Средства и способы предсказания ответа на лечение гепатита b

Средства и способы предсказания ответа на лечение гепатита b

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение имеет отношение к области биологии, вирусологии и медицины. В частности, данное изобретение имеет отношение к лечению гепатита В.

Уровень техники

Гепатит В представляет собой инфекционное воспалительное заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита В (HBV). В основном, передача вируса происходит в результате контакта с биологическими жидкостями, полового контакта, при переливании крови, гемодиализе, использовании наркозависимыми общих шприцов, в результате перинатальной инфекции и т.д.

HBV является членом семейства Hepadnavirus. Вирус является одним из самых маленьких вирусов с оболочкой, его диаметр составляет приблизительно 42 нм. Вирусная частица (вирион) состоит из внешней липидной оболочки (содержащей, главным образом, поверхностный антиген вируса гепатита В, HBsAg) и икосаэдрического нуклеокапсидного ядра (core), состоящего из корового антигена вируса гепатита В (HBcAg). В нуклеокапсид заключены вирусная ДНК и ДНК-полимераза, которая обладает активностью обратной транскриптазы. Внешняя оболочка содержит «встроенные» в нее белки, которые участвуют в связывании вируса с чувствительной клеткой и проникновении в нее.

Острая HBV-инфекция характеризуется воспалением печени, рвотой и желтухой. Как правило, симптомы продолжаются в течение нескольких недель и затем постепенно ослабевают, по мере того, как иммунная система устраняет инфекцию. Вероятность полного выздоровления и формирования защитного иммунитета увеличивается с возрастом: тогда как только 5% взрослых страдают от хронической инфекции, длящейся более шести месяцев, т.е. хронической инфекции HBV, этот показатель возрастает до 70% среди детей младшего возраста и до 95% среди новорожденных, инфицированных перинатально.

Длительное воспаление печени, обусловленное инфицированием HBV, может приводить к хроническому гепатиту В (СНВ) с прогрессированием до фиброза печени, цирроза и, в конечном итоге, гепатоклеточной карциномы (НСС) и смерти. По этой причине HBV классифицируется Международным агентством по изучению рака (МАИР) ВОЗ как канцерогенный фактор класса I, т.е. агент, канцерогенный для человека. Таким образом, действующие директивы рекомендуют проводить лечение пациентов с СHВ с активным воспалительным процессом в печени, например, руководства Американской ассоциации по изучению заболеваний печени (AASLD), рекомендуют проводить лечение пациентов, у которых наблюдаются уровни ДНК HBV в сыворотке более 2000 IU/мл и/или повышенный уровень аланинаминотрансферазы (ALT) (>2 раз относительно верхнего предела нормы).

СНВ можно разделить на четыре фазы. У лиц, зараженных перинатально, наиболее часто наблюдается фаза иммунной толерантности. Эта фаза характеризуется обнаружением "е антигена" гепатита В (HBeAg). В течение этой фазы Анти-НВе антитела не обнаруживаются. Плазматические уровни ДНК HBV превышают 20000 IU/мл и часто являются еще более высокими.

Вторая фаза представляет собой фазу активности иммунной системы. В продолжение этой фазы повышаются показатели ALT, у некоторых пациентов может наблюдаться исчезновение HBeAg и переход к анти-НВе антителам. После HBeAg/антиНВе сероконверсии количество ДНК HBV в плазме, как правило, снижается до уровня ниже 20000 IU/мл. Эта фаза носит название фазы HBeAg-отрицательного хронического неактивного гепатита В. Впоследствии может развиться фаза HBeAg-отрицательного хронического активного гепатита В, вследствие появления HBV-мутантов с мутациями в pre-соrе области; при этом уровни ДНК HBV в плазме снова превышают 20000 IU/мл, и возрастают показатели ALT (R.B. Takkenberg, thesis University of Amsterdam (2011), The Netherlands, chapter 2, ISBN 9789090263045).

