Анализ респираторной инфекции

Анализ респираторной инфекции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к продуктам нуклеиновых кислот и к соответствующим способам скрининга биологического образца на присутствие вызывающего инфекцию микроорганизма.

Респираторные инфекции являются одними из наиболее частых случаев заболеваний во всем мире (см. Murray and Lopez (1997) - Lancet, 349, страницы 1269-1276). Индивидуумы с нарушениями (сердечная, легочная, иммунная системы), пожилые люди и дети имеют риск развития серьезных осложнений. В течение длительного времени в прошлом быструю лабораторную диагностику респираторных инфекций проводили с помощью набора анализов для multiplex ПЦР в реальном времени (RT) Taqman. Однако существенной проблемой, связанной с мультиплексным подходом, является необходимость параллельного получения, проведения и мониторинга анализов скрининга. Это дает нежелательную финансовую нагрузку, так как каждый проводимый анализ приводит к удвоению потребляемых затрат по сравнению с одиночным анализом и создает дополнительные рабочие расходы в виде износа дорогостоящего оборудования, используемого для проведения этих анализов. Указанный мультиплексный подход также требует дополнительного времени и рабочей силы, связанных с проведением мультиплексных анализов.

Таким образом, существует необходимость в более эффективной системе скрининга.

Настоящее изобретение решает одну или несколько указанных выше проблем благодаря простому одноступенчатому анализу (т.е. формата singleplex) для выявления присутствия или отсутствия множества вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в общем выделенном образце.

Более подробно, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия одного или нескольких по меньшей мере из шести вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в образце или обнаружения отсутствия указанных микроорганизмов в указанном образце, где способ предусматривает:

A) нанесение образца на тест-карту, где указанная тест-карта содержит шесть отдельных лунок:

1) первую лунку, которая включает первую пробу, где первая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GGCAATGCWG (SEQ ID NO:1);

2) вторую лунку, которая включает вторую пробу, где вторая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GAYGGGACCR (SEQ ID NO:2);

3) третью лунку, которая включает третью пробу, где третья проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CACCAGACAC (SEQ ID NO:3);

4) четвертую лунку, которая включает четвертую пробу, где четвертая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GGTCATTGGR (SEQ ID NO:4);

5) пятую лунку, которая включает пятую пробу, где пятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CACTGGGCAC (SEQ ID NO:5);

6) шестую лунку, которая включает шестую пробу, где шестая проба содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты RGTGTTCATT (SEQ ID NO:6);

B) приведение нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, в контакт с пробами в указанных лунках;

C) обнаружение присутствия комплекса связанных нуклеиновых кислот, где образец нуклеиновой кислоты связан с одной или несколькими из указанных проб;

D) где присутствие комплекса связанных нуклеиновых кислот подтверждает, что нуклеиновая кислота одной или нескольких из указанных шести вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов присутствует в этом образце, и где отсутствие комплекса связанных нуклеиновых кислот подтверждает, что нуклеиновая кислота всех указанных шести вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствует в образце.

Одной ключевой проблемой известного уровня техники, которая рассматривалась заявителем, является получение надежного набора проб, которые являются взаимосовместимыми (т.е. сохраняют точную специфичность связывания), в условиях одного набора для анализа (т.е. формата singleplex). Одним конкретным преимуществом, связанным со способом настоящего изобретения, является скорость. В качестве примера, способ по изобретению обычно длится 2,5 часа, предпочтительно, 2 или 1,5 часа. В отличие от этого, существующие анализы multiplex обычно занимают по меньшей мере 4-5 часов, обычно, по меньшей мере 5 часов.

Другим преимуществом, связанным с анализом uniplex (aka singleplex) способом по настоящему изобретению является повышенная чувствительность, которая позволяет проводить количественное обнаружение микроорганизмов (например, вирусной и/или бактериальной нагрузки) в образце, наряду с просто определением присутствия или отсутствия конкретного патогенна в образце.

