Гуманизированные антитела, которые распознают альфа-синуклеин

Гуманизированные антитела, которые распознают альфа-синуклеин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Для настоящей заявки испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №61/591835, поданной 27 января 2012, и предварительной заявке на патент США №61/711207, поданной 8 октября 2012, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Синуклеинопатии, включая болезни с тельцами Леви (Lewy body diseases (LBD)), характеризуются дегенерацией дофаминергической системы, моторными изменениями, когнитивными нарушениями и образованием телец Леви (LB) и/или нейритов Леви. (McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Синуклеинопатии включают болезнь Паркинсона (включая идиопатическую болезнь Паркинсона), болезнь диффузных телец Леви (Lewy Body Disease (DLBD)), также известную как деменция с тельцами Леви (Dementia with Lewy Bodies (DLB)), вариант болезни Альцгеймера с образованием телец Леви (Lewy body variant (LBV)), объединенные болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона (Parkinson disease (PD)), чисто вегетативную недостаточность и синдром Шая - Дрейджера (Shy-Drager); например, оливопонтоцеребральную атрофию, стриатонигральную дегенерацию и синдром Шая - Дрейджера. Некоторые немоторные признаки и симптомы, как полагают, являются предвестниками синуклеинопатий в продромальной фазе заболевания (т.е., пресимптоматичический, субклинический, доклинический или премоторный период). Такие ранние признаки включают в себя, например, нарушения поведения во время REM-сна (sleep behavior disorder (RBD)), потерю обоняния и запоры (Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). Заболевания, сопровождающиеся образованием телец Леви, часто являются причиной двигательных нарушений и когнитивных расстройств у пожилых людей (Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95).

[0003] Альфа-синуклеин относится к большому семейству белков, включая бета- и гамма-синуклеин и синоретин. Альфа-синуклеин экспрессируется в норме в синапсе и, как считается, отвечает за нервную пластичность, обучение и память. Некоторые исследования показали, что центральную роль в патогенезе PD играет синаптический белок альфа-синуклеин. Белок может агрегировать с образованием нерастворимых фибрилл в патологических условиях. Например, синуклеин откладывается в LB (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Мутации в гене альфа-SN ассоциированы с редкими семейными формами паркинсонизма (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). Гиперэкспрессия синуклеина у трансгенных мышей (Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) и у мух вида Drosophila (Feany et al., Nature (2000) 404:394-8) имитирует некоторые патологические аспекты болезни с тельцами Леви. Кроме того, было высказано предположение, что растворимые олигомеры синуклеина могут быть нейротоксическими (Conway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:571-576; Volles et al., J. Biochemistry (2003) 42:7871-7878). Накопление альфа-синуклеина с одинаковыми морфологическими и неврологическими изменениями у различных видов животных, таких как люди, мыши и мухи, позволяет сделать предположение о том, что именно данная молекула способствует развитию болезни с тельцами Леви.

