Полимерные белковые микрочастицы

Полимерные белковые микрочастицы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к получению композиции и применению белкового терапевтического средства пролонгированного действия. Конкретно, изобретение относится к получению композиции и применению множества покрытых полимером микрочастиц белка для пролонгированного и однородного высвобождения белка в физиологическую окружающую среду или среду на водной основе с течением времени.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пролонгированное высвобождение лечебного белка, введенного в биологическую мишень, такую как, например, сетчатка глаза или опухоль, или введенного парентерально, является желательным для лечения многочисленных различных состояний, включая злокачественные опухоли, сердечно-сосудистые заболевания, сосудистые заболевания, ортопедические болезни, стоматологические заболевания, раны, аутоиммунные заболевания, желудочно-кишечные болезни и глазные болезни. Биологически совместимые и биоразрушающиеся полимеры для контролируемой и пролонгированной доставки лекарственных препаратов используются в течение десятилетий. По мере того как полимер со временем разрушается, лечебный лекарственный препарат медленно высвобождается.

В случае внутриглазных терапевтических средств существует значительная нереализованная медицинская потребность в композиции пролонгированного действия для доставки белкового терапевтического средства эффективно в течение времени с насколько малым числом внутриглазных инъекций, насколько возможно. В случае других болезней, таких как рак, воспалительные заболевания и другие заболевания, существует потребность в улучшенных вживляемых композициях пролонгированного действия, содержащих белковые терапевтические средства.

Авторы заявки обнаружили, описывают здесь и заявляют способы получения и применения микрочастиц, содержащих биологически разрушающийся полимер и лечебный белок, которые способны равномерно высвобождать терапевтически эффективное количество лечебного белка в течение продолжительного периода времени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретение предлагает микрочастицу, включающую белок, покрытый полимером. В одном варианте осуществления микрочастица имеет диаметр приблизительно от 2 мкм до 70 мкм. В одном варианте осуществления микрочастица имеет диаметр приблизительно 15 мкм.

В одном варианте осуществления белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В одном варианте осуществления белок включает Fc домен. В одном варианте осуществления белок включает рецепторный домен. В одном варианте осуществления белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления белок представляет собой слитый белок-Fc-рецептор. В другом варианте осуществления белок представляет собой белок типа ловушки, который включает фрагмент когнатного рецептора и Fc домен. В одном особом варианте осуществления белок представляет собой белок ловушку-VEGF. В одном варианте осуществления белок ловушку-VEGF включает последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления полимер представляет собой биологически разрушаемый полимер. В некоторых вариантах осуществления полимер выбран из группы, состоящей из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA), сополимера полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолида (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарата, PLGA-альфа-токоферилсукцината, этерифицированного до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрида поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимера гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимера полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактона (PCL), полиалкилцианоакрилата (PAC), поли(этил)цианоакрилата (PEC), полиизобутилцианоакрилата, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутирата (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоата (PHA), поли-β-R-яблочной кислоты, полимеров фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерин, полисахаридов, целлюлозы, этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, альгинатов, декстрана и декстрановых полимерных гидрогелей, амилозы, инулина, пектина и гуаровой камеди, хитозана, хитина, гепарина, гиалуроновой кислоты, полиротаксанов и полипсевдоротаксанов на основе циклодекстрина (CD), полиаспартатов, полиглутаматов, полилейцина, сополимеров лейцин-глутамат, полибутиленсукцината (PBS), желатина, коллагенов, фибринов, фиброина, полиортоэфиров, сополимеров полиортоэфир-полиамидин, сополимеров полиортоэфир-диамин, полиортоэфиров, включающих латентные кислоты, сополимера полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинаций и сополимеров. В одном варианте осуществления полимер представляет собой поли-ε-капролактон (PCL) или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой PLGA или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой этилцеллюлозу или ее производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой полиортоэфир или его производное или сополимер.

