Слитые серпиновые полипептиды и способы их применения

Слитые серпиновые полипептиды и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/502055, поданной 28 июля 2011 г.; предварительной заявки на патент США № 61/570394, поданной 14 декабря 2011 г.; предварительной заявки на патент США № 61/577204, поданной 19 декабря 2011 г.; и предварительной заявки на патент США № 61/638168, поданной 25 апреля 2012 г. Содержание каждой из этих заявок во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к молекулам, в частности, к полипептидам, а более конкретно, к слитым белкам, которые включают серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпиновых полипептидов, и второй полипептид. Кроме того, настоящее изобретение относится к слитым белкам, которые включают серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпиновых полипептидов, второй полипептид и третий полипептид. Более конкретно, настоящее изобретение относится к слитым белкам, которые включают по меньшей мере один серпиновый полипептид и второй полипептид, или к слитым белкам, которые включают по меньшей мере серпиновый полипептид, второй полипептид и третий полипептид, где указанные второй и третий полипептиды слитых белков согласно изобретению могут представлять собой по меньшей мере один из нижеследующих полипептидов, таких как: Fc-полипептид или аминокислотная последовательность, полученная из Fc-полипептида; направленный на цитокин полипептид или последовательность, полученная из направленного на цитокин полипептида; полипептид, включающий домен WAP, или последовательность, полученная из WAP-содержащего полипептида; или альбуминовый полипептид или аминокислотная последовательность, полученная из полипептида сывороточного альбумина. Настоящее изобретение также относится к способам применения указанных молекул для ряда терапевтических или диагностических показаний, а также к способам продуцирования указанных молекул.

Предшествующий уровень техники

Нарушение активности сериновой протеазы или дисбаланс между протеазами и ингибиторами протеаз могут приводить к опосредованной протеазой деструкции ткани и к воспалительным ответам. В соответствии с этим, необходимо разработать терапевтические средства и способы лечения, которые были бы направлены на устранение аберрантной активности сериновой протеазы и/или дисбаланса между протеазами и ингибиторами протеаз. Кроме того, усиление терапевтических эффектов может быть достигнуто посредством ослабления передачи аберрантного цитокинового сигнала и активности сериновой протеазы. Кроме того, было продемонстрировано, что серпиновые белки обладают противоинфекционной активностью, тогда как направленное действие воспалительных цитокинов, как было показано, повышает риск развития инфекции. Слитые белки согласно изобретению могут подавлять воспалительную активность цитокинов и снижать риск развития инфекции.

Сущность изобретения

Описанные здесь слитые белки включают по меньшей мере серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпинового полипептида (Полипептид 1), и второй полипептид (Полипептид 2). Кроме того, описанные здесь слитые белки включают серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпинового полипептида (Полипептид 1), второй полипептид (Полипептид 2) и третий полипептид (Полипептид 3). Используемые здесь термины «слитый белок» и «слитый полипептид» являются синонимами и означают серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпинового полипептида, которые функционально присоединены по меньшей мере ко второму полипептиду или к аминокислотной последовательности, полученной по меньшей мере из второго полипептида. Отдельные элементы слитого белка могут быть связаны друг с другом различными способами, включая, например, прямое связывание, связывание посредством промежуточного соединения или спейсерного пептида, связывание посредством линкерной области, связывание посредством шарнирной области или связывание посредством линкерной и шарнирной области. В некоторых вариантах изобретения, линкерная область может находиться в последовательности шарнирной области или, альтернативно, шарнирная область может находиться в последовательности линкерной области. Предпочтительно, чтобы линкерная область имела пептидную последовательность. Так, например, линкерный пептид включает последовательность, содержащую приблизительно от 0 до 40 аминокислот, например, от 0 до 35 аминокислот, от 0 до 30 аминокислот, от 0 до 25 аминокислот или от 0 до 20 аминокислот. Предпочтительно, чтобы шарнирная область имела пептидную последовательность. Так, например, шарнирный пептид включает последовательность, содержащую приблизительно от 0 до 75 аминокислот, например, от 0 до 70 аминокислот, от 0 до 65 аминокислот или от 0 до 62 аминокислот. В тех вариантах, в которых слитый белок включает линкерную область и шарнирную область, предпочтительно, чтобы и линкерная область и шарнирная область представляли собой пептидную последовательность. В этих вариантах, шарнирный пептид и линкерный пептид, взятые вместе, включают последовательность, содержащую приблизительно от 0 до 90 аминокислот, например, от 0 до 85 аминокислот или от 0 до 82 аминокислот.