СУЩНОСТЬ ЗАЯВЛЕННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение относится к антителам, содержащим зрелую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три определяющие комплементарность области (Complementarity Determing Region (CDR)), положение и длина которых определены в соответствии со схемой Кабата (Kabat), из SEQ ID NO:44, и по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:44, и легкую цепь, содержащую три CDR, положение и длина которых определены в соответствии со схемой Kabat, из SEQ ID NO:45, и по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:45. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO:44 и зрелая вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO:45. В некоторых антителах положение L46 (система нумерации по Кабату) может быть занято F; положение L49 (система нумерации по Кабату) может быть занято С; положение L83 (система нумерации по Кабату) может быть занято А; положение Н11 (система нумерации по Кабату) может быть занято L; положение Н28 (система нумерации по Кабату) может быть занято S; положение Н38 (система нумерации по Кабату) может быть занято К; положение Н48 (система нумерации по Кабату) может быть занято I; положение Н67 (система нумерации по Кабату) может быть занято А; положение Н69 (система нумерации по Кабату) может быть занято L; положение Н71 (система нумерации по Кабату) может быть занято А; и/или положение Н91 (система нумерации по Кабату) может быть занято F. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) может быть занято S. В некоторых из таких антител аминокислотная последовательность зрелой вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO:44 и аминокислотная последовательность зрелой вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO:45, за исключением условия, что положение L46 (система нумерации по Кабату) может быть занято L или F, и/или положение L49 (система нумерации по Кабату) может быть занято Y или С, и/или положение L83 (система нумерации по Кабату) может быть занято F или А, и/или положение Н11 (система нумерации по Кабату) может быть занято V или L, и/или положение Н28 (система нумерации по Кабату) может быть занято Т или S, и/или положение Н38 (система нумерации по Кабату) может быть занято R или К, и/или положение Н48 (система нумерации по Кабату) может быть занято М или I, и/или положение Н67 (система нумерации по Кабату) может быть занято V или А, и/или положение Н69 (система нумерации по Кабату) может быть занято М или L, и/или положение Н71 (система нумерации по Кабату) может быть занято Т или А, и/или положение Н91 (система нумерации по Кабату) может быть занято Y или F, и/или Н97 (система нумерации по Кабату) может быть занято Cor S. В некоторых из таких антител положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает Y. В некоторых из таких антител положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает L и положение Н38 (нумерация Kabat) занимает К. В некоторых из таких антител положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает V и положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R. В некоторых из таких антител положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает S, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает I, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает L, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y. В некоторых из таких антител положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает S. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает Y и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает Y и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает L, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает S, должность Н38 (система нумерации по Кабату) занимает К, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает I, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает L, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает V, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает S, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает I, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает L, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение H11 (система нумерации по Кабату) занимает V, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y и положение Н97 (нумерация Kabat) занимает С. В некоторых из таких антител положение H11 (система нумерации по Кабату) занимает V, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает S, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает I, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает L, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает S. В некоторых из таких антител положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает V, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y и положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает S. В некоторых из таких антител аминокислотная последовательность зрелой вариабельной области тяжелой цепи является иной, чем SEQ ID NO:44, и аминокислотная последовательность зрелой вариабельной области легкой цепи является иной, чем SEQ ID NO:45.

[0005] Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, содержащему гуманизированную тяжелую цепь, содержащую три CDR, положение и длина которых определены в соответствии со схемой Кабата, из SEQ ID NO:44, и гуманизированную легкую цепь, содержащую три CDR из SEQ ID NO:45, при условии, что положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, и/или положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С, и/или положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F, и/или положение Н11 (система нумерации по Кабату) занимает V, и/или положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, и/или положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, и/или положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, и/или положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, и/или положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, и/или положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, и/или положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y, и/или положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А и положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А и положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение H11 (система нумерации по Кабату) занимает V и положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R. В некоторых из таких антител положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М и положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y. В некоторых из таких антител положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С и положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С, положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F, положение H11 (система нумерации по Кабату) занимает V, Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y и Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С.

