Способ профилактики ишемии головного мозга

Способ профилактики ишемии головного мозга

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и неврологии.

По известным литературным источникам – ишемический инсульт или инфаркт мозга является основной патологией среди тяжелых форм сосудистых поражений мозга. В России данная патология занимает первое место, как причина потери трудоспособности, а второе место в структуре общей смертности (Мельникова Е.В. Нейропротекция при ишемии головного мозга [Текст] / Е.В. Мельникова, А.А. Шмонин // Фарматека. – 2012. - №9. – С. 36-42).

Профилактику и коррекцию ишемии головного мозга теоретически возможно осуществить с помощью фармакологического прекондиционирования, суть которого состоит в активации эндогенных защитных механизмов, снижающих степень повреждения при последующем длительном ишемическом эпизоде (Должикова И. Н. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование с использованием эритропоэтина и тадалафила при экспериментальной ишемии почек: диссертация кандидата биологических наук: 14.03.06 / И.Н. Должикова. – Белгород). Перспективным для изучения прекондиционирующего действия при ишемии головного мозга является ингибитор фосфодиэстеразы-5, тадалафил.

Известно техническое решение «Средство для профилактики или лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, применение и способ лечения» (RU № 2468813, публ. 10.12.2012), которое содержит фармацевтическую композицию, включающую в качестве активных компонентов метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин и холина альфосцерат при следующем соотношении компонентов, в мас.%: метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин 0,01-2,00; холина альфосцерат 98,00-99,99. Раскрыто также применение указанной фармацевтической композиции для изготовления средства и способ лечения.

Основным недостатком способа является то, что модель ишемии головного мозга не является специфичной для многих видов исследований, связанных с нарушением кровообращения головного мозга. Помимо этого, использование данной шкалы оценки неврологического дефицита McGraw не всегда информативно. В связи с широкой вариабельностью анатомии артериального русла, бассейнов, внутренней и внешней сонной артерии необходимо исключить возможность коллатерального питания головного мозга в эксперименте.

Известно техническое решение «Способ лечения церебральной ишемии» (RU № 2281765, публ. 20.08.2006). Сущность изобретения состоит в том, что в способе лечения церебральной ишемии на ее модели у млекопитающего животному вводят количества янтарнокислого бис[(2-гидроксиэтил)-N,N,N-триметиламиния]. Эффект снижения гибели нейронов мозга при введении янтарнокислого бис[(2-гидроксиэтил)-N,N,N-триметиламиния] оценивали на модели крыс с хронической ишемией мозга, вызванной перевязкой сонных артерий. Характер и механизм повреждения нейронов мозга в этой модели соответствует наблюдаемой при ишемическом инсульте. Гибель нейронов мозга оценивали количественно методом ЯМР 1Н in vivo по снижению уровня нейронального маркера N-ацетиласпартата (NAA) в мозге. NAA является хорошо известным неинвазивным маркером целостности нейронов. NAA обнаруживается исключительно в нейронах. Снижение NAA или отношения NAA к креатину (относительный уровень NAA) строго коррелирует с потерей нейронов при их повреждении или дегенерации. (Demougeot С et al. J Neurochem. 2004 90 (4): 776-83. Roitberg В et al. Neurol Res. 2003 25 (1): 68-78. Schuhmann MU et al. J Neurotrauma. 2003 20(8):725-43). Перевязка сонных артерий была выполнена у крыс самцов линии Wistar за 3 часа до первой инъекции. Далее крысам в течение семи дней вводили и.п. инъекции физ. р-ра (контроль), 1 мг/кг или 50 мг/кг янтарнокислого бис[(2-гидроксиэтил)-N,N,N-триметиламиния]. На 15 день с момента перевязки измеряли уровень NAA в мозге методом ЯМР 1Н in vivo.

Основным недостатком способа является то, что ЯМР 1Н in vivo очень дорогостоящий метод диагностики. Не всегда есть возможность его проведения.