Микроорганизмы (например, вирусы и бактерии) в этом образце могут быть подвергнуты точному измерению нагрузки для каждого мишеневого микроорганизма. Это позволяет проводить количественное определение конкретной нагрузки каждого микроорганизма в образце. Преимущественно, этот признак по изобретению позволяет определять преобладающий микроорганизм(ы) в образцах, в которых присутствуют множество микроорганизмов. Например, способ анализа unipex позволяет специалисту определить преобладающий вирус в образцах, в которых присутствует множество вирусов. Кроме того, способ по изобретению обеспечивает количественное обнаружение вирусов в образцах на протяжении времени, который, в частности, может использоваться при наличии флуктуации в вирусной нагрузке конкретных вирусов.

Кроме того, в то время как в существующих системах используется гибридизация на мембране, способ анализа по изобретению проводят в закрытой (например, в стерильной) системе, таким образом уменьшая вероятность загрязнения, что дает дополнительное преимущество.

Пробы 1-6, соответственно, обеспечивают чувствительное обнаружение:

1) Респираторно-синцитиального вируса (RSV A & B);

2) Риновирусов;

3) Метапневмовируса человека (hMPV);

4) Гриппа В (Flu B Quad);

5) Гриппа A (Flu A CDC DC); и

6) Подтипа Н5 гриппа A (H5 FRET)

Таким образом, указанный выше способ обеспечивает быстрый анализ для обнаружения любого одного или нескольких указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в формате анализа uniplex (aka singleplex). Аналогично, указанный способ обеспечивает быстрый анализ для подтверждения, что все из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствуют в пробе в общем анализе (uniplex). Анализ uniplex обозначает, что каждый из анализов множественных индивидуальных лунок проводят при одинаковых условиях анализа и/или по существу в одно и то же время. При использовании, единственный образец наносят на тест-карту, и этот образец затем засевается в каждую тест-лунку.

В одном из вариантов осуществления в способе используют тест-карту, содержащую одну или несколько дополнительных лунок, и соответствующие одну или несколько дополнительных проб, выбранных из:

7) седьмой лунки, которая включает седьмую пробу, где седьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TTTCCAGGGG (SEQ ID NO:7);

8) восьмой лунки, которая включает восьмую пробу, где восьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CCGCAAGTCA (SEQ ID NO:8);

9) девятой лунки, которая включает девятую пробу, где девятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TTGCCTGGTG (SEQ ID NO:9);

10) десятой лунки, которая включает десятую пробу, где десятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TAARGTAGGT (SEQ ID NO:10);

11) одиннадцатой лунки, которая включает одиннадцатую пробу, где одиннадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CGGCRTCATY (SEQ ID NO:11);

12) двенадцатой лунки, которая включает двенадцатую пробу, где двенадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты ATARTGRTAA (SEQ ID NO:12);

13) тринадцатой лунки, которая включает тринадцатую пробу, где тринадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты ATAGTAATAA (SEQ ID NO:13); где используют те же самые стадии способа, которые описаны в настоящем документе выше.

В одном из вариантов осуществления, тест-карта может включать две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более или все семь из указанных от седьмой до тринадцатой лунок (плюс соответствующие пробы).

Пробы 7-13 обеспечивают чувствительное обнаружение:

7) Вируса парагриппа типа 1 человека (HPIV 1);

8) Вируса парагриппа типа 2 человека (HPIV 2);

9) Вируса парагриппа типа 3 человека (HPIV 3);

10) Вируса парагриппа типа 4 человека (HPIV 4);

11) Human Adenoviruses #2;

12) Вируса A H1 2009, Tamiflu чувствительного; и

13) Вируса A H1 2009, Tamiflu устойчивого.

Таким образом, вышеуказанный способ обеспечивает быстрый анализ для обнаружения любого одного или нескольких указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в анализе формата uniplex. Аналогично, указанный способ обеспечивает быстрый анализ для подтверждения, что все из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствуют в образце из анализа формата uniplex.