В одном варианте осуществления микрочастица включает ядро микроизмельченного белка с размером меньше чем десять микрон и полимерный верхний слой. В одном варианте осуществления ядро микроизмельченного белка, по меньшей мере, на 50% покрыто полимером, означая, что не более чем 50% поверхности ядра микроизмельченного белка остается незащищенным. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или 100% поверхности ядра микроизмельченного белка покрыто полимером.

В одном варианте осуществления микрочастица с размером более чем 10 микрон включает (a) ядро микроизмельченного белка с размером менее чем 10 микрон, где белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF; и (b) полимерное покрытие, где полимер представляет собой любой один или более биосовместимый полимер, биологически разрушаемый полимер, биоразлагаемый полимер, полимолочную кислоту (PLA), полигликолевую кислоту (PGA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолид (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарат, PLGA-альфа-токоферилсукцинат, этерифицированный до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрид поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимер гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимер полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактон (PCL), полиалкилцианоакрилат (PAC), поли(этил)цианоакрилат (PEC), полиизобутилцианоакрилат, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутират (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоат (PHA), поли-β-R-яблочную кислоту, полимеры фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерин, полисахариды, целлюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, альгинаты, декстран и декстрановые полимерные гидрогели, амилозу, инулин, пектин и гуаровую камедь, хитозан, хитин, гепарин, гиалуроновую кислоту, полиротаксаны и полипсевдоротаксаны на основе циклодекстрина (CD), полиаспартаты, полиглутаматы, полилейцин, сополимеры лейцин-глутамат, полибутиленсукцинат (PBS), желатин, коллагены, фибрины, фиброин, полиортоэфиры, сополимер полиортоэфир-полиамидин, сополимеры полиортоэфир-диамин, полиортоэфиры, включающие латентные кислоты, сополимер полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинации и сополимеры.

В одном варианте осуществления микрочастица со средним диаметром приблизительно от 15 микрон до 30 микрон включает (a) ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от 10 до 12 микрон, где белок представляет собой белок ловушку-VEGF, и (b) полимерное покрытие, где полимер представляет собой любой один или более полимеров из группы, включающей PCL, PLGA, этилцеллюлозу и полиортоэфир и их сополимеры или производные.

В одном аспекте изобретение предлагает множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон и которые включают ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от двух микрон до 30 микрон, и полимерный верхний слой.

В одном варианте осуществления белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF. В одном варианте осуществления белок включает Fc домен. В одном варианте осуществления белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления белок представляет собой белок типа ловушки, который включает фрагмент когнатного рецептора и Fc домен. В одном особом варианте осуществления белок представляет собой белок ловушку-VEGF. В особом варианте осуществления белок ловушку-VEGF включает последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления полимер представляет собой биосовместимый полимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой биоразлагаемый полимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой биологически разрушаемый полимер. В некоторых вариантах осуществления полимер выбран из группы, состоящей из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA), сополимера полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолида (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарата, PLGA-альфа-токоферилсукцината, этерифицированного до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрида поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимера гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимера полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактона (PCL), полиалкилцианоакрилата (PAC), поли(этил)цианоакрилата (PEC), полиизобутилцианоакрилата, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутирата (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоата (PHA), поли-β-R-яблочной кислоты, полимеров фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерина, полисахаридов, целлюлозы, этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, альгинатов, декстрана и декстрановых полимерных гидрогелей, амилозы, инулина, пектина и гуаровой камеди, хитозана, хитина, гепарина, гиалуроновой кислоты, полиротаксанов и полипсевдоротаксанов на основе циклодекстрина (CD), полиаспартатов, полиглутаматов, полилейцина, сополимеров лейцин-глутамат, полибутиленсукцината (PBS), желатина, коллагенов, фибринов, фиброина, полиортоэфиров, сополимеров полиортоэфир-полиамидин, сополимеров полиортоэфир-диамин, полиортоэфиров, включающих латентные кислоты, сополимера полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинаций и сополимеров. В одном варианте осуществления полимер представляет собой поли-ε-капролактон (PCL) или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой PLGA или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой этилцеллюлозу или ее производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой полиортоэфир, включающий латентную кислоту.