В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид и второй полипептид могут быть связаны посредством промежуточного связывающего белка. В некоторых вариантах изобретения, серпиновая часть и вторая полипептидная часть слитого белка могут быть связаны нековалентной связью.

В некоторых вариантах изобретения, слитые белки согласно изобретению могут быть представлены одной из нижеследующих формул, в направлении от N-конца к C-концу или от C-конца к N-концу:

Полипептид 1_(a) - шарнирная область_m - Полипептид 2_(b);

Полипептид 1_(a) - линкер_n - Полипептид 2_(b);

Полипептид 1_(a) - линкер_n - шарнирная область_m - Полипептид 2_(b);

Полипептид 1_(a) - шарнирная область_m - линкер_n - Полипептид 2_(b);

Полипептид 1_(a) - Полипептид 2_(b)- Полипептид 3_(c);

Полипептид 1_(a) - шарнирная область_m - Полипептид 2_(b)- шарнирная область_m - Полипептид 3_(c);

Полипептид 1_(a)-линкер_n - Полипептид 2_(b)- линкер_n -Полипептид 3_(c);

Полипептид 1_(a) - шарнирная область_m - линкер_n - Полипептид 2_(b) -шарнирная область_m - линкер_n - Полипептид 3_(c) - Полипептид 1_(a) - линкер_n - шарнирная область_m - Полипептид 2_(b) - линкер_n - шарнирная область_m- Полипептид 3_(c),

где n равно целому числу от 0 до 20, m равно целому числу от 1 до 62 и a, b и c равны целому числу по меньшей мере 1. Эти варианты изобретения включают вышеуказанные конструкции и любые их варианты или комбинации. Так, например, в этих формулах полипептиды могут также располагаться в следующем порядке: Полипептид 3_(с) - Полипептид 1_(a)- Полипептид 2_(b), Полипептид 2_(b) - Полипептид 3_(с) - Полипептид 1_(a) или в любом другом порядке или в том и другом порядке.

В некоторых вариантах изобретения, последовательность Полипептида 1 включает серпиновый полипептид. Серпины представляют собой группу белков с аналогичными структурами, и эти белки были впервые идентифицированы как серия белков, способных ингибировать протеазы. Серпиновыми белками, подходящими для их применения в описанных здесь слитых белках, являются, например, но не ограничиваются ими, альфа-1-антитрипсин (AAT), белок, родственный антитрипсину (SERPINA2), альфа 1-антихимотрипсин (SERPINA3), каллистатин (SERPINA4), ингибитор эластазы моноцитов-нейтрофилов (SERPINB1), PI-6 (SERPINB6), антитромбин (SERPINC1), ингибитор активатора плазминогена 1 (SERPINE1), альфа-2-антиплазмин (SERPINF2), ингибитор комплемента 1 (SERPING1) и нейросерпин (SERPINI1).

В некоторых вариантах изобретения, последовательность Полипептида 1 включает полипептидную последовательность альфа-1-антитрипсина (AAT) или аминокислотную последовательность, полученную из ААТ. В некоторых вариантах изобретения, последовательность Полипептида 1 включает часть белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, последовательность Полипептида 1 включает по меньшей мере часть петли реакционного сайта белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, часть петли реакционного сайта белка AAT включает по меньшей мере аминокислотную последовательность:

GTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNK (SEQ ID NO: 1).

В предпочтительном варианте изобретения, последовательность полипептида AAT или аминокислотная последовательность, полученная из AAT, представляет собой последовательность человеческого полипептида AAT или последовательность, полученную из указанной последовательности.

В некоторых вариантах изобретения, слитый белок включает полноразмерную человеческую полипептидную последовательность AAT, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, слитый белок включает человеческую полипептидную последовательность AAT, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах изобретения, полипептидная последовательность ААТ представляет собой аминокислотную последовательность полипептида AAT или получен из одной или более человеческих полипептидных последовательностей AAT, имеющихся в GenBank под регистрационными №№ AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP 001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 и/или AAA51547.1.

