Комбинированное применение ловушек gdf и активаторов рецепторов эритропоэтина для повышения содержания эритроцитов

Комбинированное применение ловушек gdf и активаторов рецепторов эритропоэтина для повышения содержания эритроцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Зрелая красная клетка крови или эритроцит ответственна за транспорт кислорода в системе кровообращения позвоночных. Эритроциты содержат высокие концентрации гемоглобина, белка, который связывает кислород в легких при относительно высоком парциальном давлении кислорода (pO₂), и доставляет кислород к частям организма с относительно низким pO₂.

Зрелые эритроциты продуцируются плюрипотентными гематопоэтическими стволовыми клетками в процессе, называемом эритропоэзом. Постнатальный эритропоэз происходит главным образом в костном мозге и в красной пульпе селезенки. Координированное действие различных сигнальных путей регулирует баланс пролиферации, дифференциации, выживания и гибели клеток. В нормальных условиях эритроциты продуцируются со скоростью, которая поддерживает постоянную массу эритроцитов в организме, и продукция может повышаться или уменьшаться в ответ на различные стимулы, в том числе повышенное или пониженное напряжение кислорода или тканевую потребность. Процесс эритропоэза начинается с образования коммитированных клеток-предшественников линии дифференциации и проходит серию определенных типов клеток-предшественников. Конечные стадии эритропоэза происходят по мере того как ретикулоциты высвобождаются в кровоток и утрачивают их митохондрии и рибосомы, в то же время приобретая морфологию зрелого эритроцита. Повышенный уровень ретикулоцитов или повышенное соотношение ретикулоцитов:эритроцитов в крови указывает на повышенную скорость продукции эритроцитов.

Хорошо известно, что эритропоэтин (EPO) является наиболее значимым положительным регулятором постнатального эритропоэза у позвоночных. EPO регулирует компенсаторный эритропоэтический ответ на сниженное напряжение кислорода в тканях (гипоксию) и низкие уровни эритроцитов или низкие уровни гемоглобина. У людей повышенные уровни EPO способствуют образованию эритроцитов путем стимуляции образования эритроидных клеток-предшественников в костном мозге и селезенке. У мышей, EPO усиливает эритропоэз главным образом в селезенке.

Воздействия EPO опосредуются рецептором на клеточной поверхности, относящимся к суперсемейству цитокиновых рецепторов. Ген рецептора EPO человека кодирует трансмембранный белок из 483 аминокислот, тогда как считается, что активный рецептор EPO существует в виде мультимерного комплекса даже в отсутствие лиганда (см. патент США № 6319499). Клонированный полноразмерный рецептор EPO, экспрессированный в клетках млекопитающих, связывает EPO со сродством, аналогичным сродству нативного рецептора на эритроидных клетках-предшественниках. Связывание EPO с его рецептором вызывает конформационное изменение, приводящее к активации рецептора и биологическим эффектам, включая повышенную пролиферацию незрелых эритробластов, повышенную дифференциацию незрелых эритробластов и уменьшенный апоптоз эритроидных клеток-предшественников (Liboi et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11351-11355; Koury et al., 1990, Science 248:378-381).

Различные формы рекомбинантного EPO используются врачами для повышения уровней эритроцитов при разнообразных клинических ситуациях и, в частности, для лечения анемии. Анемия представляет собой хорошо изученное состояние, характеризуемое более низкими, чем в норме, уровнями гемоглобина или эритроцитов в крови. В некоторых случаях, анемия вызвана первичным расстройством продукции или стабильности эритроцитов. Чаще, анемия является вторичной в отношении заболеваний других систем (Weatherall & Provan (2000) Lancet 355, 1169-1175). Анемия может возникнуть в результате пониженной скорости продукции или повышенной скорости разрушения эритроцитов или потерей эритроцитов вследствие кровотечения. Анемия может возникнуть в результате различных расстройств, к которым относится, например, хроническая почечная недостаточность, химиотерапия, миелодиспластический синдром, ревматоидный артрит и трансплантация костного мозга.

