Лечение рака при помощи направленных на мишень антител in vivo

Лечение рака при помощи направленных на мишень антител in vivo

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Во всем мире рак является существенной проблемой, связанной со здоровьем, и все еще остается в числе главных причин смерти. Раковые клетки в значительной степени биологически отличаются от незлокачественных клеток того же происхождения. Эти отличия являются результатом генетических изменений, приобретенных во время развития рака, а также, в числе прочего, приводят к образованию качественно или количественно измененных молекулярных структур в раковых клетках. В частности, такого рода структурами, связанными с раком, являются генетические продукты, экспрессия которых вызывается или увеличивается во время злокачественной трансформации.

Иммунная система обладает способностью распознавать и уничтожать клетки с помощью двух отдельных механизмов: врожденного и приобретенного иммунитета. Компоненты врожденного иммунитета включают макрофаги, натуральные клетки-киллеры (NK), моноциты и гранулоциты. Эти клетки опознают характерные участки молекулы, принимающие участие в трансформации клеток, и высвобождают различные цитокины и медиаторы воспаления. Врожденный ответ не обладает способностью запоминать чужеродные антигены, эта характерная особенность присуща приобретенному иммунному ответу. Этот последний компонент иммунной системы также отличается специфичностью по отношению к чужеродным антигенам, которая обеспечивается наличием рецепторов на лимфоцитах. Антигенпрезентирующие клетки (АРС) также играют роль в адаптивном ответе - они поглощают чужеродные антигены и представляют их лимфоцитам в случае главного комплекса гистосовместимости (МНС). Клетки CD4+T несут рецепторы, распознающие антигены в случае МНС II класса, которые затем разрешают им высвобождать цитокины и дополнительно активировать CD8+ лимфоциты (цитотоксические Т лимфоциты; CTL) или B-клетки. CTL являются частью клеточно-опосредованного иммунитета и способны уничтожать клетки, презентированные в случае молекул МНС II класса, путем апоптоза или клеточного лизиса, опосредованного перфорином. Является общепризнанным, что иммунитет, опосредованный T-клетками, играет жизненно важную роль в противоопухолевом ответе. B-клетки участвуют в высвобождении иммуноглобулинов и, по существу, являются частью гуморальной иммунной системы.

При правильном нацеливании и усилении иммунные функции можно использовать в терапевтических целях для контроля и даже уничтожения злокачественных патологических изменений. Генетические и эпигенетические изменения, связанные с канцерогенезом, порождают антигены, которые распознаются иммунной системой аналогично микробным антигенам.

Антитела успешно введены в клинику для использования при лечении рака и представляют собой наиболее обещающие терапевтические средства в онкологии в течение последнего десятилетия. Основанные на антителах методы лечения рака обладают возможностью более высокой специфичности и профилем более низких побочных действий по сравнению с традиционными лекарственными средствами. Причиной является точное распознавание нормальных и неопластических клеток антителами и факт, что механизм их действия основывается на менее токсичных иммунологических противоопухолевых механизмах, таких как активация комплемента и пополнение (рекрутинг) цитотоксических иммунных клеток.

Клаудины представляют собой интегральные мембранные белки, расположенные в плотных контактах эпителия и эндотелия. Известно, что клаудины имеют четыре трансмембранных сегмента с двумя внеклеточными петлями, при этом N- и C-концы располагаются в цитоплазме. Семейство трансмембранных белков клаудинов (CLDN) играет решающую роль в сохранении эпителиальных и эндотелиальных плотных контактов и, кроме того, может играть роль в поддержании цитоскелета и сигнальной системы клетки.

Мы обнаружили, что CLDN6 экспрессируется в тканях при различных видах рака, в то время как экспрессия в нормальных тканях ограничивается плацентой. Такие виды рака включают рак яичника, в частности аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточную карциному легких и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в частности злокачественную плеоморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, в частности переходно-клеточную карциному и папиллярную карциному, рак почки, в частности почечно-клеточную карциному, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкой кишки и аденокарциному подвздошной кишки, тестикулярную эмбриональную карциному, плацентарную хориокарциному, рак шейки матки, рак яичка, в частности тестикулярную семиному, тестикулярную тератому и эмбриональный рак яичка, и рак матки, и их метастатические формы.

