Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественной опухоли

Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественной опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому применению антитела против CAPRIN-1 или его фрагмента в лекарственном средстве, таком как терапевтическое и/или профилактическое средство, против злокачественной опухоли.

Уровень техники

Злокачественная опухоль является основной причиной смерти. Это заболевание в настоящее время лечат в основном с помощью хирургического вмешательства в комбинации с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов или открытие новых средств против злокачественной опухоли в последнее время, исход существующих способов лечения злокачественных опухолей улучшился в недостаточной мере, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате последних достижений в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, гены, кодирующие такие антигены злокачественных опухолей, что увеличило ожидания в отношении специфической терапии злокачественной опухоли, нацеленной на антигены злокачественных опухолей (непатентный документ 1).

Для уменьшения неблагоприятных явлений терапии злокачественной опухоли, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, редко встречались в нормальных клетках и специфически существовали в злокачественных клетках. В 1991 году, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-положительными Т-клетками, способом клонирования кДНК на основе экспрессии, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реактивные в отношении злокачественных опухолей (непатентный документ 2). В дальнейшем был описан способ SEREX (серологическая идентификация антигенов путем рекомбинантного клонирования на основе экспрессии), который основан на подходе клонирования генов на основе экспрессии, для идентификации опухолевых антигенов, распознаваемых антителами, продуцируемыми в ответ на аутологичную злокачественную опухоль in vivo у пациента со злокачественной опухолью (непатентный документ 3 и патентный документ 1). Согласно этому способу были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые редко экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (непатентные документы 4-9). Кроме того, проводятся клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, или иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин и т.п., содержащих антигены злокачественных опухолей.

В последние годы во всем мире были выпущены различные лекарственные средства на основе антител для лечения злокачественных опухолей, которые нацелены на антигенные белки на злокачественных клетках. Эти лекарственные средства привлекли внимание вследствие их определенной эффективности в качестве терапевтических средств, специфичных к злокачественной опухоли. Однако большинство антигенных белков, на которые нацелены лекарственные средства, также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антител повреждаются не только злокачественные клетки, но также и нормальные клетки, экспрессирующие антигены, что является отрицательным результатом и приводит к неблагоприятным реакциям. Следовательно, можно ожидать, что если бы можно было идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественных клеток, и использовать антитела, нацеленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда эти лекарственные средства на основе антител обеспечивали бы лечение, вызывая меньше неблагоприятных реакций.

Цитоплазматический и ассоциированный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) известен как внутриклеточный белок, который экспрессируется при активации или клеточном делении покоящихся клеток и формирует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетках для участия в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Было обнаружено, что этот белок специфически экспрессируется на поверхности злокачественных клеток, и, таким образом, его исследуют в качестве мишени для лекарственных средств на основе антител для лечения злокачественных опухолей (патентный документ 2).

Список литературы

Патентная литература

Патентный документ 1: Патент США 5698396

Патентный документ 2: WO 2010/016526.

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan)

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genenet. 6: 33-3 9, 1997.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является получение антитела, которое нацелено на CAPRIN-1, специфически экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток, и которое имеет улучшенную противоопухолевую активность по сравнению с общепринятыми антителами, и обеспечение применения антитела в качестве терапевтического и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

Решение проблемы

Настоящее изобретение имеет следующие аспекты.

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которые обладают иммунологической реактивностью в отношении частичного полипептида CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более высокую идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, и к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей их в качестве активного ингредиента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфому, фибросаркому, мастоцитому или меланому.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

В альтернативном варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

Настоящее описание включает содержание патентной заявки Японии № 2011-171300, на основе которой испрашивается приоритет настоящей заявки.

Преимущественные эффекты изобретения

Антитело против CAPRIN-1, используемое согласно настоящему изобретению, повреждает злокачественные клетки. Таким образом, антитело против CAPRIN-1 применимо при лечении и/или профилактике злокачественной опухоли.

Описание вариантов осуществления

Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое распознает и связывает заданный частичный полипептид CAPRIN-1 и обладает противоопухолевой активностью. Более конкретно, антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело, которое распознает (т.е. обладает иммунологической реактивностью в отношении) частичный полипептид белка CAPRIN-1 (частичный полипептид CAPRIN-1), состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Сущность настоящего изобретения заключается в том, что это антитело проявляет противоопухолевую активность. Настоящее изобретение относится ко всем антителам, которые связываются с фрагментами белка CAPRIN-1, как описано выше, и проявляют противоопухолевую активность.