Задачей предлагаемого изобретения является способ профилактики ишемии головного мозга, включающий ингибитор фосфодиэстеразы-5, тадалафил, в качестве прекондиционирующего агента.

Задача достигается тем, в способе, включающем воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение лабораторному животному тадалафила в дозе 1 мг/кг, который вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд в качестве прекондиционирующего агента, а через 60 минут проводят моделирование ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.

Механизм церебропротективного действия тадалафила, как иФДЭ-5, заключается в воздействии на путь NO- цГМФ- протеинкиназа G. При активизации ПК- G происходит фосфорилирование К+ каналов, снижение чувствительности мембраны по отношению к нервным импульсам и ее гиперполяризация. Далее происходит снижение концентрации свободного Ca+2 цитоплазмы. Эти механизмы являются основой вазодилатирующих эффектов оксида азота. Главную роль в этом механизме играет фосфодиэстераза-5. Именно она уменьшает накопление цГМФ (Должикова И. Н. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование с использованием эритропоэтина и тадалафила при экспериментальной ишемии почек: диссертация кандидата биологических наук: 14.03.06 / И.Н. Должикова. – Белгород).

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:

- в качестве прекондиционирующего агента вводят однократно тадалафила в дозе 1 кг/кг за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно, за счет этого через 30 мин (первое защитное окно) после введения открываются АТФ-зависимые К+-каналы, что в последующем приводит к повышению резистентности тканей головного мозга, через 12-48 ч после введения тадалафила открывается 2 защитное окно, в котором эффект прекондиционирования реализуется в том числе за счет действия оксида азота (NO) и дальнейшего включения механизмов метаболической адаптации;

- эффективность препарата оценивается комплексно: исследуется неврологический дефицит животного, поведенческий статус, уровень двух специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE, проводится гистологическое и морфометрическое исследование.

- с помощью электрофизиологического метода производится контроль правильно выполненной модели патологии.

Способ приводит к выраженной коррекции ишемии головного мозга, так как тадалафил в данной дозе открывает АТФ-зависимые К+-каналы и в дальнейшем индуцирует механизмы метаболической адаптации, за счет чего реализуется эффект прекондиционирования.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Исследование выполнено на 50 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 230-260 г. Экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1) интактную (n=10), 2) ложнооперированную, 3) группу с двухсосудистой патологией (n=10), 4) группу с четырехсосудистой патологией (n=10), 5) группу с четырехсосудистой патологией и коррекцией тадалафилом (1 мг/кг, в/б), (n=10). Животные содержались в стандартных условиях вивария НИУ «БелГУ» со свободным доступом к еде и воде. Содержание животных и постановка эксперимента проводилась в соответствии с требованием приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г. и №267 РФ от 19.06.2003 г., а также международным правилам «Guide for the Care and of Laboratory Animals».

Животным 3 группы моделировали двухсосудистую локальную ишемию: на 4 минуты перекрывали кровоток в общих сонных артериях. Крысам 4 группы была смоделирована тотальная четырехсосудистая ишемия головного мозга с ишемическим периодом 4 минуты. Животным 5 группы за 60 минут до моделирования тотальной ишемии, внутрижелудочно вводили ингибитор фосфодиэстеразы-5, тадалафил, в дозе 1 мг/кг. Наркотизацию животных проводили препаратом «Золетил 100» 60 мг/мл и хлоралгидрат 150 мг/мл. Контроль верно выполненной методики осуществляли с помощью регистрации животным электроэнцефалограммы. Животных выводили из эксперимента через 72 часа с момента его начала, путем передозировки наркозных препаратов.

О выраженности противоишемического эффекта судили по тяжести неврологического дефицита, поведенческого статуса, уровню специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE, анализу гистологического и морфометрического состояния срезов головного мозга.