Кроме того, мы получили антитела, способные специфически связываться с CLDN6 на поверхности интактных клеток, экспрессирующих CLDN6. Не наблюдалось специфического связывания с клетками, экспрессирующими клаудины, отличные от CLDN6, в частности CLDN3, CLDN4 и CLDN9, или в отношении этих антител проводилось исследование клеток, не экспрессирующих какие-либо из этих CLDN белков.

В данной работе мы расширили исследования и продемонстрировали, что связывания антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток достаточно для обеспечения значительного ингибирования роста опухоли. Оценка in vivo роста опухолевых клеток, трансфицированных CLDN6 и нетрансфицированных ксенотрансплантатов показала специфическое ингибирование опухолевого роста CLDN6-трансфицированных клеток, опосредованное антителом, связанным с CLDN6. Кроме того, было продемонстрировано, что связывание антитела с CLDN6 достаточно при ингибировании роста in vivo опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих CLDN6. Это дает экспериментальное доказательство того, что связывание антитела с CLDN6 является эффективным при ингибировании роста опухоли, и, что CLDN6 представляет собой привлекательную мишень для терапевтических антител, разработанных с целью ингибирования роста опухоли путем нацеливания на CLDN6.

Кроме того, было показано, что связывание антитела с CLDN6 является эффективным при ингибировании in vivo роста клеточной линии герминогенной опухоли, положительной в отношении человеческого CLDN6, что демонстрирует возможность применения антител, связывающихся с CLDN6, в качестве селективных терапевтических средств для нацеливания и уничтожения герминогенных опухолей, таких как опухоль половых клеток яичка.

Таким образом, мы представили первое прямое доказательство того, что связывание антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток in vivo приводит к ослаблению клеточного роста, и продемонстрировали, что специфическое связывание с CLDN6 дает в результате (представляет собой) терапевтические вмешательство, ослабляющее рост опухоли. Более того, мы представляем доказательство, что связывание антитела с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток in vivo приводит к продлению выживаемости и увеличению продолжительности жизни пациента с опухолью.

Таким образом, изобретение имеет отношение к лечению и/или предотвращению опухолевых заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими CLDN6, в частности рака и метастазов рака, с помощью антител, связывающихся с CLDN6. Настоящая заявка показывает, что связывания антител с CLDN6 на поверхности опухолевых клеток достаточно для ингибирования роста опухоли, повышения выживаемости и увеличения продолжительности жизни пациентов с опухолью. Более того, связывание антител с CLDN6 является эффективным при ингибировании роста CLDN6-положительных герминогенных опухолей, таких как тератокарцинома или эмбриональный рак, в частности эмбрионально-клеточная опухоль яичка.

Раскрытие изобретения

В одном аспекте изобретение имеет отношение к антителу, ингибирующему рост опухоли in vivo, при этом клетки опухоли экспрессируют клаудин 6 (CLDN6), а антитело является способным связываться с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело ингибирует рост опухоли посредством связывания с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело является специфическим к CLDN6. В одном варианте осуществления антитело является моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом, или является фрагментом антитела или синтетическим антителом. Опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы и эмбрионального рака яичка, рака матки, и их метастатических форм. Опухоль может быть герминогенной опухолью, такой как тератокарцинома или эмбриональная карцинома. Герминогенная опухоль может быть эмбрионально-клеточной опухолью яичка.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к антителу, выбранному из группы, состоящей из: (i) антитела, выработанного или полученного от клона, депонированного под инвентарным номером DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 21A) или DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2); (ii) антитела, представляющего собой химерную или гуманизированную форму антитела по пункту (i); (iii) антитела, обладающего специфичностью антитела по пункту (i) и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающий участок антитела по пункту (i). Антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий сайт антитела по пункту (i) может содержать вариабельный участок антитела по пункту (i).