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению может представлять собой любой тип антитела, который может проявлять противоопухолевую активность и включает, например, рекомбинантные антитела, например, синтетические антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), антитела человека и фрагменты этих антител, например, Fab, F(ab')₂ и Fv. Эти антитела и их фрагменты можно получать способами, известными специалистам в данной области. Желательно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению обладало иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1 или его частичного полипептида, т.е. связывалось с белком CAPRIN-1 через взаимодействие антиген-антитело, предпочтительно, специфично связывалось с белком CAPRIN-1. В этом контексте выражение "специфическое связывание с белком CAPRIN-1" означает, что антитело специфически связывается с белком CAPRIN-1, по существу не связываясь с другими белками. Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Альтернативно, антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, при условии, что могут стабильно продуцироваться гомогенные антитела. В случае, когда субъектом является человек, желательно антитело человека или гуманизированное антитело для предотвращения или подавления отторжения.

Антитело против полипептида CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению можно исследовать в отношении его противоопухолевой активности, как описано ниже, путем исследования in vivo ингибирования роста опухоли у животного, имеющего злокачественную опухоль, или путем исследования ex vivo присутствия или отсутствия опосредуемой иммуноцитами или комплементом цитотоксической активности, которую проявляет антитело против опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид.

Субъектом, которому проводят лечение и/или профилактику злокачественной опухоли согласно настоящему изобретению, является млекопитающее, такое как человек, домашнее животное, скот или спортивное животное, предпочтительно человек.

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Получение антигена для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антитела против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению, не ограничиваются видом животного, служащего их источником, включая, например, людей, собак, крупный рогатый скот, лошадей, мышей, крыс или кур. Однако белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительными являются белки, происходящие от млекопитающих. В частности, предпочтительными являются белки, происходящие от человека. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, можно использовать белки CAPRIN-1 человека, их частичные пептиды или клетки, экспрессирующие CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и его гомологов доступны, например, в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В настоящем изобретении, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенью в виде CAPRIN-1 являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100% и, еще более предпочтительно, на 95%-100%, например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100% или 99,5%-100%, идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части эталонной последовательности. В этом контексте термин "% идентичность последовательностей" означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований), от общего числа аминокислот (или нуклеотидных оснований), когда две последовательности выравнивают так, чтобы могла достигаться максимальная степень сходства (или идентичность), с внесением пропусков или без него.

В качестве фрагментов каждого белка CAPRIN-1 можно использовать фрагменты, содержащие эпитоп (или антигенную детерминанту), который является наименьшей единицей, распознаваемой антителом, и имеющие длину в диапазоне от длины аминокислотной последовательности эпитопа до менее чем полноразмерного белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, имеющему антигенность или иммуногенность у млекопитающих, предпочтительно у человека. Его наименьшая единица состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, например, 8-11 аминокислот. Фрагменты белка CAPRIN-1 для применения при получении антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой фрагменты, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, имеющую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, распознаваемой антителом по настоящему изобретению, или содержащую по меньшей мере эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в любой из этих аминокислотных последовательностей.

Полипептидные фрагменты, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонил) или способ tBoc (трет-бутилоксикарбонил) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japan), 1981). Также эти пептиды могут быть синтезированы общепринятыми способами с использованием целого ряда коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов.

Альтернативно, можно получать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, с использованием подходов генной инженерии, известных в данной области (Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, the 3rd edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; и т.д.), и встраивать их в экспрессирующие векторы, которые затем вводят в клетки-хозяева, так чтобы в клетках-хозяевах продуцировались полипептиды. Таким путем можно получать представляющие интерес белки CAPRIN-1 человека или их полипептидные фрагменты.

Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, легко могут быть получены с помощью подходов генной инженерии, известных в данной области, или общепринятых способов с использованием коммерчески доступных устройств для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность гена CAPRIN-1 человека, можно получать с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК или библиотеки кДНК человека в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных так, чтобы они были способны амплифицировать нуклеотидную последовательность. Условия реакции для этой ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Примеры условий могут включать, но, не ограничиваясь ими, 30 циклов, каждый из которых вовлекает стадии реакции, состоящие из: 94°C в течение 30 секунд (денатурация); 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C в течение 2 минут (элонгация) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимераза, Pfu-полимераза и т.п.) и Mg²⁺-содержащего буфера для ПЦР, с последующим взаимодействием при 72°C в течение 7 минут. Подход ПЦР, условия и т.д. описаны, например, в Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (в частности, глава 15).