При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при p<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Оценку неврологического дефицита у животных осуществляли на 1, 3, 7 и 14 сутки после моделирования патологии с помощью бальной шкалы по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) (по среднему значению балла в группе) (Табл. 1), за контроль принимали группу интактных животных, которая статистически не отличалась от ложнооперированных:

Таблица 1

Динамика тяжести неврологических нарушений в исследуемых группах по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) (по среднему значению балла в группе) (М±m; n=10).

Период	Группы
интактные	ЛО	2-сос. 4-минутная ИГМ	4-сос. 4-минутная ИГМ	иФДЭ -5 +ИГМ
1 сутки	0	0	0,2±0,08*	2,05±0,49*	0,8±0,21*
3 сутки	0	0	0	1±0,42*	0,75±0,23*
7 сутки	0	0	0	1±0,44*	0,4±0,15*
14 сутки	0	0	0	0,4±0,44*	0,2±0,13*

Примечание: здесь и везде далее *- p<0,05, #- p>0,05 по отношению к контрольной группе крыс.

У крыс после 2-сосудистой ишемии головного мозга продолжительностью 4 минуты на первые сутки наблюдался легкий неврологический дефицит. Это проявлялось в вялости конечностей и замедленности движений и статистически не отличалось от группы ложнооперированных животных (p>0,05). На 3, 7 и 14 сутки неврологическая симптоматика отсутствовала. На первые сутки после моделирования ИГМ неврологический дефицит у крыс с 4-сосудистой моделью и ишемическим периодом продолжительностью 4 минуты был со средней степенью тяжести (p<0,05): у 100% крыс наблюдали вялость и замедленность движений, у 50% крыс был односторонний полуптоз правого глаза, у 10% двусторонний полуптоз, у 20% крыс наблюдался паралич задней левой лапы, тремор. Вялость и замедленность движений к 3 дню после моделирования патологии исчезали. На 3, 7, 14 сутки сохранялся паралич задней левой конечности и полуптоз правого глаза. Неврологический дефицит, у группы крыс на фоне коррекции фармакологическим прекондиционированием тадалафилом, был с более легкой симптоматикой по сравнению с группой животных с ИГМ без введения препарата (p<0,05): у 40% крыс наблюдали вялость и замедленность движений, у 60%- односторонний полуптоз правого глаза. Вялость и замедленность движений у животных к 3 дню после моделирования патологии исчезали. На 3, 7, 14 сутки сохранялся полуптоз правого глаза. По сравнению с контрольной группой, животные этой группы были значительно активнее даже в первые сутки после моделирования патологии.

Поведенческий статус крыс оценивали с помощью теста приподнятого крестообразного лабиринта. Оценивались такие параметры, как суммарное время нахождения в темном рукаве, светлом, а также количество стоек и свешиваний (Табл. 2):

Таблица 2

Оценка поведенческой активности животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (М±m; n=10).

Критерий	Группы
Интактные	ЛО	2-сос. 4-минутная ИГМ	4-сос. 4-минутная ИГМ	иФДЭ -5 +ИГМ
Темный рукав, t	154,4±4,5	156,2±4#	158,1±4,1#	170±1,5*	159±2,3*
Светлый рукав, t	26,6±4,3	23,8±4#	22,9±3,9#	10±1,5*	20,7±2,1*
Стойки, шт.	10,5±0,9	10,1±0,8#	7,9±0,6*	4,3±0,4*	7,7±0,8*
Свешивания, шт.	4,8±0,7	4,4±0,7#	3,3±0,3*	1,6±0,3*	3,6±0,6*

В 2-сосудистой 4-минутной модели патологии у животных наблюдалось небольшое снижение горизонтальной активности, вертикальной активности, что проявлялось в уменьшении количества стоек и свешиваний. Снижалось ориентировочно-исследовательское поведение, статистически значимо (p<0,05). В группе с 4-сосудистой 4-минутной ИГМ у животных наблюдалось значительное снижение горизонтальной активности, увеличение времени пребывания в темных рукавах. Снижение вертикальной активности проявлялось в снижении стоек, свешиваний приблизительно на 60%. Сохраняется минимальное ориентировочно - исследовательское поведение(p<0,05). В поведенческом тесте ПКЛ группа крыс с ИГМ и коррекцией тадалафилом проявляла себя более активно по сравнению с контрольной группой. Это проявлялось в увеличении горизонтальной и вертикальной активности (Табл. 2), что отражалось в большем количестве стоек и свешиваний (p<0,05). Ориентировочно - исследовательское поведение снижено, но не значительно.