В одном из вариантов осуществления, в способе используют тест-карту, содержащую одну или нескольких дополнительных лунок, и соответствующие одну или несколько дополнительных проб, выбранных из:

14) четырнадцатой лунки, которая включает четырнадцатую пробу, где четырнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TACTGTGACA (SEQ ID NO:14);

15) пятнадцатой лунки, которая включает пятнадцатую пробу, где пятнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты YRGCGGAACC (SEQ ID NO:15);

16) шестнадцатой лунки, которая включает шестнадцатую пробу, где шестнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TAACGAGTGT (SEQ ID NO:16);

17) семнадцатой лунки, которая включает семнадцатую пробу, где семнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CGAATGAATG (SEQ ID NO:17);

18) восемнадцатой лунки, которая включает восемнадцатую пробу, где восемнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты YTCTAAGCAT (SEQ ID NO:18);

19) девятнадцатой лунки, которая включает девятнадцатую пробу, где девятнадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TTCTAAGCAT (SEQ ID NO:19);

20) двадцатой лунки, которая включает двадцатую пробу, где двадцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GAGTAYCTSA (SEQ ID NO:20);

21) двадцать первой лунки, которая включает двадцать первую пробу, где двадцать первая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты ACTGCATCCG (SEQ ID NO:21);

22) двадцать второй лунки, которая включает двадцать вторую пробу, где двадцать вторая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TGTCACCTCT (SEQ ID NO:22);

23) двадцать третьей лунки, которая включает двадцать третью пробу, где двадцать третья проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты AGTGTGTYAC (SEQ ID NO:23);

24) двадцать четвертой лунки, которая включает двадцать четвертую пробу, где двадцать четвертая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GAATTTCTGG (SEQ ID NO:24);

25) двадцать пятой лунки, которая включает двадцать пятую пробу, где двадцать пятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TTGCCGGATG (SEQ ID NO:25);

26) двадцать шестой лунки, которая включает двадцать шестую пробу, где двадцать шестая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CAGCAACTGT (SEQ ID NO:26);

27) двадцать седьмой лунки, которая включает двадцать седьмую пробу, где двадцать седьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TGCTCCAGAA (SEQ ID NO:27);

28) двадцать восьмой лунки, которая включает двадцать восьмую пробу, где двадцать восьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты TNGCCATTGY (SEQ ID NO:28);

29) двадцать девятой лунки, которая включает двадцать девятую пробу, где двадцать девятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GTYCCGTGRA (SEQ ID NO:29);

30) тридцатой лунки, которая включает тридцатую пробу, где тридцатая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CTGGARTCTG (SEQ ID NO:30);

31) тридцать первой лунки, которая включает тридцать первую пробу, где тридцать первая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CRACTGTGTC (SEQ ID NO:31);

32) тридцать второй лунки, которая включает тридцать вторую пробу, где тридцать вторая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GTGTCACCGC (SEQ ID NO:32);

33) тридцать третьей лунки, которая включает тридцать третью пробу, где тридцать третья проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GAYGGRACCR (SEQ ID NO:33);

где используют те же самые стадии способа, какие описаны в настоящем документе выше.

В одном из вариантов осуществления, эта тест-карта может включать две или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более, семь или более, восемь или более, девять или более, десять или более, одиннадцать или более, двенадцать или более, тринадцать или более, четырнадцать или более, пятнадцать или более, шестнадцать или более, семнадцать или более, восемнадцать или более, девятнадцать или более или все двадцать из указанных от четырнадцати до тридцати лунок (плюс соответствующие пробы). Указанные одна или более от четырнадцати до тридцати лунок (плюс соответствующие пробы) могут быть использованы в комбинации или альтернативно с указанными одной или более от семи до тринадцати лунок (плюс соответствующие пробы).

Пробы 14-30, соответственно, делают возможным чувствительное обнаружение:

14) Респираторно-синцитиального вируса (RSV №2); (RSV №3);

15) Энтеровирусов;

16) Коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) (SARS);

17) Коронавируса Группы 2 OC43 и HKU1 (GP2 OC43/HKU1);

18) Коронавируса Группы 1 NL63 (GP1 NL63);

19) Коронавируса Группы 1 229E (GP1 229E);

20) Аденовирусов человека;

21) Бокавируса;

22) Гриппа А (Flu A Quad);

23) Гриппа А H1 2009 (H1 sw 2009);

24) Гриппа А N1 2009 (N1 CFI);

25) Гриппа А H1 сезонного (H1 сезонного CFI);

26) Гриппа A H3 сезонного (H3 сезонного CFI);

27) Гриппа A H5 (H5 CFI);

28) Гриппа A H7 (H7);

29) Гриппа A H9 (H9 a);

30) Гриппа A H9 (H9 b);

31) Паравируса типа 1 человека (HPIV 1 №2);

32) Паравируса типа 3 человека (HPIV 1 №3); и

33) Риновирусов №2.