В некоторых вариантах изобретения слитые белки имеют одну или более мутаций. Так, например, слитый белок имеет по меньшей мере одну мутацию в положении метионинового (Met) остатка в серпиновой части слитого белка. При таких Met-мутациях, остаток Met может быть заменен любой аминокислотой. Так, например, остаток Met может быть заменен аминокислотой, имеющей гидрофобную боковую цепь, такой как, например, лейцин (Leu, L). Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы лишь отмечают, что мутация(и) в Met предотвращает(ют) окисление и последующую инактивацию ингибирующей активности слитых белков согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, остаток Met может быть заменен заряженным остатком, таким как, например, глутамат (Glu, E). В некоторых вариантах изобретения, мутация Met находится в положении 358 AAT-полипептида. Так, например, мутация Met представляет собой Met358Leu (M358L). В некоторых вариантах изобретения, мутация Met находится в положении 351 AAT-полипептида. Так, например, мутация Met представляет собой Met351Glu (M351E). В некоторых вариантах изобретения, мутация Met находится в положении 351 и в положении 358 AAT-полипептида, например, мутация Met представляет собой Met351Glu (M351E) и Met358Leu (M358L). Так, например, петля реакционного сайта этого варианта слитого AAT-полипептида имеет следующую последовательность: GTEAAGAEFLEAIPLSIPPEVKFNK (SEQ ID NO: 32). В некоторых вариантах изобретения, мутация Met находится в положении 351 и в положении 358 AAT-полипептида, например, мутация Met представляет собой Met351Leu (M351L) и Met358Leu (M358L). Так, например, петля реакционного сайта этого варианта слитого AAT-полипептида имеет следующую последовательность: GTEAAGALFLEAIPLSIPPEVKFNK (SEQ ID NO: 33).

В некоторых вариантах изобретения, второй полипептид (Полипептид 2) серпинового слитого белка представляет собой Fc-полипептид или полипептид, полученный из Fc-полипептида. Эти варианты имеют здесь общее название «слитые белки «серпин-Fc»». Описанные здесь слитые белки «серпин-Fc» включают по меньшей мере серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпина, и Fc-полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из Fc-полипептида. В некоторых вариантах изобретения слитый белок «серпин-Fc» включает один серпиновый полипептид. В других вариантах изобретения слитые белки «серпин-Fc» включают более, чем один серпиновый полипептид, и эти варианты имеют здесь общее название «слитый белок «серпин_(a'₎-Fc»», где (a') равно целому числу по меньшей мере 2. В некоторых вариантах изобретения, каждый серпиновый полипептид в слитом белке «серпин_(a'₎-Fc» включает одну и ту же аминокислотную последовательность. В других вариантах изобретения, каждый серпиновый полипептид в слитом белке «серпин_(a'₎-Fc» включает серпиновые полипептиды с отличающимися аминокислотными последовательностями. Серпиновые полипептиды слитых белков «серпин_(a'₎-Fc» могут находиться в любом положении указанного слитого белка.

В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка «серпин-Fc» включает по меньшей мере аминокислотную последовательность части петли реакционного сайта белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, часть петли реакционного сайта белка AAT включает по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка «серпин-Fc» включает по меньшей мере аминокислотную последовательность варианта части петли реакционного сайта белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, вариант части петли реакционного сайта белка AAT включает по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:33. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка «серпин-Fc» включает по меньшей мере полноразмерную полипептидную последовательность человеческого ААТ, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка «серпин-Fc» включает полипептидную последовательность человеческого AAT, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 32 или 33.

В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка «серпин-Fc» включает полипептидную последовательность AAT, которая представляет собой одну или более человеческих последовательностей ААТ или аминокислотную последовательность, полученную из указанных последовательностей AAT, имеющихся в GenBank под регистрационными №№ AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 и/или AAA51547.1.

В некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид слитого белка представляет собой человеческий Fc-полипептид, например, последовательность Fc-полипептида человеческого IgG или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgG. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид представляет собой Fc-полипептид человеческого IgG1 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgG1. В некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид представляет собой Fc-полипептид человеческого IgG2 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgG2. В некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид представляет собой Fc-полипептид человеческого IgG3 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgG3. В некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид представляет собой Fc-полипептид человеческого IgG4 или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgG4. В некоторых вариантах изобретения, Fc-полипептид представляет собой Fc-полипептид человеческого IgМ или аминокислотную последовательность, полученную из последовательности Fc-полипептида человеческого IgM.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка, включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG1, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка, включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG1, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, этот Fc-полипептид был мутирован или модифицирован так, чтобы он повышал уровень связывания с FcRn. В этих вариантах изобретения, мутированный или модифицированный Fc-полипептид имеет следующие мутации: Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S256T, T256E) или Met428Leu и Asn434Ser (M428L, N434S), пронумерованные по системе нумерации Кэбата. В некоторых вариантах изобретения, часть Fc-полипептида была мутирована или как-либо иначе модифицирована в целях нарушения Fc-опосредуемой димеризации. В этих вариантах изобретения, слитый белок является мономерным по своей природе.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG2, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG2, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG3, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG3, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID №: 5.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG4, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgG4, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID №: 6.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgМ, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок согласно изобретению включает Fc-полипептид, такой Fc-полипептид слитого белка включает последовательность Fc-полипептида человеческого IgМ, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах описанных здесь слитых белков, второй полипептид (Полипептид 2) серпинового слитого белка представляет собой направленный на цитокин полипептид или получен из направленного на цитокин полипептида. Эти варианты имеют здесь общее название «слитые белки серпин - направленный на цитокин полипептид». Описанные здесь «слитые белки серпин - направленный на цитокин полипептид» включают по меньшей мере серпиновый полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из серпинового полипептида, и направленный на цитокин полипептид, или их производные. В некоторых вариантах изобретения, слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид включает один серпиновый полипептид. В других вариантах изобретения, слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид включает более, чем один серпиновый полипептид, и эти варианты имеют здесь общее название «слитые белки серпин_(a'₎-направленный на цитокин полипептид», где (a') представляет целое число по меньшей мере 2. В некоторых вариантах изобретения, каждый серпиновый полипептид в слитом белке серпин_(a'₎-направленный на цитокин полипептид включает одну и ту же аминокислотную последовательность. В других вариантах изобретения, каждый серпиновый полипептид в слитом белке серпин_(a'₎-направленный на цитокин полипептид включает серпиновые полипептиды с отличающимися аминокислотными последовательностями.

В некоторых вариантах изобретения направленный на цитокин полипептид слитого белка серпин - направленный на цитокин полипептид представляет собой цитокиновый рецептор или получен из цитокинового рецептора. В предпочтительном варианте изобретения, направленный на цитокин полипептид или аминокислотная последовательность, полученная из цитокинового рецептора, представляют собой человеческую последовательность цитокинового рецептора или последовательность, полученную из указанной последовательности. В других вариантах изобретения направленным на цитокин полипептидом является антитело или его фрагмент, например, антитело против цитокина или фрагмент антитела против цитокина. В предпочтительном варианте изобретения, направленный на цитокин полипептид или аминокислотную последовательность, полученную из указанного антитела или его фрагмента, получают из последовательности химерного, гуманизованного или полностью человеческого антитела. Термин «фрагмент антитела» включает одну цепь, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, scFv, scAb, dAb, однодоменное антитело с тяжелой цепью и однодоменное антитело с легкой цепью.

В других вариантах изобретения, направленный на цитокин полипептид связывается с цитокиновым рецептором и предотвращает связывание цитокина с рецептором. В других вариантах изобретения, направленным на цитокин полипептидом является антитело или его фрагмент, например, антитело против цитокинового рецептора или фрагмент антитела против цитокинового рецептора.