Антитело в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов может прикрепляться, по меньшей мере, к одной терапевтической эффекторной частице (фрагменту, молекуле), такой как радиоизотопная метка, цитотоксин или цитотоксический фермент.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к гибридоме, способной продуцировать антитело в соответствии с любым из вышеуказанных аспектов.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к гибридоме, депонированной под инвентарным номером DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) или DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к фармацевтической композиции, содержащей антитело, соответствующее любому из вышеупомянутых аспектов. Фармацевтическая композиция может иметь форму терапевтической или профилактической противоопухолевой вакцины. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначается для лечения или предотвращения опухолевого заболевания.

В дополнительном аспекте изобретение имеет отношение к способу лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или имеющего риск развития опухолевого заболевания, при котором клетки опухоли экспрессируют клаудин 6 (CLDN6), при этом способ включает введение антитела, способного связываться с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело при введениии пациенту ингибирует рост опухоли у пациента посредством связывания с CLDN6. В одном варианте осуществления антитело присоединяется, по меньшей мере, к одной терапевтической эффекторной частице (фрагменту, молекуле), такой как радиоизотопная метка, цитотоксин или цитотоксический фермент. Антитело может быть специфическим к CLDN6. Антитело может быть моноклональным, химерным, человеческим или гуманизированным антителом, или фрагментом антитела или синтетическим антителом. В одном варианте осуществления способ включает введение фармацевтической композиции в соответствии с любым из вышеприведенных аспектов.

В любом из вышеприведенных аспектов опухолевое заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в частности злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, в частности переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почки, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточный рак почки и папиллярный рак почки, рака толстой кишки, рака тонкой кишки, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциномы тонкой кишки и аденокарциномы подвздошной кишки, тестикулярной эмбриональной карциномы, плацентарной хориокарциномы, рака шейки матки, рака яичка, в частности тестикулярной семиномы, тестикулярной тератомы, эмбрионального рака яичка, рака матки и их метастатических форм.

В любом из вышеприведенных аспектов опухолевое заболевание может быть герминогенным опухолевым заболеванием, таким как тератокарцинома или эмбриональная карцинома. Герминогенное опухолевое заболевание может быть эмбрионально-клеточной опухолью яичка.

В любом из вышеприведенных аспектов CLDN6 может содержать аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 списка последовательностей или вариантом указанной нуклеотидной последовательности и/или может содержать аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 списка последовательностей или вариантом указанной нуклеотидной последовательности.

Описанное здесь антитело является способным к связыванию с CLDN6 и предпочтительно является способным к связыванию с CLDN6, связанным с поверхностью клетки, экспрессирующей CLDN6. Предпочтительно, антитело является неспособным к связыванию с CLDN3, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN3, и/или является неспособным к связыванию с CLDN4, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN4. Предпочтительно, антитело является неспособным к связыванию с CLDN9, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется CLDN9. Наиболее предпочтительно, антитело является практически неспособным к связыванию с белком CLDN, отличным от CLDN6, в частности при связывании с поверхностью клетки, на которой экспрессируется указанный белок CLDN, и является специфическим в отношении CLDN6. Предпочтительно, указанная клетка, экспрессирующая указанный белок CLDN, является интактной клеткой, в частности непермеабилизированной клеткой (клеткой с ненарушенной проницаемостью мембраны), и указанный белок CLDN, связанный с поверхностью клетки, имеет нативную, т.е. неденатурированную конформацию. Предпочтительно, антитело является способным связываться с одним или более эпитопами CLDN6 в их нативной конформации.

В отдельных предпочтительных вариантах осуществления антитело, описанное здесь, связывается с нативными эпитопами CLDN6, присутствующими на поверхности живых клеток, такими как эпитопы SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления антитело является специфическим к опухолевым клеткам, экспрессирующим CLDN6, и не связывается с опухолевыми клетками, не экспрессирующими CLDN6. Предпочтительно, антитело, описанное здесь, специфически связывается с CLDN6.