По всему миру насчитывается около 400 миллионов больных хроническим гепатитом В, приблизительно 650000 человек ежегодно умирает от связанных с HBV осложнений. Хронический гепатит В (СНВ) представляет собой динамический процесс и, как описано выше, может находиться в активной и неактивной фазах. Стандартные схемы лечения включают интерферон альфа или аналоги нуклеотидов/нуклеозидов, ингибирующие вирусную ДНК-полимеразу. В исследованиях использовалась комбинированная терапия аналогами нуклеотидов/нуклеозидов и интерфероном альфа. Важным усовершенствованием стало введение в терапию пегилированного интерферона (например, Pegasys®), обеспечивающего пролонгированный период полувыведения интерферона. Обзор по эпидемиологии и лечению HBV-инфекции см. в J.L. Dienstag N Engl J Med 2008, 359; 1486-1500.

По-прежнему, несмотря на улучшенную терапию, лишь очень небольшой доле пациентов удается избавиться от инфекции (исчезновение HBsAg и ДНК HBV с или без образования анти-HBs антител) при проведении лечения, тогда как большинству других - нет. Таким образом, было бы желательно иметь возможность предсказания ответа пациента на HBV терапию, для того, чтобы правильно скорректировать стратегию лечения с самого начала.

Как было показано в многочисленных исследованиях, невозможность достижения элиминации вируса под действием иммунной системы при постоянных высоких уровнях вирусемии HBV связана с плохими клиническими результатами, включая цирроз печени и гепатоклеточную карциному. Результаты показывают, что индивидуумы, у которых происходит устранение инфекции HBV, имеют низкий риск такого неблагоприятного исхода. Однако значительное количество пациентов не достигает устранения вируса после терапии, кроме того, обычным явлением являются выраженные побочные действия интерферона. Было описано несколько подходящих маркеров элиминации вируса при СНВ (например, вирусные генотипы А и В, ранняя сероконверсия HBeAg, низкий исходный уровень HBsAg). Однако, принимая во внимание недостаточную эффективность доступных видов лечения, огромное практическое значение имеет установление большего количества (и предпочтительно более надежных) прогностических факторов ответа (или отсутствия ответа) до начала противовирусной терапии.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление дополнительных маркеров положительного или отрицательного результата лечения HBV.

Настоящее изобретение дает возможность понять, что результат лечения гепатита В коррелирует с полиморфизмами нуклеотидов, как в геноме инфицированного индивидуума, так и в геноме HBV, а также с уровнем экспрессии карнитина и производных карнитина у указанного индивидуума. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) генома человека, имеющие отношение к результату лечения HBV, представлены на фиг. 1, a SNPs HBV-генома, имеющие отношения к результату лечения HBV, представлены на фиг. 2. Была использована номенклатура положений нуклеотидов, соответствующая Galibert et al. (Galibert F, et al. Nature. 1979 Oct 25; 281(5733): 646-50). До настоящего изобретения не было известно, что существуют корреляции между геномными + HBV нуклеотидными полиморфизмами и результатом лечения HBV. Также не было известно, что уровни экспрессии карнитина и производных карнитина служат прогностическим признаком результата лечения HBV. Теперь, когда настоящее изобретение дает возможность понять, что нуклеотидные полиморфизмы ассоциируются с результатом лечения, стало возможным типировать содержащий нуклеиновую кислоту образец индивидуума путем определения по меньшей мере одного из полиморфизмов, изображенных на фиг. 1 и/или 2. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования содержащего нуклеиновую кислоту образца пациента с гепатитом В, включающий определение SNP, как показано на фиг. 1 и/или фиг. 2, в нуклеиновой кислоте указанного образца. Способы обнаружения нуклеиновокислотных полиморфизмов известны в данной области техники и, например, включают выделение нуклеиновой кислоты, амплификацию и обнаружение, например, с использованием стандартных способов, таких как ПЦР, мультиплексная амплификация лигированных зондов (MLPA), секвенирование и т.д. Такие хорошо известные методы не нуждаются в дополнительном объяснении.