Таким образом, вышеуказанный способ обеспечивает быстрый анализ одного или нескольких из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в анализе с форматом uniplex. Аналогично, указанный способ обеспечивает быстрый анализ для подтверждения того, что все из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствуют в образце в анализе формата uniplex.

В одном из вариантов осуществления, в способе используют тест-карту, содержащую одну или несколько дополнительных лунок, и соответствующие одну или несколько дополнительных проб, где указанные дополнительные пробы связываются с этиологическими факторами и (таким образом, обнаруживают) этиологические факторы, атипичной пневмонии. Пациенты, инфицированные атипичными бактериальными респираторными инфекциями, не отвечают на обычные антибиотики, что зачастую обостряют их состояния и дренируя источники медико-санитарной помощи. Общепринятая лабораторная идентификация этих организмов, связанная с атипичной бактериальной пневмонией, может быть трудной, медленной и дорогостоящей, и, таким образом, настоящее изобретение обеспечивает разительное улучшение в этом смысле. Таким образом, в этом варианте осуществления, одну или несколько дополнительных проб используют для обнаружения одного или нескольких из: Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumonia и Coxiella burnettii. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, способ по изобретению использует тест-карту, содержащую одну или несколько дополнительных лунок, и соответствующие одну или несколько дополнительных проб, выбранных из:

34) тридцать четвертой лунки, которая включает тридцать четвертую пробу, где тридцать четвертая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты AATTGGCTTT (SEQ ID NO:34);

35) тридцать пятой лунки, которая включает тридцать пятую пробу, где тридцать пятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GGAGAGTGTG (SEQ ID NO:35);

36) тридцать шестой лунки, которая включает тридцать шестую пробу, где тридцать шестая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CAGACGCTGG (SEQ ID NO:36);

37) тридцать седьмой лунки, которая включает тридцать седьмую пробу, где тридцать седьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CGGCGTTTAT (SEQ ID NO:37);

38) тридцать восьмой лунки, которая включает тридцать восьмую пробу, где тридцать восьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CTTGGTGTGA (SEQ ID NO:38);

39) тридцать девятой лунки, которая включает тридцать девятую пробу, где тридцать девятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CTTGGTGTGA (SEQ ID NO:39);

где используют те же самые стадии способа, которые описаны в описании выше.

В одном из вариантов осуществления, тест-карта может включать две или более, три или более, четыре или более, пять или более или все шесть из указанных от тридцать четвертой до тридцать девятой лунок (плюс соответствующие пробы). Указанные одна или несколько от тридцать четвертой до тридцать девятой лунок (плюс соответствующие пробы) могут быть использованы в комбинации или альтернативно от четырнадцатой до тридцать третьей лунок (плюс соответствующие пробы) и/или в комбинации или альтернативно с указанными одной или несколькими от седьмой до тринадцатой лунок (плюс соответствующими пробами).

Пробы 34-39 делают возможным чувствительное обнаружение:

34) Legionella pneumophilia;

35) Mycoplasma pneumoniae;

36) Chlamydiophilia pneumoniae;

37) Coxiella burnetii;

38) Chlamydiophilia psittaci и

39) Chlamydiophilia abortus.

Таким образом, вышеуказанный способ обеспечивает быстрый анализ для обнаружения любых одного или нескольких из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в анализе с форматом uniplex. Аналогично, указанный способ обеспечивает быстрый анализ для подтверждения того, что все из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствуют в образце в анализе формата uniplex.

В одном из вариантов осуществления, способ по настоящему изобретению использует тест-карту, содержащую одну или несколько дополнительных ‘контрольных’ лунок, и соответствующие одну или несколько ‘контрольных’ проб, выбранных из:

40) сороковой лунки, которая включает сороковую пробу, где сороковая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты AGATCAAGGT (SEQ ID NO:40);

41) сорок первой лунки, которая включает сорок первую пробу, где сорок первая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты ACCTGAAGGC (SEQ ID NO:41),

где используют такие же стадии способа, какие описаны в настоящем документе выше.