Также можно получать соответствующие зонды и праймеры на основе информации о нуклеотидных последовательностях гена CAPRIN-1 и аминокислотных последовательностях белка CAPRIN-1 и использовать при скрининге, например, библиотеки кДНК человека, для выделения желаемой ДНК. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок CAPRIN-1. Примеры таких клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников или из злокачественных опухолей, или из опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких, рак поджелудочной железы и рак ободочной и прямой кишки. Эти действия, включающие получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области, и они могут быть выполнены согласно способам, описанным, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). Из ДНК, полученных таким образом, можно получать ДНК, кодирующие белки CAPRIN-1 человека и их частичные пептиды.

Клетки-хозяева, в которые вводят экспрессирующие векторы, могут представлять собой любую клетку, способную экспрессировать указанные выше полипептиды. Примеры прокариотических клеток включают, но, не ограничиваясь ими, E. coli. Примеры эукариотических клеток включают, но, не ограничиваясь ими: клетки млекопитающих, такие как клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичников китайского хомячка CHO; линию клеток эмбриональной почки человека HEK293; линию клеток эмбриональной кожи мыши NIH3T3; клетки дрожжей, такие как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей; клетки тутового шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, используемый экспрессирующий вектор может иметь ориджин, который позволяет репликацию в прокариотических клетках, промотор, участок связывания с рибосомой, участок множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости к лекарственному средству, ген ауксотрофной комплементарности и т.п. Примеры экспрессирующих векторов для E. coli могут включать серию pUC, pBluescript II, экспрессирующие системы pET и экспрессирующие системы pGEX. ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют прокариотические клетки-хозяева, и затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы полипептиды, кодируемые этими ДНК, экспрессировались в прокариотических клетках-хозяевах. При этом полипептиды могут быть экспрессированы в качестве слитых белков с другими белками.

В случаях использования эукариотических клеток в качестве клеток-хозяев можно использовать экспрессирующие векторы для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, участок добавления поли(А) и т.п. Примеры таких экспрессирующих векторов включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Аналогичным путем, как описано выше, ДНК, кодирующую указанные выше полипептиды, можно встраивать в такие экспрессирующие векторы, которыми затем трансформируют эукариотические клетки-хозяева, и затем полученные трансформанты культивируют так, чтобы в эукариотических клетках-хозяевах экспрессировались полипептиды, кодируемые этими ДНК. В тех случаях, когда используют экспрессирующие векторы, такие как pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 или pEGFP-C1, полипептиды могут быть экспрессированы в виде различных слитых белков, меченных His-меткой (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-меткой, myc-меткой, HA-меткой, GFP и т.п.

Экспрессирующие векторы можно вводить в клетки-хозяева с использованием хорошо известных способов, таких как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, инфицирование вирусом, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев комбинацией способов разделения, известных в данной области. Их примеры включают, но, не ограничиваясь ими, обработку денатурирующим веществом (например, мочевиной) или поверхностно-активным веществом, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию с обращенной фазой.

Для получения антитела согласно настоящему изобретению, антигены, полученные таким образом, можно использовать в качестве сенсибилизирующих антигенов, как описано ниже.

Структура антитела

В основном, антитела (иммуноглобулины) представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, каждый из которых содержит по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. Иммуноглобулины, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами размером приблизительно 150 кДа, каждый из которых содержит две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, хотя число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном конце, за которым следует несколько последовательно расположенных константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) на одном конце и имеет одну константную область на другом конце. Константная область легкой цепи расположена параллельно первой константной области тяжелой цепи, в то время как вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Конкретные области вариабельного домена антитела, которые называются "определяющими комплементарность областями (CDR)", демонстрируют специфическую вариабельность и придают антителу специфичность связывания. Относительно консервативные участки в вариабельной области называются "каркасными областями (FR)". Каждый полный вариабельный домен тяжелой и легкой цепи содержит четыре FR, соединенные друг с другом посредством трех CDR. Эти три CDR обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, в указанном порядке от N-конца тяжелой цепи. Аналогично, в легкой цепи CDR обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. CDRH3 наиболее важна для специфичности связывания антитела с его антигеном. Кроме того, CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга FR областями, и они вносят вклад в формирование антигенсвязывающего центра в антителе вместе с CDR на другой цепи. Константные области непосредственно не вносят вклад в связывание антитела с антигеном, однако они проявляют различные эффекторные функции, например, вовлечение в антителозависимую клеточноопросредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, опосредуемый связыванием с Fcγ-рецептором, период полужизни/скорость выведения через неонатальный Fc рецептор (FcRn), и комплементзависимую цитотоксичность (CDC) через компонент C1q в каскаде реакций системы комплемента.