Лечение EPO обычно приводит к повышению содержания гемоглобинов примерно на 1-3 г/дкл у здоровых людей в течение нескольких недель. При введении больным с анемией, эта схема лечения часто позволяет существенно повысить уровни гемоглобина и эритроцитов и приводит к улучшению качества жизни и продлевает жизнь больному. EPO не всегда эффективен, и многие индивиды устойчивы даже к его высоким дозам (Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 43-50). Более чем у 50% пациентов, страдающих злокачественными заболеваниями, имеется неадекватная реакция на EPO, приблизительно у 10% пациентов с тяжелой стадией болезни почек наблюдается пониженная реакция на EPO (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 15, 1218-1234; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, 3412-3425), и менее чем 10% пациентов с миелодиспластическим синдромом благоприятно реагируют на лечение EPO (Estey (2003) Curr Opin Hematol 10, 60-67). При наличии некоторых факторов, в том числе воспаление, дефицит железа и витаминов, нарушенный диализ, токсическое воздействие алюминия и гиперпаратиреоз, можно прогнозировать слабую реакцию на лечение. Молекулярные механизмы устойчивости к EPO пока неясны. Недавние доказательства свидетельствуют о том, что более высокие дозы EPO могут быть связаны с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, ростом опухоли и смертности пациентов некоторых популяций (Krapf et al., 2009, Clin J Am Soc Nephrol 4:470-480; Glaspy, 2009, Annu Rev Med 60:181-192). Поэтому было рекомендовано введение терапевтических соединений на основе EPO (средства, стимулирующие эритропоэтин, ESA) в самой низкой дозе, достаточной для того, чтобы исключить необходимость трансфузий эритроцитов (Jelkmann et al., 2008, Crit Rev Oncol. Hematol 67:39-61).

Таким образом, задачей настоящего описания являются альтернативные способы повышения уровней эритроцитов у пациентов, которые смогли бы обеспечить возможность применения сниженных доз активаторов рецепторов эритропоэтина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Частично, описание демонстрирует, что ловушки GDF могут использоваться в комбинации (например, вводиться в одно и то же время или в различное время, но в целом таким образом, чтобы достичь перекрывающих фармакологических эффектов) с активаторами рецепторов EPO для повышения уровней эритроцитов (эритропоэза) или лечения анемии у пациентов. Частично, в описание показано, что ловушка GDF может вводиться в комбинации с активатором рецептора EPO для синергического повышения образования эритроцитов у пациента. Таким образом, эффект такого комбинированного лечения может быть значительно выше, чем сумма эффектов ловушки GDF и активатора рецептора EPO при введении их отдельно в соответствующих дозах. В определенных вариантах осуществления, такой синергизм может быть эффективным, поскольку он обеспечивает получение заданных уровней эритроцитов, при использовании более низких доз активатора рецептора EPO, таким образом, избегая возможных побочных эффектов или других проблем, связанных с более высокими уровнями активации рецептора EPO.

Активатор рецептора EPO может стимулировать эритропоэз прямым контактом и активацией рецептора EPO. В определенных вариантах осуществления, активатор рецептора EPO представляет собой соединение из класса соединений на основе последовательности длиной 165 аминокислотных остатков нативного EPO и в целом известных как агенты, стимулирующие эритропоэз (ESA), примерами которых являются эпоэтин альфа, эпоэтин бета, эпоэтин дельта и эпоэтин омега. В других вариантах осуществления, ESA включают синтетические белки EPO (SEP) и производные EPO с непептидными модификациями, которые придают желательные фармакокинетические свойства (более длинный период полувыведения из циркуляции), примерами которых являются дарбепоэтин альфа и метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин бета. В определенных вариантах осуществления, активатор рецептора EPO может представлять собой агонист рецептора EPO, который не содержит полипептидную основную цепь EPO, или в целом не классифицируется как ESA. К таким агонистам рецепторов EPO могут относиться, без ограничения, пептидные и непептидные миметики EPO, агонистические антитела, нацеливающие на рецептор EPO, слитые белки, содержащие домен миметика EPO и ограниченные агонисты рецептора эритропоэтина продолжительного действия (EREDLA).

