Полипептид для понижения уровня сахара в крови на основе глюкагоноподобного пептида-1 человека, рекомбинантный штамм-продуцент e. coli и способ получения этого полипептида

Полипептид для понижения уровня сахара в крови на основе глюкагоноподобного пептида-1 человека, рекомбинантный штамм-продуцент e. coli и способ получения этого полипептида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного генетически модифицированного производного глюкагоноподобного пептида-1 человека (рмГПП-1), полученного путем микробиологического синтеза и характеризующегося пролонгированным сахаропонижающим действием, что позволяет рассматривать его в качестве основы перспективного лекарственного средства (ЛС) для лечения сахарного диабета типа 2 (СД2).

Сахарный диабет является хроническим, угрожающим жизни заболеванием. Будучи одним из самых затратных заболеваний как в социальном, так и экономическом плане, сахарный диабет приобрел значение одной из важнейших мировых проблем в области здравоохранения [Дедов и др., 2008].

В настоящее время при терапии инсулинозависимого СД2 предпочтение отдается средствам, способным не только компенсировать диабет, но и задерживать развитие и прогрессирование его осложнений. Основной целью современных способов лечения болезни является компенсация нарушений углеводного обмена [Алгоритмы, 2015].

Этим условиям удовлетворяют ЛС, действие которых подобно действию природного пептидного гормона глюкагоноподобного пептида-1 человека (ГПП-1), относимого к семейству инкретинов и вызывающего стимуляцию секреции инсулина в ответ на прием пищи.

Такие ЛС, реализующие «инкретиновый» эффект, содержат в качестве активного компонента различные аналоги ГПП-1, действующие как агонисты рецепторов ГПП-1. Одним из главных проявлений биологической активности таких ЛС является стимулирование процесса выведения сахара, а именно глюкозы, из крови. Но не менее ценно, что одновременно с сахаропонижающим эффектом применение таких ЛС способствует преодолению дисфункции β-клеток, т.е. воздействует непосредственно на причину повышения уровня сахара в крови.

Природный ГПП-1 представляет собой пептид, который в организме человека присутствует в трех формах: ГПП-1(1-37); ГПП-1(7-37); ГПП-1(7-36)NH₂. Инкретиновой активностью в одинаковой степени обладают лишь формы 2 и 3.

Первичная структура формы ГПП-1(7-37) представлена ниже.

Однако применение форм ГПП-1(7-37) и ГПП-1(7-36)NH₂ для лечения СД2 является неэффективным в связи с их крайне низкой стабильностью в кровотоке (период полураспада 1-2 мин). Известно, что основной вклад в их быструю инактивацию вносит фермент дипептидилпептидаза-4 (ДПП-4), присутствующий на поверхности большинства клеток, а также циркулирующий в крови [Kikuchi et al., 1988]. Этот фермент отщепляет от активированных форм ГПП-1 N-концевой дипептид HisAla, содержащий аланин, который и определяет чувствительность форм ГПП-1(7-37) и ГПП-1(7-36)NH₂ к ДПП-4.

В этой связи на практике вместо нативных форм ГПП-1 применяют их аналоги, обладающие одновременно схожим действием и высокой протеолитической стабильностью, или же используют ингибиторы ДПП-4, блокирующие протеолитическую активность фермента [Capuano et al., 2013].

Аналоги ГПП-1 получают с помощью химического синтеза и/или с использованием рекомбинантных технологий. В последнем случае речь идет исключительно о разработке аналогов ГПП-1(7-37).

Основными направлениями разработки рекомбинантных аналогов ГПП-1 являются: (1) поиск мутантных производных ГПП-1 с увеличенной устойчивостью к действию ДПП-4; (2) получение производных ГПП-1, слитых с долгоживущими белками крови (далее в тексте для их обозначения использован термин «фьюжин»).

При разработке мутантных производных ГПП-1(7-37), как правило, производят замену аланина-8, что приводит к значительному снижению эффективности действия ДПП-4. В роли замещающего остатка используют Gly, Val или Ser [Gao et al., 2009]. В частности, аналоги ГПП-1(7-37), содержащие замену Ala8Gly, применяются в составе ЛС Альбиглютида (Albiglutide) [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008] и Дулаглютида [http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Public_assessment_report/human/002825/WC500179473.pdf].

Блокирующий эффект в отношении ДПП-4-зависимой деградации вызывает также удлинение ГПП-1 с N-конца, например, путем присоединения остатка лизина [Gao et al., 2009].

Известны также аминокислотные замены в составе ГПП-1, которые приводят к увеличению биологической активности мутантных аналогов или повышают их устойчивость к инактивации под действием других протеолитических ферментов [Gao et al., 2009].