Получение антитела

Антитело против CAPRIN-1 согласно настоящему изобретению означает антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полноразмерного белка CAPRIN-1 или его фрагмента. В частности, антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению представляет собой антитело, иммунологически связывающееся с частичным полипептидом белка CAPRIN-1 (частичный полипептид CAPRIN-1), который представляет собой пептид, содержащий эпитоп и состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно распознает эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в аминокислотой последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Это антитело против CAPRIN-1 по настоящему изобретению может специфически связываться полноразмерным белком CAPRIN-1. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем отбора антитела, иммунологически связывающегося с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, согласно общепринятому способу, из антител, полученных с помощью белка CAPRIN-1 или его фрагментов в качестве антигенов.

В этом контексте "иммунологическая реактивность" означает свойство связывания антитела с антигеном CAPRIN-1 (полноразмерный белок CAPRIN-1 или его частичный полипептид) in vivo. Посредством такого связывания антитела по настоящему изобретению с CAPRIN-1 антитело проявляет функцию повреждения (например, гибель, подавление или регрессию) опухолевых клеток. Антитело по настоящему изобретению может повреждать опухоли, такие как рак молочной железы, рак почки, рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки (например, рак толстой кишки), рак легких, опухоль головного мозга, рак желудка, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, лейкоз, лимфома, фибросаркома, мастоцитома или меланома, в результате связывания с белком CAPRIN-1.

Антитело по настоящему изобретению может представлять собой любой тип антитела. Примеры типа антитела согласно настоящему изобретению включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Также антитело представляет собой любой класс молекулы иммуноглобулина, например, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD или IgY, или любой подкласс, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.

Кроме того, антитело может быть модифицировано ацетилированием, формилированием, амидированием, фосфорилированием, пегилированием и т.п., в дополнение к гликозилированию.

Далее представлены примеры получения различных антител.

Когда антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, например, клеточную линию рака молочной железы SK-BR-3, экспрессирующую CAPRIN-1, вводят каждой мыши для иммунизации. Из этих мышей извлекают селезенку. После выделения клеток селезенки клетки подвергают слиянию с клетками миеломы мыши. Из полученных слитых клеток (гибридом) отбирают клоны, продуцирующие антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток (гибридомы). Альтернативно, можно отбирать клоны, продуцирующие антитела, связывающиеся с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, имеющей 80% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обладающие эффектом ингибирования роста злокачественных клеток, или гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против полипептидов SEQ ID NO:5 и т.д., выделяют и культивируют. Антитело по настоящему изобретению можно получать путем очистки из культурального супернатанта согласно общему способу аффинной очистки.

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, можно получать, например, следующим образом. Сначала животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном способом, известным в данной области. Этот способ иммунизации обычно включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующих антигенов млекопитающим. В частности, сенсибилизирующие антигены разводят или суспендируют в PBS (забуфернный фосфатом солевой раствор), физиологическом растворе и т.п. до получения в результате подходящего количества, и затем смешивают, если желательно, с соответствующим количеством общепринятого адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования их вводят каждому млекопитающему несколько раз каждые 4-21 суток. Альтернативно, для иммунизации сенсибилизирующими антигенами можно использовать подходящий носитель.

После подтверждения увеличения уровня желаемого антитела в сыворотке животного (как правило, млекопитающего), иммунизированного таким образом, иммуноциты собирают от животного и подвергают слиянию клеток. Предпочтительные примеры иммуноцитов, в частности, включают клетки селезенки.

В качестве родительских клеток-партнеров, подлежащих слиянию с иммуноцитами, можно использовать, например, клетки миеломы млекопитающих. В качестве клеток миеломы предпочтительно используют различные клеточные линии, известные в данной области, например, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы можно проводить в основном согласно способу, известному в данной области, например, способом Kohler и Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Более конкретно, слияние клеток проводят, например, в присутствии фактора, стимулирующего слияние клеток, в общепринятой питательной среде. Например, в качестве фактора, стимулирующего слияние клеток, используют полиэтиленгликоль (PEG) и японский гемагглютинирующий вирус (HVJ). При желании, для повышения эффективности слияния можно дополнительно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид.