Кроме того, стало возможным типировать образец пациента с гепатитом В путем определения уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. В соответствии с настоящим изобретением относительно низкий уровень карнитина и/или производного карнитина является прогностическим признаком положительного результата лечения гепатита В, как более подробно указано ниже в этом описании. Один аспект изобретения, таким образом, предоставляет способ типирования образца пациента с гепатитом В, включающий определение уровня экспрессии карнитина и/или производного карнитина в указанном образце. Предпочтительно способ включает определение уровня карнитина и/или производного карнитина в указанном образце.

Карнитин представляет собой четвертичное аммонийное соединение, биосинтез которого происходит из аминокислот лизина и метионина. Карнитин вовлечен в метаболизм жирных кислот, поскольку он осуществляет транспорт длинноцепочечных ацильных групп жирных кислот в матрикс митохондрий. Производное карнитина определяется в этом описании как соединение на основе карнитина, отличное от собственно карнитина, которое содержит фрагмент карнитина, необязательно с модификациями, замещениями, введенными группами и/или делениями, который все еще обладает по меньшей мере одним свойством карнитина - участием в метаболизме жирных кислот. Предпочтительные производные карнитина представляют собой ацетил-L-карнитин и пропионил-L-карнитин. При использовании в этом описании термин «карнитин» включает L-карнитин и D-карнитин. L-карнитин, однако, является предпочтительным.

Способы согласно изобретению, в частности, пригодны для определения, является ли пациент с гепатитом В чувствительным к лечению гепатита В. При использовании в этом описании, пациент с гепатитом В является «чувствительным к лечению гепатита В» в том случае, если у пациента имеется повышенная вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Пациент с положительным результатом лечения называется пациентом, ответившим на лечение. С другой стороны, в случае если у пациента не наблюдается положительный результат лечения, такой пациент называется пациентом, не ответившим на лечение. Способы согласно изобретению позволяют определить, будет ли данный пациент с HBV отвечать на HBV-терапию, до начала такой терапии. Это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что пациенты, которые, не будут отвечать на лечение, могут быть отстранены от лечения, что позволит избежать излишних расходов, тяжести лечения и побочных эффектов. С другой стороны, это обеспечит более легкое включение в терапию пациентов с высокой вероятностью положительного результата лечения HBV, даже в том случае, когда состояние пациента не является оптимальным для осуществления такой терапии, поскольку известно, что для такого пациента вероятность положительного результата лечения значительно выше, чем средняя вероятность.

Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что вышеуказанные способы идентификации не претендуют на то, чтобы быть корректными для 100% подлежащих анализу субъектов. Тем не менее, оценка будет являться достоверной для статистически значимой доли подлежащих анализу субъектов. Является ли доля статистически значимой, специалист в данной области техники может определить с помощью различных хорошо известных методов статистической оценки, например, определения доверительных интервалов, определения р-значения, критерия Стьюдента, критерия Манна-Уитни и т.д. Подробную информацию можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. р-значения составляют предпочтительно 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 или 0,0001. Предпочтительно предусматриваемая настоящим изобретением вероятность обеспечит правильное установление различий по меньшей мере для 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере для 90% субъектов данной когорты или популяции.

На фиг. 1 и 2 изображены SNPs геномов человека и HBV, связанные с результатом лечения HBV. Аллели, ассоциированные с положительным результатом лечения, изображены в шестом столбце фиг. 1а и lb и в четвертом столбце фиг. 2а. Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один ассоциированный с положительным результатом лечения аллель SNP, изображенный на фиг. 1 или 2. Пациент с гепатитом В определяется как имеющий повышенную вероятность получения положительного результата лечения гепатита В, исходя из наличия такого ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля. Отсутствие одного или более ассоциированного с положительным результатом лечения аллеля(ей) SNP, как изображено на фиг. 1 или 2, указывает на более низкую вероятность получения положительного результата лечения гепатита В.