[0006] Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, содержащему зрелую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:23, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:37. В некоторых из таких антител зрелая вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, положение и длина которых определены в соответствии со схемой, из SEQ ID NO:23, и зрелая вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, положение и длина которых определены в соответствии со схемой Кабата, из SEQ ID NO:37, и положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение L46 (система нумерации по Кабату) занимает F и положение L49 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител последовательность зрелой тяжелой цепи идентична по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID NO:23 и последовательность зрелой легкой цепи идентична по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID NO:37. В некоторых из таких антител любые различия в областях CDR зрелой вариабельной области тяжелой цепи и зрелой вариабельной области легкой цепи из последовательностей SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO:60, соответственно, находятся в положениях от Н60 до Н65. У некоторых из таких антител величина K_D (константа диссоциации), характерная для антитела и альфа-синуклеина, превышает в от около 0,5 раз до 2 раз величину K_D, характерную для мышиного или химерного антитела 1Н7 и альфа-синуклеина. В некоторых из таких антител положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F или А, положение H11 (система нумерации по Кабату) занимает V, положение Н28 (система нумерации по Кабату) занимает Т, положение Н38 (система нумерации по Кабату) занимает R, положение Н48 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н67 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н69 (система нумерации по Кабату) занимает М, положение Н71 (система нумерации по Кабату) занимает А, положение Н91 (система нумерации по Кабату) занимает Y и Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F. В некоторых из таких антител положение Н97 (система нумерации по Кабату) занимает С. В некоторых из таких антител любое различие между каркасным участком вариабельной области зрелой вариабельной области тяжелой цепи и последовательностью SEQ ID NO:23 представляет собой одно или более из положения Н11 (система нумерации по Кабату), занимаемого V, положения Н28 (система нумерации по Кабату), занимаемого Т, положения Н38 (система нумерации по Кабату), занимаемого R, положения Н48 (система нумерации по Кабату), занимаемого М, положения Н69 (система нумерации по Кабату), занимаемого М, и положения Н91 (система нумерации по Кабату), занимаемого Y. В некоторых из таких антител любое различие между каркасным участком вариабельной области зрелой вариабельной области легкой цепи и последовательностью SEQ ID NO:37 заключается в том, что положение L83 (система нумерации по Кабату) занимает F или А. В некоторых из таких антител зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:23, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:37.

[0007] В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:44, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:19, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:21, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:23, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:25, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:27, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:45, 33, 35, 37 или 39.

[0008] В любом из упомянутых выше антител зрелая вариабельная область тяжелой цепи может быть слита с константной областью тяжелой цепи и зрелая константная область легкой цепи может быть слита с константной областью легкой цепи.

[0009] В любом из упомянутых выше антител константная область тяжелой цепи может представлять собой мутантную форму природной константной области человека, которая хуже связывается с рецептором Fcγ по сравнению с природной константной областью человека.

[0010] В любом из упомянутых выше антител константная область тяжелой цепи может представлять собой изотип IgG1 человека. В некоторых антителах аллотип представляет собой G1m3. В некоторых антителах аллотип представляет собой G1m1.

[0011] В некоторых антителах константная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:52, при условии, что С-концевой остаток лизина может быть опущен. В некоторых антителах константная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:49. В некоторых антителах зрелая вариабельная область тяжелой цепи слита с константной областью тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:52, при условии, что С-концевой остаток лизина может быть опущен, и зрелая константная область легкой цепи слита с константной областью легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, определенную последовательностью SEQ ID NO:49. В некоторых антителах зрелая легкая цепь содержит последовательность SEQ ID NO:53 и зрелая тяжелая цепь содержит последовательность SEQ ID NO:56.

[0012] Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей любую из вышеупомянутых зрелых вариабельных областей тяжелой цепи и/или любую из вышеупомянутых зрелых вариабельных областей зрелой легкой цепи, например, SEQ ID NO:18, 20, 22, 24, 26, 32, 34, 36 или 38.

[0013] Настоящее изобретение дополнительно относится к клетке-хозяину, содержащей вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот, описанных выше.

[0014] Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей любое из вышеуказанных антител.

[0015] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения пациента с болезнью телец Леви или имеющего риск развития данного заболевания, включающему эффективную схему введения пациенту любого из вышеуказанных антител. Согласно некоторым способам, болезнь представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам, у пациента подавляется снижение когнитивной функции. Согласно некоторым способам, уменьшаются агрегаты альфа-синуклеина в нейритных бляшках и/или в аксонах. Согласно некоторым способам, у пациента уменьшается нейритная дистрофия. Согласно некоторым способам, сохраняется синаптическая и/или дендритная плотность. Согласно некоторым способам, способ сохраняет у пациента синаптофизин и/или МАР2.