В одном варианте осуществления антитело, описанное здесь, является способным к связыванию с эпитопом, расположенным во внеклеточной части CLDN6, при этом указанная внеклеточная часть CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. Предпочтительно, антитело является способным к связыванию с эпитопом, расположенным в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В одном варианте осуществления антитело получают способом, включающим стадию иммунизации животного пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или иммунологически эквивалентным пептидом, или нуклеиновой кислотой или клеткой-хозяином, экспресирующей указанный пептид.

В различных вариантах осуществления CLDN6, с которым способно связываться антитело, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Особенно предпочтительно, когда антитело является способным связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и способным связываться с CLDN6, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело, описанное здесь, обладает одним или более видами активности: (i) способностью уничтожать клетку, экспрессирующую CLDN6; (ii) способностью ингибировать пролиферацию клетки, экспрессирующей CLDN6; (iii) способностью ингибировать колониеобразование клетки, экспрессирующей CLDN6; и (iv) способностью ингибировать метастазирование клетки, экспрессирующей CLDN6. Уничтожение клеток, ингибирование пролиферации клеток и/или ингибирование колониеобразования клеток может использоваться в терапевтических целях для ингибирования роста опухоли, что включает остановку и/или предотвращение роста опухоли, замедление роста опухоли и/или уменьшение размера существующей опухоли, и, следовательно может использоваться в терапевтических целях для лечения или предотвращения рака, метастазов рака и/или метастатического распространения раковых клеток.

Предпочтительно описанное здесь антитело содействует уничтожению клеток, вызывая лизис, опосредованный комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредованный антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно, вызывая CDC-опосредованный лизис и/или ADCC-опосредованный лизис.

Предпочтительно ADCC-опосредованный лизис клеток происходит в присутствии эффекторных клеток, которые в отдельных вариантах осуществления выбирают из группы, состоящей из моноцитов, мононуклеарных клеток, NK-клеток и полиморфно-ядерных нейтрофилов (PMN), а фагоцитоз осуществляется макрофагами.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением пролиферации клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro путем определения пролиферации CLDN6-экспрессирующих клеток с помощью метода, использующего бромдезоксиуридин (5-бром-2-дезоксиуридин, BrdU). BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, являющийся аналогом тимидина, который может включаться во вновь синтезированную ДНК воспроизводящихся путем клеточного деления клеток (во время S-фазы клеточного цикла), замещая тимидин во время репликации ДНК. Обнаружение включенного химического вещества, например, с помощью антител, специфических к BrdU, укажет на клетки, которые активно воспроизводили свою ДНК.

Активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования клеток, экспрессирующих CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro с помощью исследования колониеобразования. Оценка способности образования колоний представляет собой микробиологическую методику для изучения эффективности воздействия отдельных веществ на выживание и пролиферацию клеток. Эта методика часто используется в лабораториях, изучающих рак, для определения действия лекарственных препаратов или облучения на пролиферирующие опухолевые клетки. Эксперимент включает три основных этапа: (i) обработку образца клеток, в частности раковых клеток; (ii) высевание клеток в сосуд для культивирования; и (iii) этап роста клеток. Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают. Колониеобразование имеет большое значение для образования метастазов, если отдельные опухолевые клетки проникают в органы. Ингибирующая активность антител показывает их возможность подавлять образование метастазов. Антитела, продемонстрировавшие активность, связанную с ингибированием или уменьшением колониеобразования, при исследовании методом колониеобразования, являются в частности пригодными для лечения или предотвращения метастазов и метастатического распространения раковых клеток, в частности упомянутых в описании видов рака.

В предпочтительных вариантах осуществления описанное здесь антитело проявляет одну или более иммунных эффекторных функций в отношении клеток, несущих CLDN6 в нативной конформации, при этом одну или более иммунные эффекторные функции предпочтительно выбирают из группы, состоящей из комплементзависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), индукции апоптоза и ингибирования пролиферации, предпочтительно эффекторными функциями являются ADCC и/или CDC.