Двигательная активность животных оценивалась с помощью теста актиметрии с инфракрасным мониторированием активности IR Actimeter (Табл. 3).

Таблица 3

Оценка поведенческой активности животных в тесте актиметрии (М±m; n=10).

Критерии	Группы
интактные	ЛО	2-сос. 4-минутная ИГМ	4-сос. 4-минутная ИГМ	иФДЭ -5 +ИГМ
Общая активность	939,9±40,5	851±49#	595,7±40,17*	406,9±59*	553,3±28,26*
Стереотипы движения	77,5±4,04	72,4±5,34#	42±2,83*	29,0±2,05*	35,7±2,31*
Максимальная скорость	42,1±2,41	36,6±1,80#	27,74±1,78*	22,01±2,09*	24,89±1,85*
Общая дистанция	2261,8±104,55	1797,47±103,20#	1290,52±93,09*	772,3±52,27*	1190,61±105,28*
Время отдыха	89,66±7,54	111,71±10,37#	155,41±8,87*	196,39±7,21*	159,5±8,61*

При оценке двигательной активности животных в тесте актиметрии с инфракрасным мониторированием активности IR Actimeter установлено, что активность ложнооперированных крыс по сравнению с интактными снижалась, но статистически незначимо (p>0,05). С увеличением времени ишемического периода в эксперименте активность крыс падает: уменьшается общая активность, количество стереотипных движений, максимальная скорость, общая дистанция. Время отдыха с увеличением времени ишемии головного мозга возрастает (Табл. 3). При сравнении двигательной активности животных контрольной группы с группой тадалафилом в тесте актиметрии на инфракрасном мониторе активности IR Actimeter установлено, что активность крыс с предварительным введением препарата выше(p<0,05).

Далее осуществляли оценку уровня специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE в данных группах (Табл. 4) .

Таблица 4

Концентрация маркеров повреждения головного мозга в плазме животных на 3-е сутки (М±m; n=10).

интактные	ЛО	2-сос. 4-минутная ИГМ	4-сос. 4-минутная ИГМ	иФДЭ -5 +ИГМ
S100b	NSE	S100b	NSE	S100b	NSE	S100b	NSE	S100b	NSE
0,77±0,21	0,365±0,36	0,95±0,18	0,38±0,23	1,498±1,04	0,434±0,29	2,03±0,33*	0,547±0,22*	0,585±0,30#	0,212±0,31#

При анализе уровня S100b и NSE у животных всех экспериментальных групп наблюдали повышение концентрации маркеров в сыворотке крови. Статистически незначимо (p>0,05) повышение концентрации маркеров наблюдали у ложнооперированных животных (гипотетически связано с оперативным вмешательством и действием общего наркоза на организм), при двухсосудистой 4-минутной ИГМ. Статистически значимо (p<0,05) повышение концентрации было в группе с четырехсосудистой 4-минутной и ИГМ. При анализе уровня S100b и NSE у животных группы с ИГМ с предварительной коррекцией тадалафилом наблюдали снижение концентрации маркеров повреждения даже ниже уровня контрольной группы (p>0,05).

При обзорной микроскопии у интактных животных полученные результаты соответствовали описаниям цитоархитектонических особенностей лобной доли и гиппокампа. Нейроны были преимущественно пирамидной, округлой или многоугольной формы, с крупными округлыми ядрами и мелкозернистой цитоплазмой. У многих нейронов базофильная субстанция цитоплазмы имела вид крупных глыбок, расположенных периферически. В некоторых нейронах четко определялись одно или два центрально расположенных ядрышка (Фиг. 1), где: А - лобная доля интактной крысы, X 100, окр. гематоксилин+эозин; Б – гиппокамп интактной крысы, X 400, окр. гематоксилин+эозин.