В определенных вариантах осуществления, активатор рецептора EPO может стимулировать эритропоэз косвенно, без контакта с самим рецептором EPO, путем усиления продукции эндогенного EPO. Например, индуцируемые гипоксией транскрипционные факторы (HIF) представляют собой эндогенные стимуляторы генной экспрессии EPO, которые подавлены (дестабилизированы) в нормоксических условиях клеточными регуляторными механизмами. Отчасти, изобретение относится к повышению эритропоэза у пациента с помощью комбинированного лечения ловушкой GDF и косвенным активатором рецептора EPO со свойствами, стабилизирующими HIF (индуцируемый гипоксией фактор), таким как ингибитор пропил-гидроксилазы.

Варианты полипептидов ActRIIB, обладающие значительно сниженным сродством к активину (например, активину A и/или активину B) по сравнению с другими лигандами ActRIIB, такими как GDF11 и/или миостатин, называются ловушками GDF. Пока нет других указаний, варианты ActRIIB, описанные в настоящей заявке, представляют собой ловушки GDF. В частности, в описании изобретения показано, что ловушка GDF, которая представляет собой растворимую форму полипептида ActRIIB с кислым остатком в положении 79 последовательности SEQ ID NO:1, при введении in vivo, повышает содержание эритроцитов в крови. Поэтому, в определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам применения ловушек GDF для повышения содержания эритроцитов и гемоглобина у пациентов и для лечения расстройств, связанных с низким содержанием эритроцитов и гемоглобина у таких пациентов. Как описано в заявке на патент США № 12/012652, который включен в настоящее описание в качестве ссылки, ловушки GDF могут использоваться для повышения мышечной массы и снижения жировой массы.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к ловушкам GDF, которые представляют собой варианты полипептидов ActRIIB, имеющие амино- и карбокси-концевые усечения и изменения в последовательностях. Необязательно, конструирование ловушек GDF по изобретению для предпочтительного антагонизма в отношении одного или нескольких лигандов рецепторов ActRIIB, таких как GDF8 (также называемого миостатином), GDF11, Nodal и BMP7 (также называемого OP-1). Примеры ловушек GDF включают набор вариантов, полученных из ActRIIB, которые обладают значительно пониженным сродством к активину. Такие варианты проявляют желаемые эффекты на эритроциты, в то же время, снижая воздействия на другие ткани. Примеры таких вариантов включают варианты с кислой аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой, D, или глютаминовой кислотой, E) в положении, соответствующем положению 79 последовательности SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления полипептид-ловушка GDF содержит аминокислотную последовательность, которая содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, 26, 28, 29, 32, 37 или 38, полипептидов, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны любому из указанных выше.

В определенных аспектах изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим ловушку GDF, которая связывается с лигандом ActRIIB, например, GDF8, GDF11, активином (например, активином B), BMP7 или Nodal, и фармацевтически приемлемый носитель. Необязательно, ловушка GDF связывается с лигандом ActRIIB со значением Kd, равным менее чем 10 мкм, менее чем 1 мкмоль, менее чем 100 наномоль, менее чем 10 наномоль или менее чем 1 наномоль. Необязательно, ловушка GDF ингибирует передачу сигнала ActRIIB, например, события внутриклеточной передачи сигналов, запускаемой лигандом ActRIIB. Ловушка GDF, которая может использоваться в таком препарате, может представлять собой любую ловушку GDF, описанную в настоящей заявке, в том числе, например, ловушки GDF с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 или 40, или ловушки GDF с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 или 40, или ловушки GDF с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 или 40, где положение, соответствующее L79 в последовательности SEQ ID NO:1, представляет собой кислую аминокислоту. Предпочтительная ловушка GDF, которая может использоваться в таком препарате состоит из, или по существу состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26. Ловушка GDF может содержать функциональный фрагмент природного полипептида ActRIIB, такой как фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 20 или 30 аминокислот последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2, 3, 7, 11, 26, 28, 29, 32, 37, 38 или 40, или последовательности SEQ ID NO:2, лишенной C-концевых 1, 2, 3, 4, 5 или 10-15 аминокислот, и лишенной 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот на N-конце. Предпочтительный полипептид содержит усечение относительно SEQ ID NO: 2 или 40 из 2-5 аминокислот на N-конце и не более 3 аминокислот на C-конце. Ловушка GDF может содержать одно или более изменений в аминокислотной последовательности полипептида ActRIIB (например, в лиганд-связывающем домене) относительно природного полипептида ActRIIB. Изменение аминокислотной последовательности может, например, изменить гликозилирование полипептида при продукции в клетке млекопитающего, насекомого или другой эукариотической клетке, или изменить протеолитическое расщепление полипептида по сравнению с природным полипептидом ActRIIB.