[0016] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу уменьшения образования телец Леви у пациента с болезнью телец Леви или имеющего риск развития данного заболевания, включающему введение пациенту эффективного количества любого из вышеупомянутых антител. Согласно некоторым способам, болезнь представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам, у пациента подавляется снижение когнитивной функции. Согласно некоторым способам, агрегаты альфа-синуклеина в нейритных бляшках и/или в аксонах уменьшаются. Согласно некоторым способам, у пациента уменьшается нейритная дистрофия. Согласно некоторым способам, сохраняется синаптическая и/или дендритная плотность. Согласно некоторым способам, способ сохраняет у пациента синаптофизин и/или МАР2.

[0017] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу ингибирования агрегации синуклеина или растворения телец Леви или агрегатов синуклеина у пациента с болезнью телец Леви или имеющего риск развития данного заболевания, включающему введение пациенту эффективного количества любого из вышеупомянутых антител. Согласно некоторым способам, болезнь представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам, у пациента подавляется снижение когнитивной функции. Согласно некоторым способам, агрегаты альфа-синуклеина в нейритных бляшках и/или в аксонах уменьшаются. Согласно некоторым способам, у пациента уменьшается нейритная дистрофия. Согласно некоторым способам, сохраняется синаптическая и/или дендритная плотность. Согласно некоторым способам, способ сохраняет у пациента синаптофизин и/или МАР2.

[0018] Настоящее изобретение дополнительно относится к способам определения телец Леви у больного с болезнью телец Леви или имеющего риск развития данного заболевания, включающим введение пациенту эффективного количества любого из вышеупомянутых антител, причем антитело связывается с тельцами Леви и связанное антитело обнаруживают. Согласно некоторым способам, болезнь представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам, антитело метят.

[0019] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения антитела, включающему культивирование клеток, трансформированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела, так что клетка секретирует антитело; и очистку антитела из среды для культивирования клеток; причем антитело представляет собой любое из антител, описанных выше.

[0020] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения клеточной линии, продуцирующей антитело, включающему введение вектора, кодирующего тяжелые и легкие цепи антитела, и селектируемого маркера в клетки; разращивание клеток в условиях для отбора клеток, имеющих повышенное количество копий вектора; отделение отдельных клеток от отобранной клетки; и сохранение клеток, клонированных из одной клетки, отобранной на основе выхода антитела; где антитело представляет собой любое из антител, описанных выше. Некоторые из таких способов дополнительно содержат разращивание клеток в селективных условиях и скрининг с целью отбора клеточных линий, экспрессирующих в природных условиях и секретирующих по меньшей мере 100 мг/л/10⁶ клеток/24 часа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0021] На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей m1H7 с четырьмя вариантами зрелой вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи 1Н7. ВАС02037 (SEQ ID NO:42) представляет собой последовательность акцептора V_H человека. Последовательности CDR, определенные по Кабату, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.

[0022] На фиг. 2 показано выравнивание аминокислотных последовательностей m1H7 с четырьмя вариантами зрелой вариабельной области гуманизированной легкой цепи 1Н7. AAY33358 (SEQ ID NO:43) представляет собой последовательность акцептора V_L человека. Последовательности CDR, определенные по Кабату, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.

[0023] На фиг. 3 А-С приведен кинетический анализ Biacore связывания мышиного 1Н7 (а), химерного 1Н7 (В) и гуманизированного 1Н7 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, соответственно.

[0024] На фиг. 4 А-С приведены кинетические параметры связывания (ForteBio) для гуманизированного 1Н7 (Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) и химерного 1H7.

[0025] На фиг. 5 показаны результаты воздействия пассивной иммунотерапии с 1Н7 на производительность памяти в тесте с водным лабиринтом Морриса.

[0026] На фиг. 6 показаны результаты воздействия пассивной иммунотерапии с 1Н7 на скорость и ошибки в тесте с круглой балкой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0027] SEQ ID NO:1 представляет собой природную аминокислотную последовательность человеческого альфа-синуклеина дикого типа.

[0028] SEQ ID NO:2 представляет собой домен неамилоидного компонента (non-amyloid component (NAC)) альфа-синуклеина, по сообщению Jensen et al. (Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; GenBank, номер доступа S56746).