Предпочтительно ингибирование роста опухоли или иммунные эффекторные функции, проявляемые описанным здесь антителом, вызываются связыванием указанного антитела с CLDN6, предпочтительно с эпитопом, расположенным на внеклеточном участке CLDN6, причем указанный внеклеточный участок CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Согласно изобретению клетка, экспрессирующая CLDN6, предпочтительно характеризуется соединением CLDN6 с клеточной поверхностью. Клетка, экспрессирующая CLDN6, или клетка, отличающаяся связыванием CLDN6 с клеточной поверхностью или несущая CLDN6 в нативной конформации, предпочтительно является опухолевой клеткой, такой как раковая клетка, предпочтительно клеткой, описанной здесь злокачественной опухоли.

Антитело, описанное здесь, может быть присоединено к одной или более терапевтическим эффекторным частицам (фрагментам молекулам), например, радиоизотопным меткам, цитотоксинам, терапевтическим ферментам, агентам, вызывающим апоптоз, и тому подобному, для того, чтобы обеспечить прицельную цитотоксичность, т.е. уничтожение опухолевых клеток.

В одном варианте осуществления описанное здесь антитело (i) связывается с клетками, экспрессирующими CLDN6, и (ii) не связывается с клетками, неэкспрессирующими CLDN6 6. Антитело, описанное здесь, предпочтительно (i) опосредует уничтожение и/или ингибирует пролиферацию клеток, экспрессирующих CLDN6, и (ii) не опосредует уничтожение и/или не ингибирует пролиферацию клеток, неэкспрессирующих CLDN6.

В одном варианте осуществления описанные здесь антитела могут характеризоваться одним или более из следующих свойств:

a) специфичностью к CLDN6;

b) родством связывания с CLDN6 около 100 нМ или менее, предпочтительно около 5-10 нМ или менее и более предпочтительно около 1-3 нМ или менее;

c) способностью уничтожать опухолевые клетки, экспрессирующие CLDN6;

d) способностью останавливать или задерживать пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6;

e) способностью повышать выживаемость субъекта, у которого имеются опухолевые клетки, экспрессирующие CLDN6.

В одном варианте осуществления описанное здесь антитело уменьшает рост опухолевых клеток и/или вызывает гибель опухолевых клеток и, таким образом, оказывает на опухоль ингибирующее или разрушающее действие.

Предпочтительное антитело, описанное здесь, является антителом, выработанным клеткой гибридомой или полученным от клетки гибридомы, находящейся на хранении в DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Германия) и имеющей одно из следующих обозначений и инвентарных номеров:

1. GT512muMAB 36A, инвентарный номер DSM ACC3059, зарегистрировано 13 апреля 2010;

2. GT512muMAB 27A, инвентарный номер DSM ACC3058, зарегистрировано 13 апреля 2010; или

3. GT512muMAB 5F2D2, инвентарный номер DSM ACC3057, зарегистрировано 13 апреля 2010.

Антитела изобретения обозначаются в описании путем отсылки к обозначению антитела и/или путем отсылки к клону, продуцирующему антитело, например, muMAB 36A.

Кроме того, предпочтительными антителами являются антитела, имеющие специфичность антител, выработанных гибридомой или полученных от описанной выше гибридомы, и в частности, антитела, содержащие антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий центр, в частности вариабельный участок, идентичный или высокогомологичный участку антитела, выработанного или полученного от вышеописанной гибридомы. Предусматривается, что предпочтительными антителами являются антитела, имеющие CDR участки или идентичные или высокогомологичные участкам антител, продуцированных или полученных от описанной выше гибридомы. Под "высокогомологичным" имеется в виду, что может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3, или 1 или 2 замены. Особенно предпочтительными являются химерные и гуманизированные формы антител, продуцированные или полученные от вышеуказанных гибридом.

Настоящее изобретение также имеет отношение к клетке, такой как клетка гибридомы, продуцирующая антитело, как описано здесь.