Термин «содержащий нуклеиновую кислоту образец» относится к образцу индивидуума, который содержит или нуклеиновую кислоту указанного индивидуума и/или нуклеиновую кислоту HBV. Термин нуклеиновая кислота охватывает соединения, содержащие цепь нуклеотидов, более предпочтительно ДНК и/или РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный содержащий нуклеиновую кислоту образец представляет собой образец, содержащий ДНК. Мазок слюны или образец крови являются особенно предпочтительными, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что, как показывает опыт, такой образец более часто хранят.

Настоящее изобретение дополнительно способствует пониманию того, что уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, подвергающихся лечению от гепатита В, значительно ниже, чем уровни (экспрессии) карнитина и производных карнитина у пациентов с гепатитом В, не подвергающихся лечению гепатита В (см., например, фиг. 12 и 13). Теперь, когда это понимание существует, стало возможным определить, имеет ли конкретный пациент с гепатитом В повышенную вероятность положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В. Например, уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, такого как ацетил-L-карнитин и проопинил-L-карнитин, у данного пациента определяют с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники. Затем предпочтительно полученное значение сравнивают с эталонным. На основе указанного сравнения протестированного пациента относят к пациентом, которые будут отвечать на лечение, или к пациентам, которые не будут отвечать на лечение. В одном варианте осуществления полученное значение от протестированного пациента сравнивают с эталонным значением группы пациентов, отвечающих на лечение. Если полученное значение соответствует/ равно этому эталонному значению или является более низким, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно выше, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Альтернативно или дополнительно, полученное от тестируемого пациента значение сравнивают с эталонным значением группы пациентов, не отвечающих на лечение. В случае если полученное значение соответствует/равно этому эталонному значению или превышает его, тестируемого пациента относят к «не отвечающим на лечение». Если, однако, полученное значение значительно ниже, тестируемого пациента относят к «отвечающим на лечение».

В основном, любой образец, содержащий продукты экспрессии карнитина и/или производных карнитина является пригодным для осуществления способа в соответствии с данным изобретением. В предпочтительном варианте осуществления используется образец плазмы или крови, поскольку такой образец может быть взят без причинения большого дискомфорта пациенту или регулярно берется для других целей. В одном варианте осуществления используется образец сыворотки. Преимуществом образца сыворотки является тот факт, что такой образец, как показывает опыт, более часто хранят.

Предпочтительно «уровень экспрессии» карнитина и/или производного карнитина относится к уровню собственно карнитина или собственно производного карнитина в образце.

При использовании образца плазмы, как правило, пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина, равный или меньший чем 34 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 33,3 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента с гепатитом В, имеющего уровень экспрессии карнитина более 34 микромоль/л, предпочтительно более 33,3 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина равный или меньший чем 3,89 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,89 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». В одном варианте осуществления пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина, равный или меньший чем 3,0 микромоль/л, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии ацетил-L-карнитина более 3,0 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение». Дополнительно, пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина, равный или меньший чем 0,4 микромоль/л, предпочтительно равный или меньший чем 0,43 микромоль/л, как правило, относят к «отвечающим на лечение», тогда как пациента, имеющего уровень экспрессии пропионил-L-карнитина более 0,4 микромоль/л, предпочтительно более 0,43 микромоль/л, относят к «не отвечающим на лечение».

В одном предпочтительном варианте осуществления значение, полученное от тестируемого пациента, сравнивают с эталонным значением группы, отвечающей на лечение, и с эталонным значением группы, не отвечающей на лечение, и определяют, какое эталонное значение является наиболее близким к полученному исследуемому значению. Затем тестируемого пациента относят к той группе, эталонное значение которой является наиболее близким к полученному исследуемому значению.