Устойчивости к протеолитической инактивации достигают также путем внесения замен, приводящих к изменению конформации производных ГПП-1. Известен стабилизированный аналог ГПП-1, в составе которого сформирована дисульфидная связь, для чего в положения С33 и С37 введены остатки цистеина, а С-конец удлинен путем присоединения пептида PSSGAPPPSGGGGG [Li et al., 2011]. Стабилизируют мутантные производные ГПП-1 и путем введения замещающих остатков, способных формировать внутримолекулярные лактамовые мостики [Murage et al., 2010].

Увеличение времени жизни и активности природного агониста рецептора ГПП-1 - белка эксенатида (Exenatide) достигают за счет его С-концевого удлинения, осуществляемого путем присоединения шести остатков лизина [Barnett, 2011].

Известны также стабилизированные аналоги ГПП-1, удлиненные с С-конца путем присоединения долгоживущих белков крови или их функциональных фрагментов.

Эффективные фьюжины производных ГПП-1 получены с такими белками крови, как IgG [US 8071103; Wang et al., 2010], сывороточный альбумин [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008], трансферрин [Kim et al., 2010], эластин [US 8178495] и другие. В составе некоторых из них используют мутантный вариант ГПП-1(7-37), содержащий замену Ala8Gly.

Производные ГПП-1 в составе таких фьюжинов устойчивы к деградации и сохраняют сахаропонижающую активность; одновременно с этим период их жизни в кровотоке значительно увеличивается. Так фьюжин с альбумином обладает периодом полужизни 54,2 чВ [Baggio et al., 2004; Dou et al., 2008], фьюжин ГПП-1 с негликозилированной формой человеческого трансферрина, которые разделяет спейсер из двух повторов PEAPTD, обладает периодом полужизни около 2 дней [Kim et al., 2010], а фьюжины ГПП-1 с эластиноподобными пептидами (ELP) имеют период полужизни до 24 часов [US 8178495].

Известны фьюжины, полученные в результате генно-инженерного слияния мутантных производных ГПП-1(7-37) и Fc фрагмента IgG4. В их составе в качестве спейсерного пептида (L), расположенного между С-концом ГПП-1 и N-концом IgG4, используют последовательность (Gly₄Ser)₃, повторенную один, полтора и два раза подряд [US 8273854]. Один из таких фьюжинов получил название дулаглютид (Dulaglutide). На его основе разработан лекарственный препарат «Трулисити» (Tonicity™) [Jimenez-Solem et al, 2010]. Дулаглютид устойчив к действию ДПП-4 и уменьшает содержание глюкозы в крови, его применяют один раз в неделю.

Стабилизации и удлинения времени жизни производных фармацевтически активных белков достигают также в результате слияния с гепарансульфат (ГС) - содержащими протеогликанами (ГСПГ) [Sommer & Rifkin, 1989; Dubrac et al., 2010; Bramono et al., 2012; Xia et al., 2012; Xu & Esko, 2014; http://sportswiki.ru/%D0%93%D0%B5%D0%BF%D0%B0%D1%80%D0%B8%D0%BD], представляющими собой белки, модифицированные линейными отрицательно заряженными (кислые) полисахаридами подкласса гликозаминогликанов [Bourin & Lindahl, 1993]. ГСПГ в обилии представлены на поверхности практически всех видов клеток животных и в составе внеклеточного матрикса [Xu & Esko, 2014]. Высокая аффинность ГС обусловлена наличием в их составе значительного количества отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп, представляющих собой сильные природные полианионы, способные к электростатическим взаимодействиям со многими белковыми и синтетическими соединениями поликатионной природы.

ГС в составе ГСПГ вовлечены в различные физиологические процессы и взаимодействуют с множеством других белков, включая белки крови, содержащие в своем составе гепарин-связывающие домены (НВ). В результате этого взаимодействия происходит стабилизация и стимулирование функциональной активности таких белков [Dubrac et al., 2010; Zhao et al., 2010; Xia et al., 2012].

На фармацевтическом рынке присутствуют несколько коммерческих препаратов, основу которых составляют агонисты рецепторов ГПП-1.

В 2005 г. в США зарегистрирован препарат из группы агонистов рецепторов ГПП-1 «Баета» (Byetta; Bristol-Myers Squibb Co., зарегистрирован в РФ). Препарат создан на основе 39-членного пептида эксенатида, имеющего 50%-ную аминокислотную гомологию с ГПП-1 человека и являющегося синтетическим вариантом гормона эксендина-4 (exendin-4) американской ящерицы ядозуба Heloderma suspectum. Эксенатид обладает природной устойчивостью к действию протеиназы ДПП-4, производится путем прямого химического синтеза и вводится подкожно 2 раза в сутки.

