина, тимина и цитозина (Perceptive Biosystems). Некоторые компоненты ДНК, такие как фосфор, трехокись фосфора или производные дезоксирибоз, не присутствуют в ПНК. Как описывается Nielsen и др. (Science 254: 1497 (1991)) и Egholm и др. (Nature 365: 666 (1993)), РНК связываются специфически и прочно с комплементарными цепями ДНК и не подвергаются деструкции нуклеазами. В действительности ПНК связывается сильнее с ДНК, чем сама ДНК. Это вероятно обусловлено тем, что нет электростатического отталкивания между двумя цепями, а также тем, что остов полиамида является более гибким. Из-за этого дуплексы ПНК/ДНК образуются в более широком диапазоне условий жесткости, чем дуплексы ДНК/ДНК, что делает выполнение мультиплексной гибридизации более легким. Благодаря сильному связыванию могут использоваться зонды меньшего размера, чем с ДНК. Кроме того, с большей вероятностью можно определить дефект спаривания по одному основанию при использовании гибридизации ПНК/ДНК, поскольку дефект спаривания по одному основанию в 15-мере ПНК/ДНК понижает точку плавления (T.sub.m) на 8°-20° ПНК/ДНК, в сравнении с 4°-16° для 15-мерного дуплекса ДНК/ДНК. Также отсутствие заряженных групп в ПНК означает, что гибридизацию можно проводить при низкой ионной силе и уменьшить возможное мешающее действие соли во время анализа.

Используемым здесь термином «полипептид» характеризуется группа молекул, которые состоят из более 30 аминокислот. В соответствии с настоящим изобретением группа полипептидов включает «белки». Полипептиды могут далее образовывать димеры, тримеры и олигомеры высшего порядка, т.е. состоящие из более одной полипептидной молекулы. Полипептидные молекулы, образующие такие димеры, тримеры и т.п., могут быть идентичными или неидентичными. В результате соответствующие структуры высшего порядка называют гомо- или гетеродимерами, гомо- или гетеротримерами и т.п. Гомо- и гетеродимеры и т.п. также попадают под определение термина «белок». Полипептиды могут, кроме того, быть слитыми белками, причем партнер по слиянию присоединяют к С-концу полипептида настоящего изобретения. Эти компоненты указанных слитых белков, которые не являются последовательностями гистонов или их фрагментами или вариантами, охарактеризованными здесь выше, включают аминокислотные последовательности, которые придает желаемые свойства, такие как модифицированная/увеличенная стабильность, модифицированная/увеличенная растворимость и/или способность к направленной доставке в один или несколько специфических типов клеток, или могли бы сообщать отличную биологическую активность. Например, предусматриваются белки, слитые с антителами, специфичными для маркеров клеточной поверхности, или с узнающими антиген фрагментами таких антител. Кроме того, настоящим изобретением также охватываются пептидомиметики таких полипептидов, в которых аминокислота(ы) и/или пептидная связь(и) заменены функциональными аналогами. Такие функциональные аналоги включают все известные аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот, такие как селеноцистеин. Термины «полипептид» и «белок» также относятся к природно модифицированным полипептидам/белкам, причем модификация осуществляются, например, при гликозилировании, ацетилировании, фосфорилировании и т.п. Такие модификации широко известны в данной области техники.

Термин «метионин», в соответствии с настоящим изобретением, хорошо известен квалифицированному в данной области техники специалисту. Метионин является незаменимой аминокислотой, кодируемой кодоном AUG в соответствии со стандартным генетическом кодом. Указанный метионин, поскольку он обнаружен у эукариот, вносит вклад в предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. N–формилметионин прокариот также включен в значение термина «метионин» и вносит вклад в альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения.

Используемый здесь термин «первый и второй N–концевые аминокислотные остатки» относится к аминокислотным остаткам, обнаруживаемым в положениях 1 и 2 полипептида настоящего изобретения. Эти остатки также упоминаются в данной области техники как последний и предпоследний остатки на N–конце. Другими словами, первый остаток метионина находится в N–концевом положении исходного продукта трансляции полипептида, который сам содержит метионин на своем N–конце.