[0029] SEQ ID NO:3 представляет собой домен неамилоидного компонента (NAC) альфа-синуклеина, по сообщению Uéda et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993).

[0030] SEQ ID NO:4 представляет собой вариабельную нуклеотидную последовательность тяжелой цепи мышиного антитела 1Н7 (m1H7).

[0031] SEQ ID NO:5 представляет собой вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи m1H7.

[0032] SEQ ID NO:6 представляет собой вариабельную нуклеотидную последовательность легкой цепи m1H7.

[0033] SEQ ID NO:7 представляет собой вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи m1H7.

[0034] SEQ ID NO:8 представляет собой вариабельную нуклеотидную последовательность зрелой тяжелой цепи m1H7.

[0035] SEQ ID NO:9 представляет собой вариабельную аминокислотную последовательность зрелой тяжелой цепи mlH7.

[0036] SEQ ID NO:10 представляет собой вариабельную нуклеотидную последовательность зрелой легкой цепи m1H7.

[0037] SEQ ID NO:11 представляет собой вариабельную аминокислотную последовательность зрелой легкой цепи m1H7.

[0038] SEQ ID NO:12 представляет собой CDR1 тяжелой цепи из m1H7 (определение по Kabat).

[0039] SEQ ID NO:13 представляет собой CDR2 тяжелой цепи из m1H7 (определение по Kabat).

[0040] SEQ ID NO:14 представляет собой CDR3 тяжелой цепи из m1H7 (определение по Kabat).

[0041] SEQ ID NO:15 представляет собой CDR1 легкой цепи из m1H7 (определение по Kabat)

[0042] SEQ ID NO:16 представляет собой CDR2 легкой цепи из m1H7 (определение по Kabat).

[0043] SEQ ID NO:17 представляет собой CDR3 легкой цепи из m1H7 (определение по Kabat).

[0044] SEQ ID NO:18 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VHv1.

[0045] SEQ ID NO:19 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VHv1.

[0046] SEQ ID NO:20 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VHv2.

[0047] SEQ ID NO:21 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VHv2.

[0048] SEQ ID NO:22 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VHv3.

[0049] SEQ ID NO:23 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VHv3.

[0050] SEQ ID NO:24 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VHv4.

[0051] SEQ ID NO:25 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VHv4.

[0052] SEQ ID NO:26 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VHv5.

[0053] SEQ ID NO:27 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VHv5.

[0054] SEQ ID NO:28 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VH.

[0055] SEQ ID NO:29 представляет собой аминокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VH.

[0056] SEQ ID NO:30 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VH.

[0057] SEQ ID NO:31 представляет собой аминокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VH.

[0058] SEQ ID NO:32 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VLv1.

[0059] SEQ ID NO:33 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VLv1.

[0060] SEQ ID NO:34 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VLv2.

[0061] SEQ ID NO:35 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VLv2.

[0062] SEQ ID NO:36 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность Hu1H7VLv3.

[0063] SEQ ID NO:37 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VLv3.

[0064] SEQ ID NO:39 представляет собой аминокислотную последовательность Hu1H7VLv4.

[0065] SEQ ID NO:40 представляет собой нуклеиновокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VL.

[0066] SEQ ID NO:41 представляет собой аминокислотную последовательность сигнального пептида Hu1H7VL.

[0067] SEQ ID NO:42 представляет собой аминокислотную последовательность акцептора человека ВАС02037 (GI-21670055), которая используется для каркасного участка тяжелой цепи.

[0068] SEQ ID NO:43 представляет собой аминокислотную последовательность акцептора человека AAY33358 (GI-63102905), которая используется для каркасного участка легкой цепи.

[0069] SEQ ID NO:44 представляет собой последовательность Hu1H7VH, не имеющую обратную мутацию или мутацию в CDR.

[0070] SEQ ID NO:45 представляет собой последовательность Hu1H7VL, не имеющую обратную мутацию или мутацию в CDR.

[0071] SEQ ID NO:46 представляет собой последовательность для альтернативных вариантов Hu1H7VH.