В 2009-2010 гг. появился препарат «Виктоза» (Victoza; Novo Nordisk; зарегистрирован в РФ) на основе лираглутида (Liraglutide). Лираглутид представляет собой относительно устойчивое к протеолизу производное ГПП-1(7-37), у которого модифицированы оба остатка лизина: остаток лизина в положении 34 заменен остатком аргинина, а к остатку лизина в положении 26 через спейсер (глутаминовая кислота) присоединена молекула жирной кислоты (С16, пальмитиновая кислота). Такая гибридная молекула способна образовывать мицелло-подобные структуры и нековалентно связываться с сывороточным альбумином в плазме крови, что обеспечивает эффект пролонгации и защиты от протеолиза. Генетически модифицированный ГПП-1 производится путем экспрессии в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Применяют препарат подкожно раз в сутки.

В 2012 году в США одобрен препарат «Байдьюрон» (Bydureon; Amylin Pharmaceuticals/Eli Lilly) на основе эксенатида, инкапсулированного в биодеградируемые микросферы сополимера молочной и гликолевой кислот, что обеспечивает его постепенное высвобождение. Применяют препарат подкожно раз в неделю.

В 2013 году одобрен препарат «Ликсумия» (Lyxumia; Sanofi; зарегистрирован в РФ), содержащий ликсисенатид (Lixisenatide), представляющий собой эксендин-4(1-39), модифицированный по С-концу путем удаления остатка пролина в положении 38 и добавления 6 остатков лизина. Ликсисенатид получают в результате химического синтеза. Режим применения препарата «Ликсумия» раз в сутки.

В апреле 2016 года одобрен препарат «Танзеум» (альбиглютид) (Tanzeum; Albiglutide; GlaxoSmithKline LLC). Этот препарат представляет собой фьюжин, в составе которого две копии ГПП-1 соединены с сывороточным альбумином человека. Каждая копия содержит аминокислотную замену Ala8Gly, опосредующую устойчивость к протеолитической инактивации под действием ДПП-4. Режим введения препарата подкожно один раз в неделю.

Дулаглютид (препарат «Трулисити») (Trulicity; Eli Lilly), одобренный в 2014 году, представляет собой ГПП-1 (7-37), ковалентно связанный с Fc-фрагментом человеческого IgG4. Этот фьюжин устойчив к действию ДПП-4. Применяют раз в неделю.

Задача заявляемой группы изобретений: расширить арсенал лекарственных средств для понижения уровня сахара в крови. Задача решена путем: 1) получения полипептида для понижения уровня сахара в крови, представляющего собой слитой белок на основе ГПП-1 человека, и соответствующего последовательности SEQ ID N1; 2) конструирования рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-12555, используемого для получения заявляемого полипептида; 3) разработки способа получения заявляемого полипептида путем автокаталитического выщепления из состава белка-предшественника, включающего последовательность рекомбинантного мутантного варианта интеина Pch PRP8 Intein Penicillium chrysogenum, имеющего размер 157 аминокислотных остатков [Elleuche et al., 2006] относящегося к семейству PRP8, содержащего замену аминокислотного остатка лейцина в положении 93 на остаток пролина, замену остатка цистеина в положении 1 на остаток аланина и не обязательно содержащий замену цистеина в положении 11 на остаток тирозина, и синтезированного в процессе культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli ВКПМ В-12555.

В процессе решения этой задачи разработана структура рекомбинантного модифицированного ГПП-1 человека (рмГПП-1), включающая, начиная с N-конца, аминокислотную последовательность мутантного ГПП-1 (7-37) человека, содержащего известную мутацию Ala8Gly, обеспечивающую устойчивость ГПП-1 к действию ДПП-4, слитую с аминокислотной последовательностью спейсерного пептида (G₄S)₄, слитого с последовательностью гепарин-связывающего пептида НВ1 (KRKKKGKGLGKKR), слитого с С-концевой последовательностью (G₄S), где G-остаток глицина, S-остаток серина, K-остаток лизина, R-остаток аргинина, L-остаток лейцина.

Заявляемый полипептид рмГПП-1 относится к классу агонистов рецепторов ГПП-1 и является продуктом генной модификации ГПП-1. Он состоит из N-концевой активной части и С-концевого вспомогательного полипептида.