Область лобной доли характеризовалась низкой плотностью расположения, а область СА1 гиппокампа высокой плотностью, средних по размеру, нейронов. Морфометрические изменения нейронов при двухсосудистой модели ишемии имели общую тенденцию к увеличению и характеризовались увеличением максимально и минимального диаметров перикарионов, их периметра и площади. Диаметр, площадь и периметр ядер нейронов также увеличивались. Общее количество гиперхромных нейронов составило 36,7%, а двуядрышковых - 16,7% (Табл. 5). Изменения аналогичных показателей в области СА1 гиппокампа были менее значительны, однако общая тенденция к их увеличению прослеживалась (Табл. 6). Качественные изменения характеризовались увеличением количества гиперхромных нейронов, хроматолизом, умеренной дезорганизацией слоев в области СА1. Тела клеток теряли четкость контуров, деформировались. Ядерные изменения были полиморфными и проявлялись как набуханием, так и пикнозом отдельных ядер. В некоторых нейронах наблюдалось смещение ядра на периферию перикариона. Увеличение количества двуядрышковых нейронов в сочетании с общим увеличением площади ядра и перикариона является морфологическим проявлением регенераторных процессов и повышением их функциональной активности, возникающих в ответ на локальную ишемию головного мозга (Фиг. 2 - двухсосудистая модель ишемии головного мозга), где: А - лобная доля, окр. гематоксилин+эозин; Б – СА1 область гиппокампа, окр. тионином по Нисслю, X 400.

При четырехсосудистой модели ишемии отмечалась выраженная гиперхромия нейронов лобной доли с периваскулярным и перицеллюлярным отеком. Форма клеток была, преимущественно, многоугольной, вытянутой, ядра во многих из них не определялись. Капилляры паретически расширены, полнокровны. В области СА1 гиппокампа наблюдалась дезорганизация нейрональных слоев, хроматолиз, набухание и пикнотические изменения ядер, двуядрышковые нейроны практически не определялись (Фиг. 3 - четырехсосудистая модель ишемии головного мозга), где: А - лобная доля, X 400, окр. гематоксилин+эозин; Б – СА1 область гиппокампа, X 400, окр. тионином по Нисслю.

При введении за час до моделирования четырехсосудистой патологии тадалафила в дозе 1 мг/кг, морфологические изменения нейронов носили, преимущественно, некробиотический характер. Количество погибших нейронов было значительно ниже, чем без коррекции тадалафилом. В гиппокампе нарушение стратификации слоев носили умеренный характер (Фиг. 4 - четырехсосудистая модель ишемии головного мозга при коррекции тадалафилом), где: А - лобная доля, X 100, окр. гематоксилин+эозин; Б – гиппокамп, X 400, окр. гематоксилин+эозин.

При статистическом исследовании установлено, что ишемическое повреждение нейронов, и лобной доли, и гиппокампа достоверно более выражены в группе с четырехсосудистой моделью ишемии мозга без коррекции тадалафилом. Достоверно отличались минимальный диаметр, периметр и площадь нейронов, диаметр, периметр и площадь ядер (p<0.05). Количество двуядрышковых нейронов достоверно больше при коррекции тадалафилом (p<0.05), что отражает функциональное состояние нейронов, их большую активность и способность к регенеративным и репаративным процессам. Достоверных отличий не обнаружено при измерении максимального диаметра ядер нейронов (p>0.05).