Ловушка GDF может представлять собой слитый белок, который имеет, в качестве одного домена, полипептид ActRIIB (например, лиганд-связывающий домен ActRIIB с одним или более изменениями последовательности), и один или более дополнительных доменов, которые придают желательное свойство, такое как улучшенная фармакокинетика, более простая очистка, нацеливание на определенные ткани и т.д. Например, домен слитого белка может улучшить одну или более характеристик устойчивости in vivo, периода полувыведения in vivo, захвата/введения, локализации или распределения в тканях, образования белковых комплексов, мультимеризации слитого белка и/или очистки. Слитые белки ловушки GDF могут содержать домен Fc-фрагмента иммуноглобулина (дикого типа или мутантные) или сывороточный альбумин. В определенных вариантах осуществления, слитая ловушка GDF содержит относительно неструктурированный линкер, расположенный между доменом Fc-фрагмента и внеклеточным доменом ActRIIB. Неструктурированный линкер может соответствовать неструктурированной области длиной приблизительно 15 аминокислот на C-конце внеклеточного домена ActRIIB («хвосте»), или он может представлять собой искусственную последовательность длиной 3-5, 15, 20, 30, 50 или более аминокислот, которые относительно свободны от вторичной структуры. Линкер может быть обогащен остатками глицина или пролина и, поэтому, может содержать, например, повторяющиеся последовательности треонина/серина и глицинов (например, синглеты или повторы TG₄ (SEQ ID NO:13) или SG₄ (SEQ ID NO:14)) или серии трех глицинов. Слитый белок может содержать подпоследовательность очистки, такую как эпитопный таг, таг FLAG, последовательность полигистидина и слитый GST. В определенных вариантах осуществления, слитая ловушка GDF содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность может представлять собой лидерную последовательность ActRIIB или гетерологичную лидерную последовательность. В определенных вариантах осуществления, лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA). В одном из вариантов осуществления, слитый белок ловушки GDF содержит аминокислотную последовательность, представленную формулой A-B-C. Часть B представляет собой усеченный на N- и C-конце полипептид ActRIIB, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 25-131 последовательности SEQ ID NO: 2 или 40. Части A и C могут независимо представлять собой ноль, одну или более одной аминокислоты, а части и A, и C являются гетерологичными для B. Части A и/или C могут быть присоединены к части B через линкерную последовательность.