В одном из вариантов осуществления, тест-карта может включать одну или обе из указанных сороковой или сорок первой лунок (плюс соответствующих проб). Могут быть использованы альтернативные ‘контрольная’ проба/пробы-мишени. Указанные ‘контрольные’ пробы могут быть использованы в комбинации с любыми из описанных в настоящем документе выше вариантов осуществления.

Контрольные пробы 40-41, соответственно, делают возможным чувствительное обнаружение:

40) Бактериофага MS2 (MS2 IC) Escherichia coli и

41) Гена рибонуклеазы P человека (RNAse P).

Присутствие одной или нескольких ‘контрольных’ проб делает возможным (по существу одновременно) подтверждение того, что этот анализ выполняется нормально. Например, в образец вводят бактериофаг MS2 Escherichia coli (MS2 IC) перед экстракцией нуклеиновых кислот. Обнаружение нуклеиновой кислоты бактериофага MS2 в образце с использованием зонда-бактериофага MS2 позволяет подтверждать различные стадии, участвующие в этом анализе uniplex, выполняемые успешно. Бактериофаг MS2 просто обеспечивает один пример внутреннего контроля, хотя со способом по настоящему изобретению может быть использована любая подходящая альтернатива.

В одном из вариантов осуществления тест-карта включает пробу, которая позволяет обнаружение гена рибонуклеазы Р (RNAse P) человека. Присутствие нуклеиновой кислоты РНКазы P человека в образце указывает на то, что был собран биологический материал человека. Альтернативно, могут быть использованы другие маркеры генома человека в качестве проб-мишеней, и их соответствующие пробы могут быть включены на тест-карте.

Способ анализа по настоящему изобретению может включать стадию амплификации нуклеиновой кислоты, и в этом случае каждую пробу по настоящему изобретению используют в комбинации с парой (прямого и обратного) праймеров - указанную пару праймеров кооперируют для амплификации участка нуклеиновой кислоты-мишени, который затем распознается этой пробой (связыванием с ним) во время стадии обнаружения. В качестве примера, праймеры 1f (прямой) и 1r (обратный) кооперируют с первой пробой, и с использованием всех трех последовательностей нуклеиновой кислоты включают в первую лунку. То же самое выполняют с праймерами 2f и 2r в комбинации со второй пробой (во второй лунке) - праймерами 41f и 41r в комбинации с сорок первой пробой (в сорок первой лунке).

В одном из вариантов осуществления, этот способ использует тест-карту, содержащую одну или несколько дополнительных лунок и соответствующие одну или несколько дополнительных проб, выбранных из:

42) сорок второй лунки, которая включает сорок вторую пробу, где сорок вторая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GTGCARTTYG (SEQ ID NO:338);

43) сорок третьей лунки, которая включает сорок третью пробу, где сорок третья проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты YGCYTCGGAR (SEQ ID NO:339);

44) сорок четвертой лунки, которая включает сорок четвертую пробу, где сорок четвертая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CTTGTGGANC (SEQ ID NO:340);

45) сорок пятой лунки, которая включает сорок пятую пробу, где сорок пятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты CATTCCATTC (SEQ ID NO:341);

46) сорок шестой лунки, которая включает сорок шестую пробу, где сорок шестая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты WGTGTTTGCA (SEQ ID NO:342);

47) сорок седьмой лунки, которая включает сорок седьмую пробу, где сорок седьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты ACCACGGGAT (SEQ ID NO:343);

48) сорок восьмой лунки, которая включает сорок восьмую пробу, где сорок восьмая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GTCCTCGCTG (SEQ ID NO:344);

49) сорок девятой лунки, которая включает сорок девятую пробу, где сорок девятая проба имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты GCCCGCGACG (SEQ ID NO:345);

где используют такие же стадии способа, какие описаны в настоящем документе выше.

Пробы 42-49, соответственно, делают возможным чувствительное обнаружение:

42) Аденовируса;

43) Аденовируса ADP17;

44) Парапоксвируса;

45) Вируса гриппа B;

46) Вируса гриппа B;

47) Mycobacterium tuberculosis;

48) Mycobacterium tuberculosis;

49) Микобактерий (в целом).