В одном варианте осуществления ядро микроизмельченного белка большинства микрочастиц множества микрочастиц, по меньшей мере, на 50% покрыто полимером, означая, что не более чем 50% поверхности ядра микроизмельченного белка остается незащищенным. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или 100% поверхности ядра микроизмельченного белка покрыто полимером.

В одном варианте осуществления множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон, включает (a) ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от двух микрон до 30 микрон, где белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF; и (b) полимерный верхний слой, где полимер представляет собой любой один или более биосовместимый полимер, биологически разрушаемый полимер, биоразлагаемый полимер, полимолочную кислоту (PLA), полигликолевую кислоту (PGA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолид (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарат, PLGA-альфа-токоферилсукцинат, этерифицированный до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), поли-ε-капролактон (PCL), полиалкилцианоакрилат, полиангидрид поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимер гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимер полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли(этил)цианоакрилат (PEC), полиизобутилцианоакрилат, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутират (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоат (PHA), поли-β-R-яблочную кислоту, полимеры фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерин, полисахариды, целлюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, альгинаты, декстран и декстрановые полимерные гидрогели, амилозу, инулин, пектин и гуаровую камедь, хитозан, хитин, гепарин, гиалуроновую кислоту, полиротаксаны и полипсевдоротаксаны на основе циклодекстрина (CD), полиаспартаты, полиглутаматы, полилейцин, сополимеры лейцин-глутамат, полибутиленсукцинат (PBS), желатин, коллагены, фибрины, фиброин, полиортоэфиры, сополимер полиортоэфир-полиамидин, сополимеры полиортоэфир-диамин, полиортоэфиры, включающие латентные кислоты, сополимер полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинации и сополимеры.

В одном варианте осуществления множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон со средним размером приблизительно от 15 микрон до 30 микрон, включает (a) ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от двух микрон до 30 микрон со средним размером приблизительно от 10 микрон до 12 микрон, где белок представляет собой белок ловушку-VEGF; и (b) полимерный верхний слой, где полимер представляет собой любой один или более полимеров, выбранных из группы, включающей PLA, PCL, PLGA, этилцеллюлозу и полиортоэфир, и их сополимеры или производные.

В одном аспекте изобретение предлагает способ получения микрочастицы, которая включает ядро из белка и полимерный верхний слой. В одном варианте осуществления полученная микрочастица имеет диаметр приблизительно от двух микрон до 70 микрон или средний диаметр приблизительно от 15 микрон до 30 микрон. В одном варианте осуществления способ получения микрочастицы включает (1) получение частицы белка; (2) суспендирование частицы белка в растворе, включающем полимер и растворитель; и (3) удаление растворителя, в котором формируется частица, включающая ядро из белка, покрытое полимерным верхним слоем.

В одном варианте осуществления частица белка из стадии (1) представляет собой микроизмельченную частицу белка, которую получают распылительной сушкой раствора, включающего белок. В некоторых вариантах осуществления раствор белка подвергают распылительной сушке посредством обработки ультразвуком с одинарным наконечником, обработки ультразвуком с двойным наконечником или электрораспылением. В некоторых вариантах осуществления полученная в результате микроизмельченная частица белка, которая формирует ядро полученной микрочастицы, имеет диаметр приблизительно от двух микрон до 30 микрон со средним диаметром приблизительно от 10 микрон до 12 микрон.

В некоторых вариантах осуществления белок, который формирует ядро, представляет собой антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело (например, lgG) или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF. В особом варианте осуществления белок представляет собой ловушку-VEGF, включающую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления растворитель удаляют из стадии (3), создавая дисперсию смеси белок-полимер-растворитель из стадии (2) и давая возможность растворителю испариться из капель, созданных дисперсией. В одном варианте осуществления дисперсию создают распылительной сушкой, которую можно осуществить обработкой ультразвуком с двойным наконечником, обработкой ультразвуком с одинарным наконечником или электрораспылением. В одном варианте осуществления растворитель удаляют из капель, используя тепло или воздух, или химической экстракцией.