Таким образом, при двухсосудистой модели ишемии головного мозга крыс отмечались умеренные некробиотические изменения с признаками активации регенераторных процессов как в нейронах лобной доли, так и гиппокампа. При четырехсосудистой модели ишемии повреждения большинства нейронов были необратимы, без признаков активации репаративных процессов. Коррекция ишемического повреждения тадалафилом показала статистически достоверное повышение устойчивости нейронов лобной доли и СА1 области гиппокампа к гипоксии и ишемии, достоверное снижение количества погибших нейронов и большую активность репаративных процессов.

Таблица 5

Морфометрическая характеристика нейронов лобных долей головного мозга крыс (М±m; n=30).

Параметры	интактные	2-сосудистая ИГМ	4-сосудистая ИГМ	иФДЭ-5+ИГМ
Маx D	12,51±0,29	13,23±0,42#	13,54±0,63#	8,57±0,35#
Min D	8,46±0,28	10,41±0,40*	6,58±0,21*	5,62±1,51*
Периметр клетки	35,87±0,90	41,58±1,27*	38,60±1,38*	23,83±4,46*
S клетки	83,33±3,25	120,48±5,81*	75,45±3,62*	40,67±1,28*
Периметр ядра	21,98±0,89	29,68±1,01*	23,58±0,65*	16,38±1,89*
S ядра	35,08±2,21	58,61±4,21*	38,90±2,02*	20,56±0,39*
D Ядра	6,28±0,24	9,15±0,42*	7,37±0,24*	5,64±0,11*
D Ядрышка	1,88±0,07	Гипохромные нейроны- (46,7%) 2,65±0,50Гиперхромные-(36,7%)Двуядрышковые-(16,7%)-2,40±0,24	Гипохромные нейроны- (10%)1,67±0,18Гиперхромные-(90%)Двуядрышковые-	Гипохромные нейроны-(43,4%) 1,63±0,16Гиперхромные-(43,4%)Двуядрышковые- (13,2%)1,26±0,10

Примечание: *-при (p<0.05), #- при (p>0.05). За контроль принимали гр. интактных животных. В группе «иФДЭ-5+ИГМ» - гр. крыс с четырехсосудистой ИГМ.

Таблица 6

Морфометрическая характеристика нейронов гиппокампа крыс (М±m; n=30).

Параметры	интактные	2-сосудистая ИГМ	4-сосудистая ИГМ	иФДЭ-5+ИГМ
Маx D	11,85±0,29	13,64±0,16*	11,38±0,16#	8,49±0,21*
Min D	8,03±0,28	6,90±0,20*	6,34±0,20*	5,70±0,78*
Периметр клетки	33,01±0,80	37,22±0,34*	30,40±0,34*	24,30±2,30*
S клетки	68,90±2,63	77,14±2,63*	57,71±1,76*	38,94±0,81*
Периметр ядра	22,66±0,72	27,11±0,47*	20,86±0,47*	17,31±1,28*
S ядра	38,06±2,50	50,41±1,25*	29,96±1,25*	20,98±0,26*
D Ядра	6,23±0,26	6,47±0,25#	7,09±0,25*	5,56±0,07*
D Ядрышка	2,38±0,07	Гипохромные нейроны-Гиперхромные-(86,7%)Двуядрышковые-(13,3%)-2,03±0,11	Гипохромные-Гиперхромные-(90%)Двуядрышковые-(10%)- 1,83±0,23	Гипохромные нейроны-Гиперхромные-(90%)Двуядрышковые-(10%)- 1,83±0,23

Примечание: *-при (p<0.05), #- при (p>0.05). За контроль принимали гр. интактных животных. В группе «иФДЭ-5+ИГМ» - гр. крыс с четырехсосудистой ИГМ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженной коррекции ишемических повреждений головного мозга в условиях тотальной четырехсосудистой модели ишемии головного мозга крыс иФДЭ-5, тадалафилом в дозе 1 мг/кг массы тела животного при однократном внутрижелудночном введении.

Способ профилактики ишемии головного мозга, включающий воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение лабораторному животному тадалафила в дозе 1 мг/кг, который вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд в качестве прекондиционирующего агента, а через 60 минут проводят моделирование ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.