Таким образом, вышеописанный способ обеспечивает быстрый анализ для обнаружения любых одного или нескольких из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов в анализе с форматом uniplex. Аналогично, указанный способ обеспечивает быстрый анализ для подтверждения того, что все из указанных вызывающих респираторную инфекцию микроорганизмов отсутствуют в образце в анализе формата uniplex.

Праймер 1f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AAGCWGGATTCTACC (SEQ ID NO:42), и праймер 1r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TCCCATTATGCCTAG (SEQ ID NO:43).

Праймер 2f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:44), и праймер 2r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO:45).

Праймер 3f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATCCCACAAAAYCAG (SEQ ID NO:46), и праймер 3r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CTACACATAATAARA (SEQ ID NO:47).

Праймер 4f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности GATGTCCATCAAGCT (SEQ ID NO:48), и праймер 4r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TARAGCAATAGGTCT (SEQ ID NO:49).

Праймер 5f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CCTGTCACCTCTGAC (SEQ ID NO:50), и праймер 5r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TGGACAAAKCGTCTA (SEQ ID NO:51).

Праймер 6f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности GGRTACGCTGCAGAC (SEQ ID NO:52), и праймер 6r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AGTCCAGACATCTAG (SEQ ID NO:53).

Праймер 7f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATACTCAGAGACCCA (SEQ ID NO:54), и праймер 7r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATAYTGTTGCATAGC (SEQ ID NO:55).

Праймер 8f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TGCTCCTGATCARCC (SEQ ID NO:56), и праймер 8r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TCCCACCATRGCATA (SEQ ID NO:57).

Праймер 9f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TATCCTCAGAGATCC (SEQ ID NO:58), и праймер 9r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ACATACTGTTGCATG (SEQ ID NO:59).

Праймер 10f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CTTGTACAGGARATG (SEQ ID NO:60) и праймер 6r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TCCCACCATRGCATA (SEQ ID NO:61).

Праймер 11f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности RGTSGAYCCCATGGA (SEQ ID NO:62), и праймер 11r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SGGYGTRCGSAGGTA (SEQ ID NO:63).

Праймер 12f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:64), и праймер 12r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CCCTGCAYACACATG (SEQ ID NO:65).

Праймер 13f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AGTCAAATCAGTCGA (SEQ ID NO:66), и праймер 13r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CCCTGCAYACACATG (SEQ ID NO:67).

Праймер 14f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CATCTGYTTAACAAG (SEQ ID NO:68) или GGARACATACGTGAA (SEQ ID NO:260), и праймер 14r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AAGAIACTGATCCTG (SEQ ID NO:69) или ATTGTAYTGAACAGC (SEQ ID NO:261).

Праймер 15f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CCTGAATGYGGCTAA (SEQ ID NO:70), и праймер 15r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CGGACACCCAAAGTA (SEQ ID NO:71).

Праймер 16f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TTATCCAAAATGTGA (SEQ ID NO:72), и праймер 16r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности GCATCACCGGATGAT (SEQ ID NO:73).

Праймер 17f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TTATCCTAARTGTGA (SEQ ID NO:74), и праймер 17r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATCACCACTRCTAGT (SEQ ID NO:75).

Праймер 18f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TTATCCCAAATGTGA (SEQ ID NO:76), и праймер 18r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности AGCRTCACCAGAAGT (SEQ ID NO:77).

Праймер 19f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CTATCCTAAGTGTGA (SEQ ID NO:78), и праймер 19r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TGCATCACCAGAAGT (SEQ ID NO:79).

Праймер 20f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности KCNTACATGCACATC (SEQ ID NO:80), и праймер 20r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности GGGRTTYCTRAACTT (SEQ ID NO:81).

Праймер 21f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CAGGAARTGACGTAT (SEQ ID NO:82) и 21r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TGTTCACTCGCCGGA (SEQ ID NO:83).

Праймер 22f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности MGAGGTCGAAACGTA (SEQ ID NO:84), и праймер 22r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CACGGTGAGCGTRAA (SEQ ID NO:85).

Праймер 23f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности TGTAGACACAGTACT (SEQ ID NO:86) и праймер 23r содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATGCTTGTCTTCTAG (SEQ ID NO:87).

Праймер 24f содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ATCAGTTGGCTAACA (SEQ ID NO:88), и праймер 24r содержит последовательность нуклеин