В одном варианте осуществления полимер является биологически разрушаемым, биоразлагаемым и/или биосовместимым. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой любой один или более полимеров, выбранных из группы, состоящей из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA), сополимера полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолида (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарата, PLGA-альфа-токоферилсукцината, этерифицированного до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрида поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимера гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимера полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактона (PCL), полиалкилцианоакрилата (PAC), поли(этил)цианоакрилата (PEC), полиизобутилцианоакрилата, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутирата (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоата (PHA), поли-β-R-яблочной кислоты, полимеров фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерина, полисахаридов, целлюлозы, этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, альгинатов, декстрана и декстрановых полимерных гидрогелей, амилозы, инулина, пектина и гуаровой камеди, хитозана, хитина, гепарина, гиалуроновой кислоты, полиротаксанов и полипсевдоротаксанов на основе циклодекстрина (CD), полиаспартатов, полиглутаматов, полилейцина, сополимеров лейцин-глутамат, полибутиленсукцината (PBS), желатина, коллагенов, фибринов, фиброина, полиортоэфиров, сополимера полиортоэфир-полиамидин, сополимеров полиортоэфир-диамин, полиортоэфиров, включающих латентные кислоты, сополимер полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинаций и сополимеров. В одном варианте осуществления полимер представляет собой поли-ε-капролактон (PCL) или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой PLGA или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой этилцеллюлозу или ее производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимер представляет собой полиортоэфир или его производное, который содержит кислотолабильные элементы. В другом варианте осуществления полимер представляет собой PLA.

В одном аспекте изобретение предлагает способ получения микрочастицы, включающий стадии (1) формирования микроизмельченной частицы белка, имеющей диаметр приблизительно от двух микрон до 30 микрон, причем средний диаметр составляет приблизительно от 10 микрон до 12 микрон, распылительной сушкой раствора, содержащего белок, где белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF (например, белок, имеющий последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 1); (2) суспендирования микроизмельченной частицы белка в растворе, включающем полимер и растворитель, где полимер представляет собой любой один или более полимер, выбранный из группы, включающей биологически разрушаемый полимер, биоразлагаемый полимер, биосовместимый полимер, полимолочную кислоту (PLA), полигликолевую кислоту (PGA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолид (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарат, PLGA-альфа-токоферилсукцинат, этерифицированный до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрид поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимер гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимер полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактон (PCL), полиалкилцианоакрилат (PAC), поли(этил)цианоакрилат (PEC), полиизобутилцианоакрилат, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутират (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоат (PHA), поли-β-R-яблочную кислоту, полимеры фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерин, полисахариды, целлюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, альгинаты, декстран и декстрановые полимерные гидрогели, амилозу, инулин, пектин и гуаровую камедь, хитозан, хитин, гепарин, гиалуроновую кислоту, полиротаксаны и полипсевдоротаксаны на основе циклодекстрина (CD), полиаспартаты, полиглутаматы, полилейцин, сополимеры лейцин-глутамат, полибутиленсукцинат (PBS), желатин, коллагены, фибрины, фиброин, полиортоэфиры, сополимеры полиортоэфир-полиамидин, сополимеры полиортоэфир-диамин, полиортоэфиры, включающие латентные кислоты, сополимер полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинации и сополимеры, и (3) удаления растворителя распылительной сушкой суспензии ''частица микроизмельченного белка-полимер-растворитель'' и отгонки растворителя с применением тепла или воздуха или экстракцией растворителем, где формируется микрочастица, имеющая диаметр приблизительно от двух микрон до 70 микрон, причем средний диаметр составляет приблизительно от 15 микрон до 30 микрон, и включающая ядро из белка и полимерный верхний слой.

В некоторых вариантах осуществления распылительную сушку из стадии (1) или стадии (3) осуществляют посредством обработки ультразвуком с двойным наконечником, обработки ультразвуком с одинарным наконечником или электрораспылением.