Таким образом, один аспект изобретения предоставляет способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата лечения гепатита В по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий определение, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень экспрессии карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительно определяют, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом В уровень карнитина или производного карнитина, который ассоциирован с положительным результатом лечения гепатита В. В одном варианте осуществления указанное производное карнитина содержит ацетил-L-карнитин и/или пропионил-L-карнитин. Предпочтительно количество карнитина или производного карнитина сравнивают по меньшей мере с одним эталонным значением, как объясняется выше. В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 34 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение»), или большим чем 34 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 33,3 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 33,3 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления, определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,0 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,0 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии ацетил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 3,89 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 3,89 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В одном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,4 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,4 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Предпочтительно определяют, является ли уровень экспрессии пропионил-L-карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 0,43 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 0,43 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления определяют, является ли уровень экспрессии карнитина в образце плазмы равным или меньшим чем 29 микромоль/л («пациент, отвечающий на лечение») или большим чем 29 микромоль/л («пациент, не отвечающий на лечение»). Пациент с гепатитом В, имеющий уровень экспрессии карнитина в плазме, равный 29 микромоль/л или меньше обладает даже более высокой вероятностью получения положительного результата лечения гепатита В.

Пациент с хроническим гепатитом В определяется в качестве индивидуума, который будет диагностирован как имеющий инфекцию гепатита В (или HBV инфекцию) через более чем 7 месяцев.

Как правило, наличие HBV диагностируют путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полипептида в образце, взятом у субъекта, более предпочтительно обнаруживается по меньшей мере один из вирусных антигенов HBs (HBsAg, Genbank Асc. No.: AAL66340.1 GI:18252577, SEQ ID NO: 1), HBc (HBcAg, Genbank Acc. No.: CAA51257.1 GI:288930, SEQ ID NO: 2) и HBe (HBeAg, Genbank Acc. No.: AAM96930.1 GI:22530876, SEQ ID NO: 3). Специалисту ясно, что полипептиды HBV упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полипептиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, которые могут содержать варианты последовательностей вышеуказанных полипептидов HBV. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полипептиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полипептиды, измененные в результате добавления, замены, делеции и/или модификации по меньшей мере одной аминокислоты в упомянутых выше HBV полипептидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полипептиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными вышеуказанным специфическим полипептидам.

Термин «идентичный" при использовании в этом описании относится к идентичности последовательности, характеризующейся определением количества идентичных нуклеотидов или аминокислот между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, соответственно, при этом последовательности выровнены так, что получено соответствие самого высокого порядка. Он может быть вычислено с помощью опубликованных методов или способов, имеющих вид компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Процент идентичности, в одном аспекте, вычисляется относительно полной последовательности нуклеиновой кислоты или последовательности аминокислоты. Для сравнения различных последовательностей специалистами в данной области доступна серия программ на основе целого ряда алгоритмов. В этом контексте, в частности, дают надежные результаты алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman. Для проведения выравнивания последовательностей можно использовать программу PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5,151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью пакета программ GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, в данном описании выраженные в процентах (%), в другом аспекте изобретения, определяют с помощью программы GAP относительно участка полной последовательности при использовании следующих параметров: Штраф за открытие гэпа: 50, штраф за продолжение гэпа: 3, Average Match: 10000 и Average Mismatch: 0000, которые, если не указано иное, всегда используются в качестве стандартных параметров при выравнивании последовательностей.

Кроме того, предпочтительно наличие HBV устанавливается путем обнаружения по меньшей мере одного вирусного полинуклеотида, предпочтительно вирусной ДНК, в образце, полученном от пациента. Последовательности нуклеотидов вирусных полинуклеотидов или полного HBV-генома хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно последовательности нуклеотидов HBV размещены для хранения в Genbank под учетным номером NC 003977.1. Специалисту ясно, что HBV полинуклеотиды упоминаются в качестве биомаркеров, а не как специфические полинуклеотиды, и что термин HBV охватывает различные штаммы HBV, содержащие варианты нуклеотидных последовательностей. Соответственно, следует понимать, что вышеуказанные полинуклеотиды, имеющие специфические последовательности, депонированные под учетными номерами в Genbank, являются иллюстративными последовательностями, представляя биомаркер. Поэтому, также возможно обнаружить «вариантные» (другие) полинуклеотиды, измененные в результате добавления, замены, делении и/или модификации по меньшей мере одного нуклеотида в упомянутых выше HBV-полинуклеотидах, при условии, что они также являются пригодными в качестве биомаркеров для HBV-инфекции, как обсуждалось выше. Предпочтительно «вариантные» полинуклеотиды являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными упомянутым выше специфическим полинуклеотидам. Идентичность может быть вычислена, как изложено выше.