Используемый здесь термин «пептидная связь» хорошо известен квалифицированному в данной области техники специалисту и относится к химической связи, образуемой между двумя молекулами аминокислот, причем карбоксильная группа одной аминокислоты реагирует с аминогруппой другой аминокислоты.

Термин «зрелый эукариотический гистон», в соответствии с настоящим изобретением, относится к гистону, лишенному его начального N–концевого метионина. Как это хорошо известно квалифицированному в данной области техники специалисту, при трансляции полипептидов используется универсальный сигнал инициации трансляции, который приводит к включению метионина в качестве начального аминокислотного остатка на N–конце транслированного полипептида. У эукариот, и отчасти также у прокариот, этот N–концевой метионин отщепляется при «созревании» полипептида.

В соответствии с настоящим изобретением термин «гистон» относится к группе белков, включающей гистоны ядра Н2А (№ доступа в Swiss-Prot для Н2А человека – Р02261), H2B (№ доступа в Swiss-Prot для H2B человека – Р02278), Н3 (№ доступа в Swiss-Prot для Н3.1 человека – Р16106) и Н4 (№ доступа в Swiss-Prot для Н4 человека – Р02304), и семейству линкерных гистонов Н1 (смотри ниже № доступа в Swiss-Prot). Классически гистоны известны в качестве структурных компонентов клеточного ядра, в котором они действуют в качестве «катушек», на которые намотана ДНК, и играют ключевую роль в генной регуляции. Однако гистоны демонстрируют широкую многофункциональность (Reichhard, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1985, 82: 4871; Reichhard, R. et al., FEBS 1985, 188: 63). Установлено, например, что гистоны действуют системно в качестве гормонов и регуляторных факторов, а также несут важные защитные функции.

Благодаря своей широкой многофункциональности гистоны стали важны в ряде терапевтических подходов. Например, установлено, что гистоны Н1, Н2А и Н2В стимулируют периферические здоровые лимфоциты (Cebecauer, L. et al. Rheumatologia 1991, 5: 107). Установлено, что гистон Н1 улучшает регенерацию мышечной ткани путем стимуляции пролиферации миобластов (Henriquez, J.P. et al., J. Cell Sci. 2002, 115: 2041), изменяет картину заболеваний, характеризующихся амилоидоподобными фибриллами, (Duce, J.A. et al. J. Mol. Biol. 2006, 361: 493) и стимулирует стволовые клетки (Semina et al. Radiation Biology and Oncology, 1994, 34: 544). Гистон Н1 также используется для диагностирования, профилактики и лечения язвенного колита и его клинических подтипов (Braun, J. et al., патент США № 6074835). Кроме того, установлено, что гистон Н1, а также гистоны ядер способны переносить биологически активные вещества через гематоэнцефалический барьер (Pardridgem W.M. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1989, 251: 821). Кроме того, в Европейском патенте 0392315 демонстрируется гормональная или гормоноподобная активность гистона Н1 и его подтипов. Роль гистона в аутоиммунных заболеваниях, включающих, например, системную красную волчанку (SLE), установлена, например, в Европейском патенте 0532979 или заявке на патент WO 03/044054. Установлено, что функции гистонов, кроме того, включают антибиотические функции (патенты США № 6565854 и 6884423) и противовирусные функции (WO 2005/112975). Кроме того, показано применение гистонов для предотвращения агрегации тромбоцитов (WO 02/067907) и для лечения тромбоцитопении (WO 2006/119912).

Установлено, что гистоны играют основную роль при лечении рака. Vani и др. (Vani, G. et al., Chemotherapy 2003, 49: 252) демонстрируют, например, что гистон Н1 улучшает иммунный статус и иммунный ответ у животных, поддерживающих экспериментальный рак молочной железы. Также установлено, что антиоксидантный статус страдающих раком индивидуумов усиливается с помощью гистона Н1 (Vani, G. et al., Chemotherapy 2005, 51: 57). Установлено, что обработка чувствительных к эстрогенам человека клеток рака молочной железы гистоном Н1 уменьшает число рецепторов эстрогенов (Vani, G. and Devi, C.S., Mol. Cell Biochem. 2005, 272: 151). В патенте США № 5812257 демонстрируется лечение индуцированных облучением лейкоза или карциномы гистонами Н1 или Н2А:Н2В. Гистоны могут быть также потенциально полезны для лечения рака путем захвата патогенной экстраклеточной ДНК и циркуляции по всему организму патогенных нуклеосом (Le Lann-Terrisse et al. (1997) Cancer Immunol. Immunother., 43: 337).