Необязательно, ловушка GDF содержит вариант полипептида ActRIIB, имеющий один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из: гликозилированной аминокислоты, ПЭГилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной частью, аминокислоты, конъюгированной с органическим агентом, используемом для получения производных. Фармацевтический препарат может также содержать одно или более дополнительных соединений, таких как соединение, которое используется для лечения расстройства, связанного с ActRIIB. Предпочтительно, фармацевтический препарат по существу лишен пирогенов. В целом, предпочтительно, чтобы ловушка GDF была экспрессирована в линии клеток млекопитающих, которая подходящим образом опосредует природное гликозилирование ловушки GDF с тем, чтобы уменьшить вероятность неблагоприятного иммунного ответа у пациента. Успешно использовались линии клеток человека и CHO, и ожидается, что могут использоваться другие привычные векторы экспрессии млекопитающих.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к упакованным фармацевтическим средствам, содержащим фармацевтический препарат, описанный в настоящей заявке, и вкладыш с описанием применения для повышения содержания эритроцитов у человека.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к ловушкам GDF, которые представляют собой растворимые полипептиды ActRIIB, содержащие измененный лиганд-связывающий (например, связывающий GDF8) домен. Ловушки GDF с измененными лиганд-связывающими доменами могут содержать, например, одну или несколько мутаций в таких аминокислотных остатках как E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 и F101 ActRIIB человека (нумерация указана относительно SEQ ID NO:1). Необязательно наличие измененного лиганд-связывающего домена может повысить селективность к лиганду, такому как GDF8/GDF11, по сравнению с лиганд-связывающим доменом дикого типа рецептора ActRIIB. Для иллюстрации, в настоящем описании показано, что такие мутации повышают селективность измененного лиганд-связывающего домена к GDF11 (и, следовательно, предположительно, GDF8) по сравнению с активином: K74Y, K74F, K74I, L79D, L79E и D80I. Следующие мутации обладают противоположным эффектом, повышая соотношение связывания активина по сравнению с GDF11: D54A, K55A, L79A и F82A. Общая активность связывания (GDF11 и активина) может быть повышена за счет введения «хвостовой» области или, предположительно, неструктурированной линкерной области, а также благодаря мутации K74A. Другие мутации, которые вызывают общее снижение сродства связывания лиганда, включают: R40A, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M и D80N. Мутации могут комбинироваться для достижения желательных эффектов. Например, многие мутации, которые влияют на соотношение связывания GDF11:Активина, оказывают общий негативный эффект на связывание лигандов, и поэтому, они могут комбинироваться с мутациями, которые в целом увеличивают связывание лигандов для получения улучшенного связывающего белка с селективностью в отношении лиганда. В иллюстративном варианте осуществления, ловушка GDF представляет собой полипептид ActRIIB, содержащий мутацию L79D или L79E, возможно, в сочетании с дополнительными аминокислотными заменами, добавлениями или делециями.

Необязательно, ловушка GDF, содержащая измененный лиганд-связывающий домен, возможно, имеет отношение значения K_d для связывания активина к значению K_d для связывания GDF8, которое по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз больше относительно отношения для лиганд-связывающего домена дикого типа. Необязательно, ловушка GDF, содержащая измененный лиганд-связывающий домен, возможно, имеет отношение значения IC₅₀ для ингибирования активина к значению IC₅₀ для ингибирования GDF8/GDF11, то есть, по меньшей мере в 2, 5, 10 или даже в 100 раз больше относительно лиганд-связывающего домена дикого типа ActRIIB. Необязательно, ловушка GDF, содержащая измененный лиганд-связывающий домен, ингибирует GDF8/GDF11 со значением IC₅₀ по меньшей мере в 2, 5, 10, или даже в 100 раз больше, чем значение IC₅₀ для ингибирования активина. Такие ловушки GDF могут представлять собой слитые белки, которые содержат домен Fc-фрагмента иммуноглобулина (или дикого типа, или мутантного). В некоторых случаях, растворимые ловушки GDF по изобретению представляют собой антагонисты (ингибиторы) GDF8 и/или GDF11.