Предпочтительными клетками гибридомы являются те, которые находятся на хранении в DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Германия) и имеют одно из следующих обозначений и инвентарных номеров:

1. GT512muMAB 36A, инвентарный номер ACC3059, зарегистрирована 13 апреля 2010;

2. GT512muMAB 27A, инвентарный номер ACC3058, зарегистрирована 13 апреля 2010; или

3. GT512muMAB 5F2D2, инвентарный номер ACC3057, зарегистрирована 13 апреля 2010.

Настоящее изобретение также имеет отношение к нуклеиновым кислотам, содержащим гены или нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или их участки, например цепь антитела, как описано здесь. Нуклеиновые кислоты могут входить в состав вектора, например плазмиды, космиды, вируса, бактериофага или другого используемого вектора, например, принятого в генной инженерии. Кроме того, вектор может содержать гены, например маркерные гены, дающие возможность отобрать вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях. Кроме того, вектор может содержать контрольные элементы экспрессии, обеспечивающие надлежащую экспрессию закодированных участков в подходящих хозяевах. Такие контрольные элементы известны специалисту и могут включать промотор, сплайс-кассету и инициаторный кодон трансляции.

Предпочтительно нуклеиновая кислота изобретения функционально прикрепляется к элементам, контролирующим экспрессию, обеспечивая экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках. Контролирующие элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических и прокариотических клетках, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Способы конструирования нуклеотидных молекул, конструирования векторов, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, введения векторов в соответствующие выбранные клетки-хозяева или индуцирования (вызывания) или достижения экспрессии молекул нуклеиновой кислоты хорошо известны в данной области техники.

Дополнительный аспект настоящего изобретения имеет отношение к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор, раскрытые здесь.

В одном аспекте изобретение предоставляет композиции, например, фармацевтические и диагностические композиции/наборы, содержащие антитело или комбинацию антител изобретения, описанных здесь. Фармацевтическая композиция изобретения может содержать фармацевтически приемлемый носитель и может необязательно содержать один или более адьювантов, стабилизирующих веществ и т.д. В отдельном варианте осуществления композиция включает комбинацию антител, которые связываются с разными эпитопами или которые обладают разными функциональными характеристиками, например, вызывают CDC и/или ADCC.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения является терапевтической или профилактической противоопухолевой вакциной.

В одном аспекте изобретение предоставляет терапевтические и профилактические способы лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или подвергающегося риску развития опухолевого заболевания. В одном аспекте изобретение предоставляет способы ингибирования роста опухоли. В одном аспекте изобретение предоставляет способы вызывания гибели опухолевой клетки. Эти аспекты могут включать введение описанных здесь антител или композиций пациенту.

Настоящее изобретение также включает одновременное или последовательное введение двух или более анти-CLDN6 антител, при этом предпочтительно, по меньшей мере, одно из указанных антител представляет собой химерное анти-CLDN6 антитело и, по меньшей мере, еще одно антитело представляет собой человеческое анти-CLDN6 антитело, антитела связываются с одними и теми же или разными эпитопами CLDN6. Предпочтительно, химерное CLDN6-антитело изобретения вводят сначала, а затем вводят человеческое анти-CLDN6 антитело, причем человеческое анти-CLDN6 антитело предпочтительно вводится в течение продолжительного периода времени, т.е. в качестве поддерживающей терапии.

Антитело или композиция, описанная здесь, может быть использована в целом ряде способов ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, и/или селективного уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, и следовательно ингибирования роста опухоли посредством контактирования клеток с эффективным количеством антитела или композиции, так что рост клетки ингибируется и/или клетка уничтожается. В одном варианте осуществления способ включает уничтожение опухолевых клеток, экспрессирующих CLDN6, необязательно в присутствии эффекторных клеток, например, с помощью CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или с помощью комбинации двух или более из этих механизмов.