Вспомогательная последовательность в составе рмГПП-1 представляет собой сложный полипептид, в составе которого последовательно соединены:

- известная аминокислотная последовательность (G₄S)₄, обладающая неупорядоченной структурой и одновременно выполняющая спейсерную функцию;

- гепарин-связывающий пептид НВ1 из состава природного белка HB-EGF человека, отвечающий за взаимодействие белка с гепарин-содержащими мишенями на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса [Thompson et al.,. 1994];

- аминокислотная последовательность G₄S на С-конце молекулы, выполняющая функцию защиты белка от действия карбоксипептидаз крови.

Все функциональные части вспомогательной последовательности в составе рмГПП-1 введены с целью стимулировать депонирование рмГПП-1 в месте инъекции.

Последовательность, состоящую из нескольких блоков (G₄S), включают в состав заявляемого полипептида ввиду ее экспериментально показанной способности обеспечивать подкожное или внутримышечное депонирование рекомбинантных белков в области введения и, как следствие, замедление их поступления в кровоток [RU 2515913]. Такую последовательность, как не обладающую иммуногенными свойствами, используют в качестве спейсерной последовательности для соединения/разделения ГПП-1 и Fc-фрагмента IgG4 в составе дулаглютида [Jimenez-Solem et al., 2010].

В состав заявляемого полипептида рмГПП-1 включен также гепарин-связывающий пептид НВ1, ранее использованный в составе рекомбинантной аспарагиназы [RU 2562166; Sannikova et al., 1016]. В составе рекомбинантного аналога ГПП-1 пептид с таким функциональным назначением использован впервые. Также впервые использован прием структурной локализации НВ1 пептида внутри последовательности (G₄S)₄-HB1-G₄S для обеспечения защиты НВ1 пептида от протеолитической деградации под действием карбоксипептидаз крови.

Для получения полипептида рмГПП-1 используют способ биосинтеза целевого полипептида в составе слитого белка-предшественника, формирующего тельца включения. С этой целью рмГПП-1 получают в составе слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, содержащего мутантный температуро-чувствительный вариант интеина Int4bPro. Уникальные свойства Int4bPro обусловлены наличием у него мутаций Cys1Ala, Cys11Tyr и Leu93Pro, первые две из которых инактивируют его способность к сплайсингу, а последняя делает его способность к формированию телец включения и C-концевому автокаталитическому процессингу зависимой от температуры.

В результате в условиях биосинтеза при температуре +37°C предшественник заявляемого полипептида - слитой белок ПРЕ-рмГПП-1, содержащий интеин Int4bPro, синтезируется в нерастворимой фракции в клетках штамма-продуцента E.coli, что обеспечивает его значительный уровень биосинтеза и позволяет упростить последующие стадии (денатурации-ренатурации, автокаталитический процессинг слитого белка и получение очищенного рмГПП-1) за счет их проведения при пониженной температуре.

Показано, что в отсутствие ключевой мутации Leu93Pro использование интеина Pch PRP8 Penicillium chrysogenum для получения рмГПП-1 приводит к биосинтезу слитого белка во фракции растворимых клеточных белков, что снижает его выход в результате преждевременного процессинга, а также значительно затрудняет процедуру его очистки.

Штамм E.coli ECR-Glp20 - продуцент слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 получают путем трансформации реципиентного штамма Escherichia coli BL21(DE3) [Novagen, ВКПМ B-10189] плазмидой pET28-Glp20, являющейся производной вектора pET28b+ [Novagen] и содержащей структурный ген слитого белка - ПРЕ- рмГПП-1 под контролем сильного промотора, узнаваемого РНК полимеразой фага Т7 E.coli.

Слитой белок ПРЕ-рмГПП-1 синтезируют в клетках штамма-продуцента в нерастворимой фракции клеточных белков, а получение рмГПП-1 из состава слитого белка осуществляют путем автокаталитического выщепления в процессе денатурации-ренатурации. Автокаталитическому расщеплению подвергается пептидная связь, предшествующая первому N-концевому остатку рмГПП-1, что позволяет получать рмГПП-1, имеющий нативный N-конец.

Для биосинтеза других производных ГПП-1 в составе слитых белков известно применение мини-интеина Ssp DnaB [Ma et al., 2010; Gao et al., 2012; Jiang et al., 2015].

Способ получения заявляемого полипептида в общем виде

Посевной материал штамма - продуцента ПРЕ-рмГПП-1 засевают и культивируют в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E.coli при температуре от 24°C до 37°C [Маниатис и др., 1984]. Культивирование осуществляют в колбах или в биореакторах (ферментерах). Индукцию синтеза целевого гибридного белка осуществляют путем внесения в среду культивирования индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозы в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 ч. В результате клетки штамма-продуцента накапливают целевой слитой белок в количестве до 40% от суммарного белка клеток.