Возможны и другие типы ловушек GDF, такие как нижеследующие. Слитый белок ловушки GDF, содержащий часть, полученную из последовательности ActRIIB SEQ ID NO: 1 или 39, и вторую полипептидную часть, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 21-29 последовательности SEQ ID NO:1 или 39 (возможно, начинающейся у аминокислот 22-25 последовательности SEQ ID NO:1 или 39), и заканчивающейся у любой из аминокислот 109-134 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и где слитый белок ловушки GDF ингибирует передачу сигналов активином, миостатином и/или GDF11 в анализе на основе клеток. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где белок, полученный из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-29 последовательности SEQ ID NO:1 или 39 (возможно, начинающейся у аминокислот 22-25 последовательности SEQ ID NO:1 или 39), и заканчивающейся у любой из аминокислот 109-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-24 последовательности SEQ ID NO:1 или 39 (возможно, начинающейся у аминокислот 22-25 последовательности SEQ ID NO:1 или 39), заканчивающейся у любой из аминокислот 109-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 21-24 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 109-134 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-24 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 118-133 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 21-24 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 118-134 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-24 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 128-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-24 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 128-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 21-29 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 118-134 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-29 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 118-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 21-29 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39, и заканчивающейся у любой из аминокислот 128-134 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Описанный выше слитый белок ловушки GDF, где часть, полученная из ActRIIB, соответствует последовательности, начинающейся у любой из аминокислот 20-29 последовательности SEQ ID NO:1, и заканчивающейся у любой из аминокислот 128-133 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. К удивлению, конструкции, начинающиеся у аминокислот 22-25 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39, имеют уровни активности, большие чем белки, имеющие полный внеклеточный домен ActRIIB человека. В предпочтительном варианте осуществления слитый белок ловушки GDF содержит, по существу состоит из или состоит из аминокислотной последовательности, начинающейся в аминокислотном положении 25 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и заканчивающейся в аминокислотном положении 131 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39. В других предпочтительных вариантах осуществления полипептид-ловушка GDF состоит из, или по существу состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, 26, 28, 29, 32, 37 или 38. Любой из указанных выше слитых белков ловушки GDF могут быть получены в виде гомодимера. Любые из указанных выше слитых белков ловушки GDF могут иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область из тяжелой цепи IgG, такую как Fc-домен. Любые из указанных выше слитых белков ловушки GDF могут содержать кислую аминокислоту в положении, соответствующем положению 79 последовательности SEQ ID NO:1, возможно, в комбинации с одним или более дополнительных аминокислотных замен, делеций или вставок относительно SEQ ID NO:1.

Возможны и другие белки ловушки GDF, такие как нижеприведенные. Белок ловушки GDF, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот 29-109 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, где положение, соответствующее 64 последовательности SEQ ID NO:1 представляет собой R или K, и где белок ловушки GDF ингибирует передачу сигналов активином, миостатином и/или GDF11 в анализе на клеточной основе. Указанный выше белок ловушки GDF, где по меньшей мере одно изменение относительно последовательности SEQ ID NO: 1 или 39 расположено вне лиганд-связывающего кармана. Указанный выше белок ловушки GDF, где по меньшей мере одно изменение относительно последовательности SEQ ID NO:1 или 39 представляет собой консервативное изменение, расположенное внутри лиганд-связывающего кармана. Указанный выше белок ловушки GDF, где по меньшей мере одно изменение относительно последовательности SEQ ID NO:1 или 39 представляет собой изменение в одном или более положений, выбранных из группы, состоящей из K74, R40, Q53, K55, F82 и L79. Указанный выше белок ловушки GDF, где белок содержит по меньшей мере одну последовательность N-X-S/T в положении, отличном от эндогенной последовательности N-X-S/T ActRIIB, и в положении вне лиганд-связывающего кармана.

Возможны и другие ловушки GDF, такие как нижеприведенные. Белок ловушки GDF, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот 29-109 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и где белок содержит по меньшей мере одну последовательность N-X-S/T в положении, отличном от эндогенной последовательности N-X-S/T ActRIIB, и в положении, вне лиганд-связывающего кармана. Указанную выше ловушку GDF, где белок ловушки GDF содержит N в положении 24 последовательности SEQ ID NO: 1 или 39, и S или T в положении, соответствующем положению 26 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и где ловушка GDF ингибирует передачу сигналов активином, миостатином и/или GDF11 в анализе на клеточной основе. Указанная выше ловушка GDF, где белок ловушки GDF содержит R или K в положении, соответствующем положению 64 последовательности SEQ ID NO:1 или 39. Указанная выше ловушка GDF, где белок ActRIIB содержит D или E в положении, соответствующем положению 79 последовательности SEQ ID NO:1 или 39, и где ловушка GDF ингибирует передачу сигналов активином, миостатином и/или GDF11 в анализе на клеточной основе. Указанная выше ловушка GDF, где по меньшей мере одно изменение в отношении последовательности SEQ ID NO: 1 или 39 представляет собой консервативное изменение, расположенное внутри лиганд-связывающего кармана. Указанная выше ловушка GDF, где по меньшей мере одно изменение в отношении последовательности SEQ ID NO:1 или 39 представляет собой изменение в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из K74, R40, Q53, K55, F82 и L79. Указанная выше ловушка GDF, где белок представляет собой слитый белок, кроме того, включающий гетерологичную часть. Любой из указанных выше слитых белков ловушки GDF может быть получен в виде гомодимера. Любой из указанных выше слитых белков ловушки GDF может иметь гетерологичную часть, которая содержит константную область из тяжелой цепи IgG, такой как Fc-домен.