В одном варианте осуществления способ получения микрочастиц включает стадии (1) формирования микроизмельченной частицы ловушку-VEGF, имеющей диаметр приблизительно от 10 микрон до 12 микрон распылительной сушкой раствора, содержащего белок ловушку-VEGF; (2) суспендирования микроизмельченной частицы ловушку-VEGF в растворе, содержащем полиортоэфир, включающий латентную кислоту, и совместимый растворитель или этилцеллюлозу и совместимый растворитель; и (3) удаления растворителя (a) распылительной сушкой суспензии микроизмельченная частица ловушка-VEGF-полиортоэфир-латентная кислота-растворитель или суспензии микроизмельченная частица ловушка-VEGF-этилцеллюлоза-растворитель и (b) отгонкой растворителя с помощью тепла или воздуха или экстракцией растворителем, где формируется микрочастица, имеющая диаметр приблизительно от 15 микрон до 30 микрон и включающая ядро ловушку-VEGF и полимерный верхний слой из полиортоэфира и его сополимеров или производных.

В одном аспекте изобретение предлагает композицию пролонгированного действия, содержащую лечебный белок, для высвобождения или обеспечения стационарной концентрации лечебного белка с течением времени. Композиция пролонгированного действия включает множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон, каждая из которых включает ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от двух до 30 микрон, и полимерный верхний слой.

В одном варианте осуществления лечебный белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело (например, lgG) или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF (например, один из которых имеет первичную структуру SEQ ID NO: 1). В одном варианте осуществления лечебный белок включает Fc домен. В одном варианте осуществления белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления белок представляет собой lgG. В другом варианте осуществления лечебный белок представляет собой слитый белок-Fc-рецептор. В другом варианте осуществления лечебный белок представляет собой белок типа ловушки, который включает фрагмент когнатного рецептора и Fc домен. В одном особом варианте осуществления лечебный белок представляет собой белок ловушку-VEGF. В еще одном варианте осуществления ловушка-VEGF включает последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает биосовместимый полимер. В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает биоразлагаемый полимер. В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает биологически разрушаемый полимер. В некоторых вариантах осуществления полимерный верхний слой включает полимер, выбранный из группы, состоящей из полимолочной кислоты (PLA), полигликолевой кислоты (PGA), сополимера полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолида (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарата, PLGA-альфа-токоферилсукцината, этерифицированного до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрида поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимера гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимера полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактона (PCL), полиалкилцианоакрилата (PAC), поли(этил)цианоакрилата (PEC), полиизобутилцианоакрилата, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутирата (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоата (PHA), поли-β-R-яблочной кислоты, полимеров фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерина, полисахаридов, целлюлозы, этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, альгинатов, декстрана и декстрановых полимерных гидрогелей, амилозы, инулина, пектина и гуаровой камеди, хитозана, хитина, гепарина, гиалуроновой кислоты, полиротаксанов и полипсевдоротаксанов на основе циклодекстрина (CD), полиаспартатов, полиглутаматов, полилейцина, сополимеров лейцин-глутамат, полибутиленсукцината (PBS), желатина, коллагенов, фибринов, фиброина, полиортоэфиров, сополимера полиортоэфир-полиамидин, сополимеров полиортоэфир-диамин, полиортоэфиров, включающих латентные кислоты, сополимера полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинаций и сополимеров. В одном варианте осуществления полимер представляет собой поли-ε-капролактон (PCL) или его производное или сополимер. В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает PLGA. В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает этилцеллюлозу. В одном варианте осуществления полимерный верхний слой включает один или более полимеров, выбранных из группы, включающей PLA, PLGA, этилцеллюлозу и полиортоэфир, и их сополимеры или производные.

В одном варианте осуществления множество микрочастиц включает группу микрочастиц, имеющих некоторый диапазон толщин полимерного верхнего слоя, так что индивидуальные микрочастицы из группы микрочастиц разрушаются с различными скоростями, что дает возможность однородной скорости высвобождения лечебного белка.

В одном варианте осуществления множество микрочастиц включает смесь непокрытых микроизмельченных частиц белка и микрочастиц, имеющих некоторый диапазон толщин полимерного верхнего слоя, что дает возможность высвобождения лечебного белка с периодическими интервалами, исходя из толщины верхнего слоя.