Предпочтительно термин HBV-инфекция относится к хронической HBV-инфекции. Хроническая HBV-инфекция предпочтительно отличается обнаружимым наличием HBV у субъекта в течение периода более шести месяцев. Более предпочтительно упоминаемая в описании хроническая HBV-инфекция соответствует определению, опубликованному Центром по контролю заболеваемости (CDC), согласно которому хроническая HBV-инфекция характеризуется следующими лабораторными параметрами: IgM антитела к коровому антигену вируса гепатита В (IgM анти-НВс), отрицательным AND и положительным результатом на один из следующих тестов: поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), е-антиген вируса гепатита В (HBeAg) или ДНК OR вируса гепатита В (HBV), положительный HBsAg или HBV ДНК положительный по меньшей мере при проведении два раза с интервалом 6 месяцев (допускается любая комбинация этих тестов, осуществленная с интервалом 6 месяцев).

Следовательно, один предпочтительный вариант осуществления предоставляет способ согласно изобретению, в котором указанный пациент с гепатитом В страдает от хронического гепатита В.

Последовательность нуклеиновой кислоты, в которой в популяции возможна более чем одна последовательность, называется в описании "полиморфным сайтом". Полиморфные сайты могут приводить к различиям последовательностей в результате замен, вставок или делеций. Такие замены, вставки или делеции могут приводить в результате к сдвигу рамки, образованию преждевременных стоп-кодонов, делеции или добавлению одной или более аминокислот, кодируемых полинуклеотидом, изменению сайтов сплайсинга и могут также влиять на стабильность или транспорт мРНК. В том случае, когда полиморфный сайт представляет собой один нуклеотид в длину, такой сайт называется однонуклеотидным полиморфизмом ("SNP").

Термин "SNP" относится к однонуклеотидному полиморфизму в конкретном положении в геноме млекопитающего, который варьирует в популяции индивидуумов. При использовании в данном описании SNP может отождествляться по его названию или расположению в конкретной последовательности. SNPs, представленные на фиг. 1b, показаны скобками. Например, SNP "[A/G]" в последовательности rs12356193 на фиг. 1b указывает, что нуклеиновое основание (или аллель) в этом положении в последовательности может быть или аденином или гуанином. Аллель, ассоциированный с положительным результатом лечения гепатита В (например, гуанин в rs12356193), указан в столбце шесть на фиг. 1а и 1b или столбце четыре на фиг. 2а. Нуклеотиды, фланкирующие SNPs на фиг. 1b, являются фланкирующими последовательностями, которые используются для идентификации положения SNP в геноме. При использовании в описании, нуклеотидные последовательности, упоминаемые в настоящей заявке, включают комплементарные цепи указанных нуклеотидных последовательностей. В дополнение к этому, при использовании в описании термин "SNP" рассматривает любой аллель из числа набора аллелей.

Термин "аллель" относится к специфическому нуклеотиду из числа «ассортимента» нуклеотидов, определяющих SNP.

Термин "ассоциированный с положительным результатом аллель" или "аллель положительного результата" имеет отношение к аллелю, связанному с положительным результатом лечения гепатита В. Предпочтительные виды лечения гепатита В и предпочтительные способы лечения для получения положительного результата перечисляются в описании далее. Шестые столбцы на фиг. 1а и 1b и четвертый столбец на фиг. 2а показывают ассоциированные с положительным результатом аллели согласно настоящему определению.

Термин "гаплотип" относится к комбинации определенных аллелей из двух или более SNPs.

Термин "гаплотип положительного результата" относится к гаплотипу, связанному с положительным результатом лечения гепатита В.

Термин "полинуклеотид" имеет отношение к полимерным формам нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру, включая одноцепочечную, двухцепочечную и тройную спиральную структуру молекулы, и могут осуществлять любую функцию, известную и неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, короткие интерферирующие молекулы нуклеиновых кислот (siNA), рибозимы, сДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные ДНК любой последовательности, изолированные РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид также может содержать модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, такие как метилированные молекулы нуклеиновых кислот и аналоги молекул нуклеиновых кислот.