В определенных аспектах, изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептид-ловушку GDF. Выделенный полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность растворимого полипептида-ловушки GDF, такую как описано выше. Например, выделенная нуклеиновая кислота может содержать последовательность, кодирующую ловушку GDF, содержащую внеклеточный домен (например, лиганд-связывающий домен) полипептида ActRIIB, имеющего одну или более изменений в последовательности, и последовательность, которая бы кодировала часть или весь трансмембранный домен, и/или цитоплазматический домен полипептида ActRIIB, но стоп-кодон, расположенный внутри трансмембранного домена или цитоплазматического домена, или расположенный между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом или цитоплазматическим доменом. Например, выделенный полинуклеотид, кодирующий ловушку GDF, может содержать полноразмерную полинуклеотидную последовательность ActRIIB, такую как SEQ ID NO:4, имеющую одно или более изменений, или частично усеченный вариант, причем указанный выделенный полинуклеотид, кроме того, содержит кодон окончания транскрипции по меньшей мере за 600 нуклеотидов до 3’-конца, или расположенный иначе таким образом, чтобы трансляция полинуклеотида привела к получению внеклеточного домена, возможно, слитого с усеченной частью полноразмерного ActRIIB. Описанные в настоящей заявке нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором для экспрессии, и настоящее изобретение относится к клеткам, трансформированным такими рекомбинантными полинуклеотидами. Предпочтительно, клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка CHO.

В определенных аспектах, изобретение относится к способам получения полипептида-ловушки GDF. Такой способ может предусматривать экспрессирование любой из описанных в настоящей заявке нуклеиновых кислот (например, SEQ ID NO: 5, 25, 27, 30 или 31) в подходящей клетке, такой как клетка яичника китайского хомячка (CHO). Такой способ может включать: a) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии полипептида-ловушки GDF, где указанная клетка трансформируется экспрессирующей конструкцией ловушки GDF; и b) выделение экспрессированного таким образом полипептида-ловушки GDF. Полипептиды-ловушки GDF могут быть выделены в виде неочищенных, частично очищенных или высокоочищенных фракций с использованием любой из хорошо известных методик получения белка из клеточных культур.

В определенных аспектах, полипептид-ловушка GDF по настоящему изобретению может использоваться в способе стимуляции продукции эритроцитов или повышения содержания эритроцитов у индивида. В определенных вариантах осуществления, изобретение относится к способам лечения расстройства, связанного с низкими количествами эритроцитов или низкими уровнями гемоглобина (например, анемии), или для стимуляции продукции эритроцитов у пациентов, при необходимости. Способ может предусматривать введение индивиду эффективного количества полипептида-ловушки GDF. В определенных аспектах, изобретение относится к применению полипептидов-ловушек GDF для получения лекарственного средства для лечения расстройства или состояния по настоящему изобретению.

В определенных аспектах, изобретение относится к способам введения пациенту полипептида-ловушки GDF. Частично, в описании продемонстрировано, что полипептиды-ловушки GDF могут использоваться для повышения содержания эритроцитов и уровней гемоглобина. Полипептиды-ловушки GDF могут также использоваться для лечения или профилактики других видов терапевтического применения, таких как стимуляция мышечного роста. В определенных случаях, при введении полипептида-ловушки GDF для стимуляции роста мышц, может быть желателен контроль воздействий на эритроциты во время введения полипептида-ловушки GDF или определение или коррекция дозировки полипептида-ловушки GDF для снижения нежелательных воздействий на эритроциты. Например, повышение содержания эритроцитов, гемоглобина или уровней гематокрита может вызвать повышение артериального давления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Материалы патента или заявки содержат по меньшей мере один исполненный в цвете чертеж. Экземпляры данного патента или патентной заявки с цветным чертежом (чертежами) может быть по запросу и оплате необходимой пошлины представлен в Патентное Ведомство.