В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитых белков серпин - направленный на цитокин полипептид включает по меньшей мере аминокислотную последовательность части петли реакционного сайта белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, часть петли реакционного сайта белка AAT включает по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитых белков серпин - направленный на цитокин полипептид включает по меньшей мере аминокислотную последовательность варианта части петли реакционного сайта белка AAT. В некоторых вариантах изобретения, вариант части петли реакционного сайта белка AAT включает по меньшей мере аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:33. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка серпин - направленный на цитокин полипептид включает по меньшей мере полноразмерную человеческую полипептидную последовательность ААТ, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или последовательность, полученную из этой последовательности. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка серпин - направленный на цитокин полипептид включает человеческую полипептидную последовательность AAT, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 32 или 33.

В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид слитого белка серпин - направленный на цитокин полипептид включает полипептидную последовательность AAT, которая представляет собой одну или более человеческих полипептидных последовательностей ААТ или аминокислотную последовательность, полученную из указанных последовательностей AAT, имеющихся в GenBank под регистрационными №№ AAB59495.1, CAJ15161.1, P01009.3, AAB59375.1, AAA51546.1, CAA25838.1, NP_001002235.1, CAA34982.1, NP_001002236.1, NP_000286.3, NP_001121179.1, NP_001121178.1, NP_001121177.1, NP_001121176.16, NP_001121175.1, NP_001121174.1, NP_001121172.1 и/или AAA51547.1.

Слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид может включать часть слитого белка серпин - Fc. Так, например, антитело содержит Fc-полипептид. Поэтому, в некоторых вариантах изобретения, в которых направленным на цитокин полипептидом является цитокин-связывающее антитело, слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид содержит часть слитого белка серпин - Fc. Кроме того, большинство рецепторных слитых белков, обладающих терапевтической активностью, представляет собой слитые Fc-белки. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения, в которых слитым белком серпин - направленный на цитокин полипептид является слитый белок серпин - цитокиновый рецептор, слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид может, помимо серпиновой части и части цитокинового рецептора, включать Fc-полипептид.

В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид включает последовательность Fc-полипептида, указанная последовательность Fc-полипептида включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7 или последовательность, полученную из указанной последовательности. В некоторых вариантах изобретения, в которых слитый белок серпин - направленный на цитокин полипептид включает последовательность Fc-полипептида, указанная последовательность Fc-полипептида по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид и направленный на цитокин полипептид функционально присоединены друг к другу посредством линкерной области, например, посредством линкера глицин - серин или линкера на основе глицина - серина. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид и направленный на цитокин полипептид функционально присоединены друг к другу посредством шарнирной области. В некоторых вариантах изобретения, серпиновый полипептид и направленный на цитокин полипептид функционально присоединены друг к другу посредством линкерной области и шарнирной области. В других вариантах изобретения, серпиновый полипептид и направленный на цитокин полипептид непосредственно связаны друг с другом.

В некоторых вариантах изобретения описанных здесь слитых белков, второй полипептид (Полипептид 2) серпинового слитого белка представляет собой полипептид, содержащий домен кислотного белка молочной сыворотки (WAP), или аминокислотную последовательность, полученную из полипептида, содержащего домен WAP. Эти варианты имеют здесь общее название «слитые белки серпин - домен WAP». Слитые белки серпин - домен WAP включают по меньшей мере серпиновый полипептид или по меньшей мере аминокислотную последовательность, полученную из этого серпина; и полипептид, содержащий домен WAP или аминокислотную последовательность, полученную из полипептида, содержащего домен WAP. В некоторых вариантах изобретения, слитый белок серпин - домен WAP включает один серпиновый полипептид. В других вариантах изобретения, слитый белок серпин – направленный на WAP полипептид включает более, чем один серпиновый полипептид. Эти варианты имеют здесь общее название «слитые белки серпин_(a'₎-домен WAP», где (a') равно целому числу по меньшей мере 2. В некоторых вариантах изобретения, серпиновые полипептиды в слитом белке серпин_(a'₎- домен WAP включают одну и ту же аминокислотную последовательность. В других вариантах изобретения, серпиновые полипептиды в слитом белке серпин_(a'₎ - направленный на цитокин полипептид включают серпиновые полипептиды с отличающимися аминокислотными последовательностями.