Заявляемый полипептид получают следующим образом.

Выращенные клетки штамма-продуцента собирают центрифугированием, разрушают преимущественно с использованием механической гомогенизации, используя буфер, содержащий ингибиторы протеиназ. Слитой белок, присутствующий в нерастворимой фракции, осаждают путем центрифугирования, осадок промывают промывочным буфером, содержащим мочевину в концентрации 0,5-2 М.

Белок-предшественник ПРЕ-рмГПП-1 экстрагируют из промытого осадка в сильно щелочных условиях (50 мМ Трис, pH 12,5) в присутствии 2 М мочевины.

Для осуществления ренатурации и автокаталитического процессинга полученный экстракт разбавляют Na-фосфатным буфером pH 7,0 и инкубируют при температуре 5-25°C в течение 12-96 ч до завершения процесса автокаталитического процессинга слитого белка и образования зрелого рмГПП-1, которое устанавливают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГЭ) в денатурирующих условиях.

Полученную инкубационную смесь, осветляют с помощью центрифугирования. Осветленный раствор содержит зрелый рмГПП-1 и интеин, разделение которых осуществляют комбинацией методов хроматографии на катионообменнике, например SP-Сефарозе, и ультрафильтрации.

После стерилизующей фильтрации получают препарат рмГПП-1 с выходом 18,6% и чистотой, составляющей 97% (данные ПААГЭ в денатурирующих условиях).

Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами.

Фиг. 1 Структура фрагментов ДНК, использованных для конструирования рекомбинантной плазмиды pET28-Glp20.

Фиг. 2. Сравнение сахаропонижающей активности заявляемого полипептида и препарата сравнения «Ликсумия» при подкожном введении в зависимости от дозы и времени применения. Препараты применяли в дозе 1 мкг или 5 мкг (рмГПП -1) и 0,5 мкг (препарат «Ликсумия») за 1 ч (А), за 3 ч (Б) или за 5 ч (В) до введения глюкозы. Животным контрольной группы вместо указанных препаратов вводили физиологический раствор. Показаны средние значения содержания тестовой глюкозы в крови животных. По оси абсцисс указано время после введения глюкозы (мин), по оси ординат - концентрация глюкозы в крови животных (ммоль/л).

Фиг. 3. Сравнение сахаропонижающей активности заявляемого полипептида и препарата сравнения «Ликсумия» в зависимости от дозы и времени после применения. Препараты применяли подкожно (п/к) (А) или внутримышечно (в/м) (Б). рмГПП-1 вводили в дозе 1, 2 или 5 мкг. Препарат Ликсумия применяли в дозе 0,5 мкг. Животным контрольной группы вместо указанных препаратов вводили физиологический раствор. Показаны средние значения концентрации тестовой глюкозы в крови животных через 30 мин после ее введения. По оси абсцисс указано время после введения сравниваемых препаратов (ч), по оси ординат - концентрация глюкозы в крови животных (ммоль/л).

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pET28-Glp20

Рекомбинантную плазмиду pET28-Glp20 конструируют путем клонирования комплексного фрагмента ДНК размером 713 пар оснований, заключающего структурный ген pre-Glp20, кодирующий слитый белок ПРЕ-рмГПП-1 - предшественник заявляемого полипептида рмГПП-1, в вектор экспрессии pET-28(b)+(Novagen).

Конструирование комплексного фрагмента ДНК производят путем последовательного линейного лигирования пяти фрагментов ДНК, А, В, С, D и E (Фиг. 1), которые конструируют следующим образом:

- фрагмент «А», кодирующий структурный ген мутантного интеина int4bPRO (Cys1Ala, Cys11Tyr, Leu93Pro), получают в результате ПЦР-амплификации фрагмента ДНК плазмиды pET28b_(His)x10_IntMUT, которая представляет собой плазмиду pET-28(b)+ (Novagen), содержащую последовательность ДНК, кодирующую ген мутантного интеина (Cys1Ala, Cys11Tyr, Leu93Pro), дополненный на 3'-конец (перед стоп-кодоном) линкерной областью, кодирующей триплет Ser-Gly-Ser и заключающей сайт эндонуклеазы рестрикции BamHI для удобства последующего клонирования. Амплификацию осуществляют с использованием праймеров:

Липкие концы полученного в результате амплификации фрагмента ДНК открывают с помощью рестриктазы NcoI (локализация сайтов узнавания рестриктазы NcoI в составе праймеров амплификации указана).