На фиг. 1 показано выравнивание внеклеточных доменов ActRIIA человека (SEQ ID NO:15) и ActRIIB человека (SEQ ID NO:2) с остатками, которые установлены в настоящем описании на основании комбинированного анализа множественных кристаллических структур ActRIIB и ActRIIA для непосредственного контакта с лигандом (лиганд-связывающим карманом), указанным прямоугольными рамками.

На фиг. 2 показано выравнивание множества последовательностей белков ActRIIB различных позвоночных и ActRIIA человека (SEQ ID NO:16-23).

На фиг. 3 показана полная аминокислотная последовательность ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (SEQ ID NO:11) ловушки GDF, включающая лидерную последовательность TPA (двойное подчеркивание), внеклеточный домен ActRIIB (остатки 20-134 в SEQ ID NO:1; подчеркнуты), и домен hFc. Аспартат, замещенный в положении 79 в нативной последовательности, подчеркнут двойной линией и выделен, как и глицин, выявленный секвенированием как N-концевой остаток в зрелом слитом белке.

На фиг. 4 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая ActRIIB(L79D 20-134)-hFc. SEQ ID NO: 25 соответствует смысловой нити, а SEQ ID NO: 33 соответствует антисмысловой нити. Лидер TPA (нуклеотиды 1-66) подчеркнут двойной линией, а внеклеточный домен ActRIIB (нуклеотиды 76-420) подчеркнут одинарной линией.

На фиг. 5 показана полная аминокислотная последовательность усеченного ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (SEQ ID NO:26) ловушки GDF, включающая лидер TPA (подчеркнут двойной линией), внеклеточный домен усеченного ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO:1; подчеркнута), и домен hFc. Аспартат, замещенный в положении 79 нативной последовательности, подчеркнут двойной линией и выделен, как и глутамат, выявленный секвенированием как N-концевой остаток в зрелом слитом белке.

На фиг. 6 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO:27 соответствует смысловой нити, а SEQ ID NO: 34 соответствует антисмысловой нити. Лидер TPA (нуклеотиды 1-66) подчеркнут двойной линией, а внеклеточный домен усеченного ActRIIB (нуклеотиды 76-396) подчеркнут одинарной линией. Также показана аминокислотная последовательность для внеклеточного домена ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO:1).

На фиг. 7 показана аминокислотная последовательность усеченного ActRIIB(L79D 25-131)-hFc ловушки GDF без лидера (SEQ ID NO:28). Внеклеточный домен усеченного ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO:1) подчеркнут. Аспартат, замещенный в положении 79 нативной последовательности, подчеркнут двойной линий, как и глутамат, выявленный секвенированием как N-концевой остаток в зрелом слитом белке.

На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность усеченного ActRIIB(L79D 25-131) ловушки GDF без лидера, домена hFc и линкера (SEQ ID NO:29). Аспартат, замещенный в положении 79 нативной последовательности подчеркнут и выделен, как и глутамат, выявленный секвенированием как N-концевой остаток в зрелом слитом белке.

На фиг. 9 показана альтернативная нуклеотидная последовательность, кодирующая ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO:30 соответствует смысловой нити, и SEQ ID NO:35 соответствует антисмысловой нити. Лидер TPA (нуклеотиды 1-66) подчеркнут двойной линией, внеклеточный домен усеченного ActRIIB (нуклеотиды 76-396) подчеркнут одинарной линией, и замещения в нуклеотидной последовательности дикого типа внеклеточного домена подчеркнуты двойной линией и выделены (сравнить с SEQ ID NO:27, фиг. 6). Показана также аминокислотная последовательность внеклеточного домена ActRIIB (остатки 25-131 в SEQ ID NO:1).

На фиг. 10 показаны нуклеотиды 76-396 (SEQ ID NO:31) альтернативной нуклеотидной последовател