"Практически изолированный" или "изолированный" полинуклеотид - это полинуклеотид, практически свободный от последовательностей, с которыми он связан в природе. «Практически свободный» означает, что по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% не содержит веществ, с которыми он связан в природе. "Изолированный полинуклеотид" также включает рекомбинантные полинуклеотиды, которые вследствие происхождения или манипуляции: (1) являются не связанными с полным или частью полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (2) являются связанными с полинуклеотидом, отличным от полинуклеотида, с которым они связаны в природе, или (3) не встречаются в природе.

Термин "вектор" имеет отношение к молекуле ДНК, которая несет ДНК, предназначенную для вставки и навсегда сохраняющуюся в клетке-хозяине. Векторы также известны как клонирующие векторы, клонирующие носители или носители. Термин "вектор" включает векторы, которые используются главным образом для вставки молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, векторы репликации, которые используются главным образом для репликации нуклеиновых кислот, и векторы экспрессии, которые используются для транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также включаются векторы, обеспечивающие более чем одну из вышеупомянутых функций.

При помощи способа настоящего изобретения можно определить, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность получения положительного результата при лечении гепатита В. При использовании в описании термин «положительный результат» может иметь несколько клинических проявлений. В одном варианте осуществления положительный результат определяется как уменьшение HBsAg более чем на 1,5 log в крови указанного пациента. Предпочтительно указанное уменьшение HBsAg наблюдается на или до 24 недели лечения. Это означает, что количество обнаружимого HBsAg уменьшается быстрее, чем среднее значение HBsAg, наблюдаемое в популяции с гепатитом В, получающей тот же самый вид лечения. Быстрое уменьшение служит признаком более высокой вероятности подавления или излечения гепатита В, включая более высокую вероятность сероконверсии HBsAg, несмотря на то, что это происходит не всегда. Сероконверсия HBsAg определяется как отсутствие обнаружимого HBsAg в крови пациента и появление анти-HBs антител в крови. Таким образом, один вариант осуществления предоставляет способ определения, имеет ли пациент с гепатитом В повышенную вероятность уменьшения HBsAg более чем на 1,5 log, в его/ее крови на или до 24 недели лечения HBV, по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который связывается с положительным результатом лечения гепатита В.

В предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как устойчивый вирусологический ответ. Это означает, что получены уровни ДНК HBV равные или ниже чем 2000 IU/мл крови, а уровни аланин аминотрансферазы нормализуются в течение 2 лет дальнейшего наблюдения. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность устойчивого вирусологического ответа после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/или установление, содержит ли образец указанного пациента с гепатитом уровень (экспрессии) карнитина или производного карнитина (предпочтительно ацетил-L-карнитина и/или проприонил-L-карнитина), который ассоциируется с положительным результатом лечения гепатита В.

В отдельном предпочтительном варианте осуществления положительный результат лечения гепатита В определяется как отсутствие HBsAg. Это означает, что HBsAg исчезает из крови. Клиренс HBsAg является ближайшей к клиническому выздоровлению точкой и связан с увеличенной выживаемостью и более низким риском развития цирроза печени и гепатоклеточной карциномы. Как показано в примерах, настоящим изобретением предоставляются SNPs, которые сопряжены с этим наиболее благоприятным результатом. Кроме того, уровни карнитина и производных карнитина по-видимому коррелируют с этим наиболее благоприятным результатом. Поэтому дополнительно предоставляется способ определения, имеется ли у пациента с гепатитом В повышенная вероятность отсутствия HBsAg после лечения HBV по сравнению со средним значением в популяции пациентов с гепатитом В, включающий установление, содержит ли содержащий нуклеиновую кислоту образец указанного пациента с гепатитом В по меньшей мере один аллель SNP, ассоциированный с положительным результатом, как показано на фиг. 1 и/или на фиг. 2, и/ил