Соотношение между иммуноцитами и используемыми клетками миеломы может быть выбрано произвольно. Например, количество иммуноцитов предпочтительно выбирают так, чтобы оно превышало количество клеток миеломы в 1-10 раз. Примеры среды, которую можно использовать для слияния клеток, включают среду RPMI1640 и среду MEM, пригодные для роста линий клеток миеломы, а также другие общепринятые среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, в комбинации с этими средами можно использовать добавку на основе сыворотки, такую как фетальная телячья сыворотка (FCS).

Для слияния клеток иммуноциты и клетки миеломы тщательно перемешивают в заранее определенном количестве среды. Обычно к смеси добавляют раствор PEG (средняя молекулярная масса приблизительно 1000-6000), предварительно нагретый

приблизительно до 37°C, в концентрации 30%-60% (масс./об.), и перемешивают с ним для образования представляющих интерес гибридом. После этого предпочтительно осуществляют повторяющиеся действия, состоящие в последовательном добавлении соответствующей среды и удалении супернатанта центрифугированием для удаления агентов слияния клеток и т.п., которые не являются благоприятными для роста гибридом.

Полученные таким образом гибридомы культивируют в общепринятой селективной среде, например, среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин) для селекции. Культивирование в среде HAT продолжают в течение периода времени (как правило, от нескольких суток до нескольких недель), достаточного для гибели клеток (неслитых клеток), отличных от представляющих интерес гибридом. Затем проводят скрининг гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело, и клонирование в виде единичных клонов общепринятым способом лимитирующих разведений.

В дополнение к такому получению гибридом путем иммунизации не являющихся человеком животных антигенами, гибридомы, продуцирующие антитела человека, обладающие желаемой активностью (например, активностью ингибирования роста клеток), можно получать путем сенсибилизации лимфоцитов человека, например, инфицированных вирусом EB лимфоцитов человека, белками, экспрессирующими белок клетками или их лизатами in vitro, и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с полученными от человека клетками миеломы, способными постоянно делиться, например, U266 (номер доступа № TIB196).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные таким образом, можно субкультивировать в общепринятой среде, а также можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.

В частности, желаемые антигены или клетки, экспрессирующие желаемые антигены, используют в качестве сенсибилизирующих антигенов при иммунизации согласно общепринятому способу иммунизации. Полученные иммуноциты подвергают слиянию с родительскими клетками, известными в данной области, согласно общепринятому способу слияния клеток. Клетки (гибридомы), продуцирующие моноклональное антитело, можно подвергать скринингу общепринятым способом скрининга для получения гибридом, продуцирующих представляющие интерес антитела.

Другим примером антитела, которое можно использовать в настоящем изобретении, является поликлональное антитело. Поликлональное антитело можно получать, например, следующим образом.

Получают сыворотку небольших животных, таких как мыши, мыши, продуцирующие антитела человека, или кролики, иммунизированные природным белком CAPRIN-1 или рекомбинантным белком CAPRIN-1, экспрессируемым в виде слитого белка с GST, и т.п. в микроорганизмах, таких как E. coli, или его частичными пептидами. Альтернативно, можно получать сыворотку млекопитающих, иммунизированных фрагментами полипептидов CAPRIN-1, каждый из которых содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью (предпочтительно, полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5), или полипептидами, каждый из которых содержит (предпочтительно, состоит из) эпитоп, состоящий приблизительно из 7-12 последовательно расположенных аминокислот, например, 8-11 последовательно расположенных аминокислот, в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:5, или аминокислотной последовательностью, имеющей 80% или более, предпочтительно 85% или более, более предпочтительно 90% или более, еще более предпочтительно 95% или более идентичность последовательности с данной аминокислотной последовательностью, в качестве сенсибилизирующих антигенов. Эти сыворотки очищают с использованием, например, преципитацией с сульфатом аммония, колонок с белком A или белком G, ионообменной хроматографии с DEAE или аффинных колонок, с которыми связаны белки CAPRIN-1 или синтетические пептиды, с получением поликлонального антитела против CAPRIN-1. Поликлональное антитело по настоящему изобретению включает антитела, полученные из животных, продуцирующих антитела человека (например, мышей), иммунизированных белком CAPRIN-1.

В этом контексте, например, мыши KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) или мыши XenoMouse (Amgen Inc.) известны в качестве мышей, продуцирующих антитела человека (например, международные публикации № WO02/43478 и WO02/092812). Из крови таких мышей, иммунизированных белками CAPRIN-1 или их фрагментами, можно получить полные поликлональные антитела человека. Альтернативно, из мышей, иммунизированных таким образ