В одном варианте осуществления множество микрочастиц включает смесь микрочастиц, имеющих полимерный верхний слой с различными уровнями гидрофобности, чтобы контролировать время или продолжительность деструкции и последующего высвобождения. В одном варианте осуществления каждая из микрочастиц включает внутренний полимерный слой и внешний полимерный слой, где внешний полимерный слой ограничивает гидратацию внутреннего полимерного слоя, чтобы контролировать высвобождение лечебного белка.

В одном варианте осуществления лечебный белок высвобождается из множества микрочастиц со скоростью приблизительно от 0,01 мг/неделю до 0,30 мг/неделю в течение, по меньшей мере, 60 дней, когда микрочастицы находятся в водной среде. В одном варианте осуществления водная среда представляет собой буферный раствор in vitro. В одном варианте осуществления водная среда представляет собой среду in vivo. В одном варианте осуществления водная среда представляет собой среду ex vivo. В одном варианте осуществления водная среда представляет собой стекловидное тело.

В одном варианте осуществления композиция пролонгированного действия включает множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон, и которые включают (a) ядро микроизмельченного лечебного белка с размером приблизительно от двух микрон до 30 микрон, где лечебный белок представляет собой антигенсвязывающий белок, который в некоторых случаях может представлять собой любой один или более белков, выбранных из группы, включающей антитело или фрагмент антитела, рецептор или его растворимый фрагмент, растворимый фрагмент рецептора Т-клетки, растворимый фрагмент MHC, слитый белок-Fc-рецептор, белок типа ловушки и белок ловушку-VEGF; и (b) полимерный верхний слой с некоторым широким диапазоном толщины, где полимер представляет собой любой один или более биосовместимый полимер, биологически разрушаемый полимер, биоразлагаемый полимер, полимолочную кислоту (PLA), полигликолевую кислоту (PGA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), поли-D,L-лактид-со-гликолид (PLGA), PLGA-этиленоксидфумарат, PLGA-альфа-токоферилсукцинат, этерифицированный до полиэтиленгликоля 1000 (PLGA-TGPS), полиангидрид поли[1,6-бис(п-карбоксифенокси)гексана] (pCPH), сополимер гидроксимасляной кислоты с гидроксивалериановой кислотой (PHB-PVA), сополимер полиэтиленгликоль-полимолочная кислота (PEG-PLA), поли-ε-капролактон (PCL), полиалкилцианоакрилат (PAC), поли(этил)цианоакрилат (PEC), полиизобутилцианоакрилат, поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламид (поли(HPMA)), поли-β-R-гидроксибутират (PHB), поли-β-R-гидроксиалканоат (PHA), поли-β-R-яблочную кислоту, полимеры фосфолипид-холестерин, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин/полиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламин (DOPC/PEG-DSPE)/холестерин, полисахариды, целлюлозу, этилцеллюлозу, метилцеллюлозу, альгинаты, декстран и декстрановые полимерные гидрогели, амилозу, инулин, пектин и гуаровую камедь, хитозан, хитин, гепарин, гиалуроновую кислоту, полиротаксаны и полипсевдоротаксаны на основе циклодекстрина (CD), полиаспартаты, полиглутаматы, полилейцин, сополимеры лейцин-глутамат, полибутиленсукцинат (PBS), желатин, коллагены, фибрины, фиброин, полиортоэфиры, сополимер полиортоэфир-полиамидин, сополимеры полиортоэфир-диамин, полиортоэфиры, включающие латентные кислоты, сополимер полиэтиленгликоль/полибутилентерефталат и их комбинации и сополимеры, где микрочастицы высвобождают или обеспечивают стационарную концентрацию лечебного белка при скорости приблизительно от 0,01 мг/неделю до 0,30 мг/неделю в течение, по меньшей мере, 60 дней.