В соответствии с настоящим изобретением молекула нуклеиновой кислоты может также кодировать полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим полипептидом, последовательность которого идентична на, по крайней мере, 80%, более предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% последовательности зрелого эукариотического гистона (а) и в котором существенным образом сохраняется его биологическая активность. Еще более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты может кодировать полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим полипептидом, последовательность которого идентична на, по крайней мере, 95% и наиболее предпочтительно 98% последовательности зрелого эукариотического гистона (а) и в котором существенным образом сохраняется его биологическая функция.

В соответствии с настоящим изобретение термин «идентичность последовательностей в процентах» характеризует число соответствий («совпадений») идентичных нуклеотидов/аминокислот двух или более совмещенных последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей в сравнении с числом нуклеотидов или аминокислотных остатков, составляющих полную длину последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей (или их полную сравниваемую часть). Другими словами, используя совмещение, для двух или более последовательностей или подпоследовательностей процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, (например, идентичность на 80% или 85%) можно определить после сравнения и совмещения (под)последовательностей для максимального соответствия по всему окну сравнению или по всему намеченному району, как определяется с использованием алгоритма для сравнения последовательностей, известного в данной области техники, или после совмещения вручную и визуальной проверки. Это определение также применимо к комплементу проверяемой последовательности. Предпочтительными молекулами нуклеиновых кислот/полипептидами в соответствии с настоящим изобретением являются такие молекулы нуклеиновых кислот/полипептиды, в которых охарактеризованная идентичность существует по всему району, длина которого составляет, по крайней, мере приблизительно 15-25 аминокислот или нуклеотидов, более предпочтительно по всему району, длина которого составляет, по крайней мере, приблизительно 50-100 аминокислот или нуклеотидов. Квалифицированные в данной области техники специалисты знают, как определить идентичность последовательностей в процентах между последовательностями, используя, например, алгоритмы, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85: 2444), которые известны в данной области техники.

Хотя алгоритм FASTDB обычно не учитывает внутренние несоответствующие делеции или добавления в последовательностях, т.е. пропуски, при расчете, это можно исправить вручную во избежание переоценки идентичности последовательностей в %. Однако, CLUSTALW учитывает пропуски в последовательностях при расчетах их идентичности. Отвечающими требованиям квалифицированных в данной области техники специалистов являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res., 1977, 25: 3389). В программе BLASTN для последовательностей нуклеиновых кислот используется по умолчанию длина слова (W), составляющая 11, ожидание (E) – 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP используется по умолчанию длина слова (W), составляющая 3, и ожидание (E) – 10. В матрице количественных оценок BLOSUM62 (Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 89: 10915) используется совмещение (В), составляющее 50, ожидание (E) – 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей. Все эти программы могут использоваться для целей настоящего изобретения. Все вышеприведенные программы можно использовать в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением активность существенным образом сохраняется, если получают, по крайней мере, 20% биологической активности соответствующего зрелого эукариотического гистона, упоминаемого в пункте (а), выше. Предпочтительно, когда сохраняется, по крайней мере, 50%, например, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 75% или, по крайней мере, 80% активности. Более предпочтительным является сохранение, по крайней мере, 90%, например, по крайней мере, 95%, еще более предпочтительным, по крайней мере, 98%, например, 99%, биологической активности. Наиболее предпочтительным является полное, т.е. 100%, сохранение биологической активности. Также в соответствии с настоящим изобретением находятся полипептиды, обладающие увеличенной биологической активностью по сравнению с соответствующим зрелым эукариотическим гистоном, упоминаемым в пункте (а), т.е. более 100% ферментативной активности эталонного гистона. Способы оценки биологической активности (поли)пептида хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту и включают, без ограничения, измерение ферментативной активности, цитотоксичности, высвобождения цитокинов, гемолиза или экспрессии биомаркеров. В частности, анализы цитотоксичности представляют собой анализы, в которых используются in vitro или in vivo культуры клеток, которые обрабатывают, например, поли(пептидом), например, гистонами, и в которых определяют с помощью способов обнаружения клеток степень изменения гибели клеток после обработки. Биологическую активность можно также определить с помощью анализов ELISA, особенно в случае антител.