Антитело или композиция, описанная здесь, может использоваться для лечения и/или предотвращения опухолевых заболеваний, вовлекающих клетки, экспрессирующие CLDN6, путем введения антител или композиции пациентам, страдающим от подобных заболеваний или подвергающимся риску развития таких заболеваний.

Изобретение включает профилактическое и/или терапевтическое лечение опухолевых болезней, т.е. для лечения пациента, имеющего опухолевое заболевание или подвергающегося риску развития опухолевого заболевания. В одном аспекте изобретение предоставляет способы ингибирования роста опухоли, включающие введение одного или более антител и композиций, описанных здесь.

Предпочтительно антитела и композиции, описанные здесь, вводятся таким способом, что терапевтически активная субстанция, в частности антитело, не доставляется или практически не доставляется в ткань или орган, в котором клетки экспрессируют CLDN6, в то время как ткань или орган свободны от опухоли, например в ткань плаценты или плаценту. Для этого средства и композиции, описанные здесь, вводятся местно.

В одном аспекте изобретение предоставляет описанное здесь антитело для применения в описанных здесь способах лечения. В одном варианте осуществления изобретение предоставляет описанную здесь фармацевтическую композицию для применения в описанных здесь способах лечения.

Описанные здесь способы лечения могут комбинироваться с хирургическим удалением и/или облучением и/или общепринятой химиотерапией.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут понятны из следующего подробного описания и пунктов формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

На всем протяжении этого подробного описания и последующих пунктов формулы изобретения, если контекст не требует иного, следует понимать, что слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", предполагает включение определенного члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий, хотя в некоторых вариантах осуществления подобный другой член, целое число или стадия или группа членов, целых чисел или стадий могут исключаться, т.е. объект заключается во включении определенного члена, целого числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий. Термины "а" и "an" и "the" и подобные ссылки, использованные в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) следует истолковывать как включающие и единственное и множественное число, если в описании не указано иначе или иное явно не продиктовано контекстом. Перечисление пределов значений в описании служит только как способ сокращения упоминания в отдельности каждого отдельного значения, попадающего в предел. Если не указано иное, каждое индивидуальное значение включается в подробное описание, как если бы оно было отдельно перечислено в описании. Все описанные здесь методы могут осуществляться в любом подходящем порядке, если в описании не указано иначе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование всех без исключения примеров или характерных выражений (например, "такой как"), предоставленных в описании, имеет целью только лучше иллюстрировать изобретение и не ограничивает рамки изобретения, заявленные в иной форме. Формулировки подробного описания не должны быть истолкованы, как означающие какой-либо незаявленный элемент, существенный для осуществления изобретения на практике.

Клаудины представляют собой белки, являющиеся наиболее важными компонентами плотных контактов, где они создают трансклеточный барьер, контролирующий поток молекул в межклеточном пространстве между клетками эпителия. Клаудины являются трансмембранными белками, пересекающими мембрану 4 раза, при этом и N-конец и C-конец располагаются в цитоплазме. Первая внеклеточная петля состоит в среднем из 53 аминокислот и вторая петля примерно из 24 аминокислот. CLDN6 и CLDN9 являются наиболее сходными членами семейства CLDN.

Термин "CLDN" при использовании в описании означает клаудин и включает CLDN6, CLDN9, CLDN4 и CLDN3. Предпочтительно CLDN является человеческим CLDN.

Термин "CLDN6" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN6 и, в частности, к белку, содержащему (i) аминокислотную последовательность, кодированную нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 списка последовательностей или вариант указанной нуклеотидной последовательности, и/или (ii) аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 28 по 80, более предпочтительно аминокислоты с 28 по 76 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, например, аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3. Вторая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислоты с 138 по 160, предпочтительно аминокислоты с 141 по 159, более предпочтительно аминокислоты с 145 по 157 аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, такой как аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO: 5. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно образуют внеклеточный участок CLDN6.

Термин "CLDN9" предпочтительно имеет отношение к человеческому CLDN9 и, в частности, к белку, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 7 списка последовательностей или вариант указанной аминокислотной последовательности. Первая в