В одном варианте осуществления композиция пролонгированного действия включает множество микрочастиц, размер которых находится в диапазоне приблизительно от двух микрон до 70 микрон, причем средний размер составляет приблизительно от 15 микрон до 30 микрон, и которые включают (a) ядро микроизмельченного белка с размером приблизительно от двух микрон до 30 микрон, причем средний размер составляет приблизительно от 10 микрон до 12 микрон, где белок представляет собой белок ловушку-VEGF; и (b) полимерный верхний слой с некоторым диапазоном толщины, где полимер представляет собой любой один или более полимеров из группы PLGA, этилцеллюлозы и полиортоэфира, и их сополимеров и производных, так что в водной среде микрочастицы высвобождают или обеспечивают стационарную концентрацию белка ловушку-VEGF при скорости приблизительно 0,06±0,02 мг/неделю в течение, по меньшей мере, 60 дней.

В одном аспекте изобретение предлагает способ модуляции высвобождения белка. В одном варианте осуществления способ включает стадию получения множества микрочастиц, как описано в предшествующем аспекте, после чего следует стадия помещения микрочастиц в растворитель. Растворитель в некоторых вариантах осуществления является водным. Растворитель может быть in vitro, например, в фосфатном забуференном растворе. Растворитель может быть in vivo, таким как, например, стекловидное тело.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 показывает относительное количество (% объемные) частиц белка без полимерного верхнего слоя данного диаметра (ECD (мкм)) в совокупности частиц белка, полученных из 50 мг/мл белка ловушку-VEGF, 25 мг/мл белка ловушку-VEGF и 25 мг/мл белка ловушку-VEGF плюс 0,1% полисорбата 80.

Фиг. 2 показывает относительное количество (% объемные определенные микропотоковой визуализацией (MFI)) микрочастиц заданного диаметра ((ECD (мкм)) в совокупности микрочастиц, полученных из 50 мг/мл белка ловушку-VEGF плюс 50 мг/мл POE, 250 мг/мл POE и 50 мг/мл EC.

Фиг. 3 показывает количество белка ловушку-VEGF в миллиграммах, высвобожденного из микрочастиц, полученных из 50 мг/мл POE, 250 мг/мл POE или 50 мг/мл EC в течение приблизительно 60 дней.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Микрочастица и частица белкового ядра по настоящему изобретению являются в общих чертах сферическими по форме. Некоторые микрочастицы и ядра из белка будут приближаться к сферичности, в то время как другие будут более неправильными по форме. Таким образом, используемый здесь термин ”диаметр” обозначает каждое и любое из нижеследующего: (a) диаметр сферы, которая окружает микрочастицу или ядро из белка, (b) диаметр наиболее большой сферы, которая попадает внутрь границ микрочастицы или ядра из белка, (c) любое измерение между описывающей сферой из (a) и ограничивающей сферой из (b), включая среднее значение между данными двумя величинами, (d) длину наиболее длинной оси микрочастицы или ядра из белка; (e) длину наиболее короткой оси микрочастицы или ядра из белка, (f) любое измерение между длиной длинной оси (d) и длиной короткой оси (e), включая среднее значение между данными двумя величинами, и/или (g) эквивалентный круговой диаметр (”ECD”), определенный микропотоковой визуализацией (MFI), анализом траекторий движения наночастиц (NTA) или методами исследования частиц с применением светотени, таким как динамическое светорассеяние (DSL). В общих чертах, см.

Диаметр обычно выражают в микрометрах (мкм или микронах). Диаметр можно определить оптическим измерением.

”Микроизмельченная частица белка” или ”частица белка” обозначает частицу, содержащую множество молекул белка с низкими, очень низкими или близкими к нулю количествами воды (например, <3% воды по массе). При применении в настоящем описании микроизмельченная частица белка обычно является сферической по форме и имеет ECD, находящийся в диапазоне от 2 микрон до приблизительно 35 микрон. Микроизмельченная частица белка не ограничивается какой-либо конкретной белковой структурной единицей и подходит для приготовления и доставки лечебного белка. Обычные лечебные белки включают, помимо прочего, антигенсвязывающие белки, такие как, например, растворимые фрагменты рецептора, антитела (включа