Используемый здесь термин «гибридизуется/гибридизующийся» относится к спариванию молекулы нуклеиновой кислоты с (частично) комплементарной цепью этой молекулы нуклеиновой кислоты, которые тем самым образую гибрид.

В данной области техники хорошо известно, как выполнить эксперименты по гибридизации молекул нуклеиновых кислот. Соответственно, квалифицированный в данной области техники специалист знает, какие условия гибридизации он должен использовать для того, чтобы сделать возможной успешную гибридизацию. В отношении создания подходящих условий гибридизации справляются в стандартных книгах-текстах, таких как Sambrook and Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989) или Higgins and Hames (Eds.) “Nucleic acid hybridization, a practical approach” IRL Press Oxford, Washington DC (1985). В одном предпочтительном варианте осуществления гибридизацию осуществляют в жестких условиях.

«Жесткие условия гибридизации» относятся к условиям, которые включают, например, инкубацию в течение ночи при 65°С в 4× SSC (600 мМ NaCl, 60 мМ натрия цитрата) с последующей промывкой при 65°С в 0,1× SSC в течение одного часа. Альтернативно, условия гибридизации могут включать инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5× SSC (750 мМ NaCl, 75 мМ натрия цитрат), 50 мМ натрия фосфат (рН 7,6), 5× раствор Денхардта, 10% декстрана сульфата и 20 мкг/мл денатурированной, деградированной в результате гидродинамического сдвига ДНК из молок лососевых, с последующей промывкой фильтров в 0,1× SSC при приблизительно 65°С. Указанные условия гибридизации также известны квалифицированному в данной области техники специалисту как «в высокой степени жесткие условия гибридизации». Также предусматриваются молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с молекулами нуклеиновых кислот настоящего изобретения в условиях более низкой жесткости для гибридизации («условиях низкой жесткости для гибридизации»). Изменения жесткости гибридизации и обнаружения сигнала осуществляют, главным образом, через манипулирование концентрацией формамида (более низкие проценты формамида приводят к понижению жесткости), солевыми условиями или температурой. Например, условия более низкой жесткости включают инкубацию в течение ночи при 50°С в 4× SSC или инкубацию в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем 6X SSPE (20X SSPE=3M NaCl; 0,2M NaH₂PO₄; 0,02M EDTA, pH 7,4), 0,5% SDS, 30% формамида, 100 мкг/мл блокирующей ДНК из молок лососевых, с последующими промывками при 50°С в 1X SSPE, 0,1× SDS. Кроме того, для достижения еще более низкой жесткости промывки, выполняемые после жесткой гибридизации, можно проводить при более высоких концентрациях соли (например, 5Х SSC). Обратите внимание, что изменение вышеотмеченных условий можно выполнить через включение и/или замену реагентов-вариантов для блокирования, используемых для ослабления фона в экспериментах по гибридизации. Типичные реагенты для блокирования включают реагент Денхардта, BLOTTO, гепарин, денатурированную ДНК из молок лососевых и имеющиеся в продаже запатентованные композиции. При включении специфических реагентов для блокирования может потребоваться модификация описанных выше условий гибридизации из-за проблем совместимости. Такие модификации могут обычно проводиться квалифицированным специалистом незамедлительно. Гибридизационный комплекс может быть образован в растворе (например, анализ Cot или Rot) или между одной последовательностью нуклеиновой кислоты, присутствующей в растворе, и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, иммобилизованном на твердой подложке (например, мембранах, фильтрах, чипах, балочных выводах или предметных стеклах, на которых, например, были зафиксированы клетки. Приведенный здесь выше вариант осуществления предпочтительно относится к в высокой степени жестким условиям и в альтернативном случае к условиям более низкой жесткости.

Дополнительно к отмеченному выше, термин «молекула нуклеиновой кислоты, гибридизующаяся в жестких условиях с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид (а) или (b)», упоминаемой в пункте (с), предпочтительно относится к последовательностям, которые проявляют идентичность последовательностей, составляющую, по крайней мере, 70%, предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 90%, еще более предпочтительно, по крайней мере, 95% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 97%, с нуклеотидной последовательностью, охарактеризованной выше в пунктах (а) или (b).