- фрагмент «В», кодирующий модифицированный глюкагоноподобный пептид 1 человека, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липким концами NcoI и BamHI;

- фрагмент «С», кодирующий линкерный пептид (Gly₄Ser)₄, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BgHlII и BamHI;

- фрагмент «D», кодирующий гепарин-связывающий пептид KRKKKGKGLGKKR из состава природного белка HB-EGF человека, синтезируют искусственно в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BglII и BamHI;

- фрагмент «Е», кодирующий С-концевую аминокислотную последовательность Gly₄Ser и терминирующий кодон, искусственно синтезируют в виде двуцепочечной последовательности ДНК с липкими концами BglII и XhoI.

Результирующий комплексный фрагмент ДНК размером 713 пар нуклеотидов, имеющий липкие концы NcoI и XhoI, получают в результате последовательного лигирования указанных фрагментов ДНК.

Комплексный фрагмент ДНК заключает структурный ген слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, являющегося предшественником заявляемого полипептида, составными частями которого являются последовательность модифицированного интеина Pch PRP8 Penicillium chrysogenum (InBase, http://www.neb.com/neb/inteins.html), содержащего мутации Cys1Ala, Cys11Tyr и Leu93Pro и последовательность рекомбинантного модифицированного глюкагоноподобного пептида 1 человека рмГПП-1.

Клонирование комплексного фрагмента ДНК в вектор экспрессии рЕТ-28(b)+ производят по сайтам узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.

В результате клонирования получают рекомбинантную плазмиду pET28-Glp20, которая содержит ген слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 под контролем сильного промотора, узнаваемого РНК полимеразой фага Т7.

Пример 2. Конструирование штамма - продуцента слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, являющегося предшественником заявляемого полипептида

Штамм E.coli ECR-Glp20 - продуцент слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 получают в результате трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) [Novagen, ВКПМ В-10189] плазмидой pET28-Glp20.

Трансформацию реципиентного штамма осуществляют с применением CaCl₂-реактива [Маниатис и др., 1984]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин.

В результате трансформации получают штамм E.coli ECR-Glp20, который используют для биосинтеза слитого белка ПРЕ-рмГПП-1.

Полученный штамм E.coli ECR-Glp20 депонируют во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-12555.

Пример 3. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах с использованием индуктора-лактозы

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру. Для этого одну колонию штамма E.coli ВКПМ В-12555 засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 ч при температуре 37°C.

Выросшую культуру переносят в среду с индуктором. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (pH7) - 10; раствор 1 М сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование продолжают в течение 20 ч в тех же условиях.

Индуктором синтеза слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 является лактоза, изначально входящая в состав среды TRB.

Полученную биомассу осаждают центрифугированием в пластмассовых пробирках объемом 50 мл в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в 30 мл буфера PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают и остатки жидкости тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 12 г биомассы штамма E.coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры. Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°C.

Согласно данным анализа, выполненного методом ПААГЭ в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E.coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 4. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах с использованием индуктора-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ)

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в колбах осуществляют следующим образом. Для получения посевной культуры одну колонию штамма E.coli ВКПМ В-12555 засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин в течение 18 ч при температуре 37°C.

Выросшую посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (pH7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; NaCl - 1, канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование продолжают в тех же условиях в течение 2 ч до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀=1-2. Затем в среду вносят индуктор ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и продолжают культивирование в тех же условиях в течение 5 ч.

Полученную в результате культивирования биомассу осаждают центрифугированием в пробирках объемом 50 мл в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в 30 мл буфера PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин с охлаждением (4°C). Надосадочную жидкость сливают и ее остатки тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 3 г биомассы штамма E. coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры. Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°С.

Согласно данным анализа, выполненного методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E. coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 5. Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биореакторе

Биосинтез слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биореакторе осуществляют следующим образом. Для получения посевной культуры одну колонию штамма E. coli ВКПМ В-12555 засевают в колбу, содержащую 50 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт 0207/0-MG-L ("Springer") - 1, пептон-140 соевый (Р-140, "Amresco") - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Культуру выращивают на роторной качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 37°С до оптической плотности OD₆₀₀=1,5.

Затем 50 мл выросшей посевной культуры переносят в рабочую колбу биореактора «Applicon» ("Applicon") общим объемом 1 л, содержащую 450 мл стерильной среды следующего состава (на 1 л): дрожжевой экстракт 0207/0-MG-L ("Springer") - 24 г; пептон-140 соевый (Р-140, "Amresco") - 12 г; глюкоза - 10 г; пеногаситель А-204 ("Sigma") - 0,1 мл; сульфат аммония - 3,4 г; 1 М фосфатный буфер (рН 7) - 100 мл; раствор 1 М сульфата магния - 2 мл; канамицин - 90 мг; вода - остальное.