Эти слитые белки серпин - домен WAP включают полипептидную последовательность, содержащую домен WAP или полипептидную последовательность, которая представляет собой полипептид, содержащий домен WAP, или последовательность, полученную из указанной последовательности. Домен WAP представляет собой эволюционно консервативный мотив последовательности из 50 аминокислот, содержащей восемь цистеинов, расположенных в сердцевине с характерной структурой из 4 дисульфидов (также называемой коровым мотивом из четырех дисульфидов). Мотив последовательности домена WAP представляет собой функциональный мотив, отличающийся тем, что в ряде белков он обладает активностью, направленной на ингибирование сериновой протеазы.

Полипептидами, содержащими домен WAP и подходящими для их использования в описанных здесь слитых белках, являются, например, но не ограничиваются ими, ингибитор секреторной протеазы лейкоцитов (SLPI), элафин и эппин.

В некоторых вариантах изобретения, последовательность полипептида, содержащего домен WAP в слитом белке, включает последовательность полипептида-ингибитора секреторной протеазы лейкоцитов (SLPI) или аминокислотную последовательность, полученную из SLPI. Эти варианты называются здесь «слитыми белками серпин - последовательность, полученная из SLPI». В некоторых вариантах изобретения, полипептидная последовательность SLPI содержит часть белка SLPI, такую как, например, домен WAP2 или его субчасть. В предпочтительном варианте изобретения, последовательность полипептида SLPI или аминокислотная последовательность, полученная из SLPI, представляет собой последовательность человеческого полипептида SLPI или последовательность, полученную из этой последовательности.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает полноразмерную последовательность человеческого полипептида SLPI, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает последовательность человеческого полипептида SLPI, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает часть полноразмерной последовательности человеческого полипептида SLPI, где указанная часть имеет нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает последовательность человеческого полипептида SLPI, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает домен WAP2 полноразмерной последовательности человеческого полипептида SLPI, где указанный домен WAP2 имеет нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает последовательность человеческого полипептида SLPI, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность полипептида SLPI или аминокислотная последовательность, полученная из SLPI, представляет собой одну или более человеческих последовательностей полипептида SLPI или полученная из указанных последовательностей SLPI, имеющихся в GenBank под регистрационными №№ CAA28187.1, NP_003055.1, EAW75869.1, P03973.2, AAH20708.1, CAB64235.1, CAA28188.1, AAD19661.1 и/или BAG35125.1.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - SLPI согласно изобретению, последовательность полипептида SLPI или последовательность слитого белка, полученная из SLPI, включает последовательность человеческого полипептида SLPI, которая имеет модификацию в положении метионинового (Met) остатка. При таких Met-мутациях, остаток Met может быть заменен любой аминокислотой. Так, например, остаток Met может быть заменен аминокислотой, имеющей гидрофобную боковую цепь, такой как, например, лейцин (Leu, L) или валин (Val, V). Не ограничаваясь какой-либо теорией, авторы лишь отмечают, что мутация(и) в Met предотвращает(ют) окисление и последующую инактивацию ингибирующей активности слитых белков согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, мутация Met находится в положении 98 полипептида SLPI. Так, например, модифицированная последовательность полипептида SLPI слитого белка серпин - SLPI имеет мутации M98L или M98V в SEQ ID NO: 8.

В других вариантах изобретения, полипептидная последовательность слитого белка, содержащая домен WAP, включает полипептидную последовательность элафина или аминокислотную последовательность, полученную из элафина. Эти варианты называются здесь «слитыми белками серпин - элафин». В некоторых вариантах изобретения, полипептидная последовательность элафина включает часть белка элафина, такую как, например, домен WAP или его субчасть. В предпочтительном варианте изобретения, полипептидная последовательность элафина или аминокислотная последовательность, полученная из элафина, представляет собой полипептидную последовательность человеческого элафина или последовательность, полученную из указанной последовательности.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает полноразмерную полипептидную последовательность человеческого элафина, имеющую нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает полипептидную последовательность человеческого элафина, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает часть полноразмерной полипептидной последовательности человеческого элафина, где указанная часть имеет нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает полипептидную последовательность человеческого элафина, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает домен WAP полноразмерной полипептидной последовательности человеческого элафина, где указанный домен WAP имеет нижеследующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах слитых белков серпин - элафин, указанный слитый белок включает полипептидную последовательность человеческого элафина, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах слитых белков серпин -