[0072] SEQ ID NO:47 представляет собой последовательность для альтернативных вариантов Hu1H7VL.

[0073] SEQ ID NO:48 представляет собой последовательность для альтернативных вариантов CDR3 Hu1H7VH.

[0074] SEQ ID NO:49 представляет собой константную область легкой цепи Hu1H7 (с аргинином) (общую для v1-v4).

[0075] SEQ ID NO:50 представляет собой константную область тяжелой цепи Hu1H7 (IgG1; общую для v1-v5).

[0076] SEQ ID NO:51 представляет собой константную область легкой цепи Hu1H7 (без аргинина) (общую для v1-v4).

[0077] SEQ ID NO:52 представляет собой константную область тяжелой цепи Hu1H7 (аллотип G1m3).

[0078] SEQ ID NO:53 представляет собой версию 3 легкой цепи Hu1H7 (вариабельная область+константная область с аргинином).

[0079] SEQ ID NO:54 представляет собой версию 3 легкой цепи Hu1H7 (вариабельная область+константная область без аргинина).

[0080] SEQ ID NO:54 представляет собой версию 3 тяжелой цепи Hu1H7 (вариабельная область+константная область).

[0081] SEQ ID NO:56 представляет собой версию 3 тяжелой цепи Hu1H7 (вариабельная область+константная область; аллотип G1m3).

[0082] SEQ ID NO:57 представляет собой константную область тяжелой цепи Hu1H7 (IgG2).

[0083] SEQ ID NO:58 представляет собой константную область тяжелой цепи Hu1H7 (аллотип G1m1).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0084] Моноклональные антитела, как правило, предоставляются в выделенной форме. Это означает, что антитело является, как правило, по меньшей мере на 50% мас./мас. очищенным от белков и других макромолекул после его продукции или очистки, но не исключает возможность того, что моноклональное антитело объединяют с избытком фармацевтически приемлемого носителя(ей) или другого носителя, предназначенного для облегчения его применения. Иногда моноклональные антитела являются по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95 или 99% мас./мас. очищенными от белков и других макромолекул после продукции или очистки.

[0085] Специфическое связывание моноклонального антитела с его целевым антигеном означает сродство, составляющее по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1. Детектируемое специфическое связывание больше по величине и отличаемо от неспецифического связывания, которое происходит по меньшей мере с одной неродственной мишенью. Специфическое связывание может возникать в результате образования связей между отдельными функциональными группами или определенного пространственного расположения (например, по типу "замок и ключ"), тогда как неспецифическое связывание является обычно результатом действия сил Ван-дер-Ваальса. Однако, специфическое связывание не обязательно означает, что моноклональное антитело связывается с одной и только одной мишенью.

[0086] Основная структурная единица антитела представляет собой тетрамер из субъединиц. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). Амино-концевой участок каждой цепи включает вариабельную область, составляющую примерно от 100 до 110 или более аминокислот, в первую очередь, ответственную за распознавание антигена. Данная вариабельная область первоначально экспрессируется связанной с отщепляемым сигнальным пептидом. Вариабельную область без сигнального пептида иногда называют зрелой вариабельной областью. Так, например, зрелая вариабельная область легкой цепи означает вариабельную область легкой цепи без сигнального пептида легкой цепи. Карбокси-концевой участок каждой цепи определяет константную область, ответственную, главным образом, за эффекторную функцию.

[0087] Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены областью "J", состоящей из около 12 или более аминокислот, с тяжелой цепью, также включающей область "D", состоящую из около 10 или более аминокислот. (Смотри для общего представления Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).

[0088] Зрелые вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей образуют сайт связывания антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два сайта связывания являются одинаковыми. Все цепи имеют одинаковую общую структуру из относительно консервативных каркасных участков (framework regions (FR)), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющие комплементарность области или CDR (complementarity determining region). Последовательности CDR из двух цепей каждой пары выровнены каркасными участками, обладающими способностью связываться со специфическим эпитопом. От N-конца к С-концу, как легкие, так и тяжелые цепи содержат домены FR1, C