Культивирование ведут 3 ч до истощения уровня глюкозы в культуральной среде, используя следующие параметры ферментации: температура - 37°С; расход воздуха - 1 л/л/мин; скорость перемешивания культуры - 700 об/мин; рН=6,9±0,1 (рН-статирование культуры производят с помощью автоматической подтитровки растворами 10% H₂SO₄ и 10% аммиаком).

Далее в ферментер стерильно вносят 10 мл стерильного 50% раствора глюкозы и культивирование продолжают еще 1,5 ч. Затем в ферментер добавляют 50% раствор глицерина до конечной концентрации 5% и 25 мл 20% раствора лактозы (конечная концентрация 1%). Культивирование продолжают в течение 18-20 ч в тех же условиях.

По окончании ферментации культуру клеток штамма-продуцента центрифугируют при 4°С и 8000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают. Клеточный осадок суспедируют в буфере PBS следующего состава: 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, после чего вновь подвергают центрифугированию в тех же условиях. Надосадочную жидкость сливают и остатки жидкости тщательно удаляют с помощью вакуумного насоса.

В результате получают 60 г биомассы штамма E. coli ВКПМ В-12555 с 1 л культуры.

Полученную биомассу замораживают и хранят при температуре минус 20°С и в дальнейшем используют для выделения слитого белка ПРЕ-рмГПП-1.

Согласно данным анализа, выполненного методом ПААГЭ в денатурирующих условиях, содержание слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 в биомассе штамма E.coli ВКПМ В-12555 составляет 40% относительно суммарного белка клеток.

Пример 6. Выделение и очистка заявляемого пептида

Для выделения и очистки полипептида рмГПП-1 из фракции нерастворимых белков используют биомассу штамма E.coli ВКПМ В-12555, полученную, как описано в примере 3, или примере 4, или примере 5.

6.1. Разрушение биомассы и получение нерастворимой фракции клеточного лизата Биомассу (70 г) ресуспендируют на ледяной бане в 1 л холодного 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,137 М NaCl и 5 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). К суспензии клеток добавляют 5 мл 0,2 М раствора фенилметилсульфонилфторида (PMSF), тщательно перемешивают на диспергаторе (IKA Т18 basic ULTRA-TURRAX). Разрушение клеток производят на дезинтеграторе APV1000 (APV1000, "SPX Flow Technology") при давлении 970 бар. Проводят 4 цикла с охлаждением биомассы до 15°C между циклами.

В результате получают 1,07 л общего клеточного лизата.

6.2. Выделение нерастворимой фракции клеточного лизата

1,07 л клеточного лизата центрифугируют на центрифуге KR 25i, ("Jouan") 20 мин при 9000 об/мин и температуре 4°C. Полученный осадок (46 г) (нерастворимая фракция лизата), смешивают с 0,64 л воды марки Milli Q "(Millipore") и тщательно перемешивают до получения однородной суспензии. Суспензию центрифугируют, как сказано выше. К полученному осадку (31 г) прибавляют 0,22 л 0,02 М Трис-HCl буфера, рН 9.0, содержащего 0,005 М ЭДТА (буфер 1), перемешивают и центрифугируют, как описано выше.

6.3. Экстракция слитого белка ПРЕ-рмГПП-1 из нерастворимой фракции клеточного лизата

К осадку, полученному выше (30 г), прибавляют 0.34 л 0,05 М раствора Трис, содержащего 2 М мочевину и 0,005 М Na4ЭДТА, pH 12,5 (буфер 2), и тщательно перемешивают. Суспензию выдерживают 15 мин при 4°C и центрифугируют 20 мин при 9000 об/мин. В результате получают 0,35 л экстракта слитого белка ПРЕ-рмГПП-1. Выход этого белка на стадии составляет 85,2%

6.4. Ренатурация и процессинг слитого белка ПРЕ-рмГПП-1

Экстракт слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, полученный выше, помещают в стеклянную бутыль емкостью 20 л, прибавляют 14 л 0,02 М раствора натрия фосфата, содержащего 0,005 М ЭДТА, pH 7,0 (буфер 3), и тщательно перемешивают. Значение pH суспензии доводят до 7,0 с помощью 3 и раствора соляной кислоты. Объем суспензии увеличивают до 15 л с помощью буфера 3 и выдерживают при 4°C в течение 3 суток до завершения процессинга, которое устанавливают с помощью ПААГЭ. Смесь центрифугируют на центрифуге MISTRAL 6L с ускорением 5500 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость содержит смесь продуктов процессинга слитого белка ПРЕ-рмГПП-1, в том числе искомый пептид. Выход рмГПП-1 на стадии составляет 38,9%.