Как указано здесь выше, предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением являются молекулы нуклеиновых кислот, которые способны к гибридизации с молекулами нуклеиновых кислот настоящего изобретения или их частями в (в высокой степени) жестких условиях гибридизации, т.е. которые не гибридизуются перекрестно с молекулами нуклеиновых кислот, неродственными по нуклеотидной последовательности. В соответствии с пунктом (с), выше, настоящим изобретением также охватываются молекулы нуклеиновых кислот, родственные, но не идентичные молекулам нуклеиновых кислот пунктов (а) или (b) по последовательности. Кроме того, настоящее изобретение включает в соответствии с пунктом (с) фрагменты молекулы нуклеиновой кислоты (а) или (b). Для всех вариантов осуществления, подпадающих под пункт (с), важно в соответствии с этим вариантом осуществления, чтобы кодируемый этой молекулой нуклеиновой кислоты полипептид имел, по крайней мере, два N–концевых остатка метионина и сохранял или существенным образом сохранял биологическую активность гистона (а) или (b).

Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, последовательность которой является вырожденной по сравнению с последовательностью описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты пункта (а) или (b). При использовании в соответствии с настоящим изобретением термин «являющаяся вырожденной вследствие генетического кода» означает, что из-за избыточности генетического кода различные нуклеотидные последовательности кодируют одну и ту же аминокислоту.

Хотя существует ряд известных в данной области техники аффинных меток, которые сливают с полипептидами для того, чтобы сделать возможными более легкие продукцию и выявление, эти метки часто необходимо удалять при употреблении в терапевтических применениях. В противоположность этим аффинным меткам, авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили бис-Met-полипептиды, которые демонстрируют биологические свойства, одинаковые с биологическими свойствами их природных аналогов, и, следовательно, полипептиды настоящего изобретения могут использоваться с терапевтическими целями. Поскольку функциональные возможности полипептидов настоящего изобретения явно не изменены, по крайней мере, при использовании анализов, примененных авторами настоящего изобретения, удаление остатков метионина не является необходимым. Кроме того, удаление остатков метионина не происходит во время продукции. Как очерчено выше, отщепление N–концевого остатка метионина в значительной степени зависит от размера второго аминокислотного остатка. Поскольку полипептиды настоящего изобретения содержат в качестве второго аминокислотного остатка дополнительный метионин, одним из наблюдаемых эффектов является то, что только низкий процент, т.е. в диапазоне, составляющем приблизительно 20%, двух N–концевых остатков метионина отщепляется в E.coli. В остальных приблизительно 80% случаев два N–концевых остатка метионина не отщепляются. Во время продукции полипептида настоящего изобретения в прокариотах, таких как E.coli, последний N–концевой метионин может также подвергаться формилированию. Однако авторы настоящего изобретения не получили каких-либо формилированных продуктов, как проверено с помощью масс-спектрометрии. Также не могли наблюдать отщепление только одного остатка метионина. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что отщепление первого N–концевого остатка метионина приводит к быстрому удалению также второго N–концевого метионина, что дает в результате отщепление обоих остатков метионина.

Вследствие этого бис-Met-гистоны настоящего изобретения дают преимущество, заключающееся в возможности легкого обнаружения в присутствии эндогенных гистонов. Например, хотя бис-Met-гистоны могут быть не отделены от их эндогенных аналогов с помощью различных способов HPLC (RPC; SEC; IEX) или электрофореза (SDS-PAGE; CE), бис-Met-гистоны можно легко отличить с помощью масс-спектрометрии (или тандемной масс-спектрометрии) с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), например, одной и той же фракции HPLC с обращенной фазой (смотри примеры). Это позволяет контролировать фармакокинетики терапевтических гистонов во время клинических испытаний без необходимости использования мечения изотопами или специальных антител против исследуемого лекарственного средства.