6.5. Очистка рмГПП-1 хроматографией на колонке с SP-Сефарозой (Хроматография I)

Супернатант, полученный выше (15 л), разбавляют в 2 раза равным объемом 0,02 М раствора натрия фосфата, содержащего 0,005 М ЭДТА, pH 7,0 (буфер 4) и центрифугируют на центрифуге MISTRAL 6L при 5500 об/мин в течение 15 мин.

Фильтрат (29,5 л) л наносят на колонку, содержащую 40 мл SP-Сефарозы, уравновешенной буфером 4. Элюцию осуществляют градиентом концентрации хлорида натрия (0-1 М).

Средний выход целевого белка на стадии - 68%.

6.6. Ультрафильтрация

Элюат, полученный в ходе хроматографии 1, подвергают ультрафильтрации на ячейке Stirred Cell Model 8050 ("Millipore") емкостью 0,05 л, снабженной мембраной Ultracel 3 KDa ("Millipore"). Выход рмГПП-1 на стадии составляет 91,9%

6.7. Очистка рмГПП-1 хроматографией на колонке, содержащей 20 мл SP-сефарозы (Хроматография II)

Раствор рмГПП-1, полученный на предыдущей стадии очистки, наносят на колонку, содержащую 20 мл SP-сефарозы. Элюцию осуществляют градиентом концентрации хлорида натрия (0-1 М). Выход рмГПП-1 на стадии составляет 93,9%.

6.8. Очистка рмГПП-1 методом ультрафильтрации

Раствор рмГПП-1, очищенный в ходе хроматографии II (0,04 л), помещают в ультрафильтрационную ячейку Stirred Cell Model 8050, Millipore емкостью 0,05 л, снабженную мембраной Ultracel 3 KDa ("Millipore"). Раствор концентрируют до объема 0,01 л, затем разбавляют водой марки Milli Q до объема 0,05 л и снова концентрируют при тех же условиях до объема 0,01 л. В ходе этой процедуры концентрация целевого пептида в растворе увеличивается в 4 раза, а концентрация соли уменьшается в 5 раз, достигая 0,15 М. Выход рмГПП-1 на стадии составляет 96,7%.

6.9. Стерилизующая фильтрация раствора рмГПП-1

Стерилизующую фильтрацию раствора рмГПП-1, полученного на предыдущей стадии очистки, осуществляют с помощью фильтр-насадки Millex-GV Syringe Driven Filter Unit с удерживающим размером пор 0,22 мкм ("Millipore") в ламинарном шкафу. В результате получается 0,01 л стерильного раствора рмГПП-1 с концентрацией искомого пептида 6 мг/мл. Выход на стадии составляет 99%.

Суммарно из 1 л клеточного лизата получают 60 мг рмГПП-1. Суммарный выход составляет свыше 18%, при чистоте - 97%.

Пример 7. Оценка специфической сахаропонижающей активности заявляемого полипептида рмГПП-1

Исследование проводят на здоровых мышах линии Balb/c весом 22-24 г.

Для разведения исследуемых препаратов и приготовления тестовых растворов глюкозы используют апирогенную очищенную воду (ГФ XIII.ФС.2.2.0019.15).

Тестовый раствор 20% глюкозы (D-Glucose Aristar ("BDH Chemicals"; Prod 45213) готовят следующим образом: 2 г глюкозы растворяют в апирогенной очищенной воде и доводят конечный объем раствора до 10 мл.

Раствор 20% глюкозы вводят животным внутрибрюшинно (в/бр) из расчета 10 мл на 1 кг веса.

Для введения исследуемых препаратов и тестовых растворов глюкозы используют шприцы инсулиновые U-100, 1 мл (0,33 mm (29G) X 12,7 mm) BD Micro-Fine Plus.

Для контроля содержания глюкозы в образцах крови животных используют глюкометр - Акку-Чек Актив (Accu-Chek Active; "Roche Diagnostics") и тест полоски - Акку-Чек Актив (Accu-Chek Active; "Roche Diabetes Care", 06656854).

Тестируемые препараты разводят в апирогенной очищенной воде непосредственно перед введением животным исходя из требования, чтобы объем вводимого препарата при подкожном (п/к) и внутрибрюшинном (в/бр) применении составлял 200 мкл на мышь, при внутримышечном (в/м) применении -100 мкл на животное.

При в/бр применении препараты вводят в брюхо. При п/к применении препараты вводят в холку. При в/м применении препараты вводят в мышцу бедра.

Накануне дня проведения исследования животных делят н