Кроме того, с удивлением было обнаружено, что гистоны, содержащие два остатка метионина в качестве первого и второго N–концевых аминокислотных остатков, проявляют выгодные свойства при рекомбинантной продукции. Так, авторы настоящего изобретения обнаружили, что значительно более высокий уровень гистона можно получить после введения двух остатков метионина. Хотя выработка в бактериальной клетке после ферментации бис-Met-гистона не была значительно выше, с удивлением было обнаружено значительно отличное поведение бис-Met-гистона в первой ключевой стадии обработки в основном направлении. В то время как бис-Met-гистон можно было элюировать при предполагаемой концентрации соли, рекомбинантный гистон, лишенный дополнительных остатков метионина, нельзя было элюировать с колонки MacroPrep High-S, за исключением очень высокой концентрации соли, и нельзя было далее очистить эффективным образом. Следовательно, бис-Met-гистон отлично ведет себя на колонке MacroPrep High-S, что делает возможным эффективный и с высоким выходом процесс очистки.

Соответственно, настоящее изобретение основано на новом факте, что присутствие двух остатков метионина на N–конце гистонов обеспечивает бис-Met-гистоны, которые дают возможность легкого обнаружения в присутствии эндогенных гистонов и делают возможной эффективную продукцию рекомбинантных белков.

В предпочтительном варианте осуществления гистон выбирают из группы, состоящей из гистона Н1.0, Н1.1, Н1.2, Н1.3, Н1.4, Н1.5 и H1t яичка.

Номерами доступа в Swiss-Prot для подтипов гистонов Н1 человека являются: Н1.0 – Р07305; Н1.1 – Q02539, H1.2 – P16403, H1.3 – P16402, H1.4 – P10412, H1.5 – Q14529 и H1t -Р22492. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность гистона Н1.2 человека показаны в SEQ ID NO: 6 и 7. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность гистона Н1.3 человека показаны в SEQ ID NO: 8 и 9. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность гистона Н1.4 человека показаны в SEQ ID NO: 10 и 11. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность гистона Н1.5 человека показаны в SEQ ID NO: 12 и 13.

В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Молекулы нуклеиновых кислот являются «комплементарными», если они природно связываются друг с другом в содействующих солевых и температурных условиях с помощью спаривания оснований. Например, последовательность «A-G-T» связывается с комплементарной последовательностью «T-C-A». «Комплементарность» в соответствии с настоящим изобретением имеет отношение к полному спариванию оснований нуклеотидов по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Таким образом, помеченная поддающейся обнаружению меткой молекула нуклеиновой кислоты, не в точности комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, не будет давать поддающийся обнаружению сигнал, если выбраны соответствующие условия гибридизации и промывки. Такую комплементарную молекулу нуклеиновой кислоты можно, например, использовать в качестве зондов в Норзерн- или Саузерн-блоттингах препаратов РНК или ДНК.

В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается антисмысловой олиго- или полинуклеотид молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, причем олигонуклеотид включает нуклеотиды, комплементарные триплетам из нуклеотидов, кодирующим два первых N–концевых остатка метионина гистона настоящего изобретения, и имеет минимальную длину, составляющую 10 нуклеотидов.

Указанные антисмысловые олигонуклеотиды могут, например, использоваться в качестве праймеров для анализов секвенированием или в качестве зондов в Норзерн- или Саузерн-блоттингах препаратов РНК или ДНК. Антисмысловые олигонуклеотиды настоящего изобретения предпочтительно включают, по крайней мере, 10, предпочтительно, по крайней мере, 15, например, по крайней мере, 25 последовательных нуклеотидов. Более предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды настоящего изобретения включают, по крайней мере, 100, более предпочтительно, по крайней мере, 200 и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 500 нуклеотидов в длину. Такую молекулу нуклеиновой кислоты можно также использовать, например, в качестве зонда в анализах методом защиты от действия РНКазы или в качестве антисмыслового зонда для ингибирования экспрессии гистонов настоящего изобретения. Квалифицированному в данной области техники специалисту хорошо известно, как приготовить и использовать такие зонды (смотри, например, Sambrook and Russel “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)).

В другом альтернативном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Предпочтительно вектором является плазмида, космида, вирус, бактериофаг или другой вектор, используемый, например, обычно при генетической инженерии. В дальнейшем варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается вектор, включающий комплементарную молекулу нуклеиновой кислоты или антисмысловой олигонуклеотид настоящего изобретения.

Молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно встроить в отде