Регуляторные элементы растений и их применение

Регуляторные элементы растений и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная заявка заявляет приоритет Предварительной заявки Соединенных штатов № 61/467875, поданной 25 марта 2011 года, которая включена в настоящее изобретение посредством ссылки в ее полном виде.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Список последовательностей, который содержится в файле, названном "MONS282WO_seq.txt", который равен 347 килобайтам (как измерено в Microsoft Windows®) и создан 21 марта 2012 года, зарегистрирован в настоящем изобретении электронным представлением и включен в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ДАННОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[003] Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии растений и генетической инженерии растений и ДНК-молекулам, применимым для модуляции экспрессии генов в растениях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Регуляторные элементы являются генетическими элементами, которые регулируют активность модуляции транскрипции функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Такие элементы включают в себя промоторы, лидеры, интроны и 3’-нетранслируемые районы и применимы в области молекулярной биологии растений и генетической инженерии растений.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] Настоящее изобретение обеспечивает новые регуляторные элементы генов для применения в растениях. Настоящее изобретение обеспечивает также ДНК-конструкты, содержащие эти регуляторные элементы. Настоящее изобретение обеспечивает также трансгенные клетки растений, растения и семена, содержащие эти регуляторные элементы. Эти последовательности могут быть функционально связаны с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В одном варианте осуществления, эта транскрибируемая полинуклеотидная молекула может быть гетерологичной относительно обеспеченной настоящим изобретением регуляторной последовательности. Таким образом, последовательность регуляторных элементов, обеспеченная настоящим изобретением, может быть, в конкретных вариантах осуществления, определена как функционально связанная с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. Настоящее изобретение обеспечивает также способы изготовления и применения этих регуляторных элементов, ДНК-конструктов, содержащих эти регуляторные элементы, и трансгенных клеток растений, растений и семян, содержащих эти регуляторные элементы, функционально связанные с транскрибируемой полинуклеотидной молекулой.

[006] Таким образом, в одном аспекте, это изобретение обеспечивает молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: a) последовательности по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; и c) фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-158 и 180-183, где этот фрагмент имеет ген-регуляторную активность; где эта последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В конкретных вариантах осуществления, эта молекула ДНК содержит по меньшей мере приблизительно 90-процентную, по меньшей мере приблизительно 95-процентную, по меньшей мере приблизительно 98-процентную или по меньшей мере приблизительно 99-процентную идентичность последовательности с последовательностью ДНК любой из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183. В некоторых вариантах этой молекулы ДНК, эта последовательность ДНК содержит регуляторный элемент. В некоторых вариантах осуществления этот регуляторный элемент содержит промотор. В конкретных вариантах осуществления, эта гетерологичная транскрибируемая полинуклеотидая молекула содержит представляющий агрономический интерес ген, такой как ген, способный обеспечивать устойчивость к гербицидам в растениях, или ген, способный обеспечивать устойчивость к вредителям в растениях.

[007] Настоящее изобретение обеспечивает также клетку трансгенного растения, содержащую гетерологичный ДНК-конструкт, обеспечиваемый изобретением, включающий в себя последовательность любой из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183, или ее фрагмент или вариант, где указанная последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В некоторых вариантах осуществления, эта клетка трансгенного растения является клеткой однодольного растения. В других вариантах осуществления, эта клетка трансгенного растения является клеткой однодольного растения.

[008] Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает трансгенное растение, или его часть, содержащие обеспеченную здесь ДНК-молекулу, включающую в себя последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: a) последовательности по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; и c) фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-158 и 180-183, где этот фрагмент имеет ген-регуляторную активность; где эта последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой. В конкретных вариантах осуществления, это трансгенное растение может быть растением-потомком любой генерации, которое содержит молекулу ДНК, родственную с первоначальным трансгенным растением, содержащим эту молекулу ДНК. Кроме того, обеспечены трансгенные семена, содержащие молекулу ДНК настоящего изобретения.

[009] Еще в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ получения товарного продукта, предусматривающий получение трансгенного растения или его части в соответствии с изобретением и получение из них товарного продукта. В одном варианте осуществления, товарным продуктом настоящего изобретения является концентрат белка, изолят белка, зерно, крахмал, семена, мучка, мука, биомасса или масло из семян растений. В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает товарный продукт, обеспечиваемый вышеуказанным способом. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, изобретение обеспечивает товарный продукт, содержащий молекулу ДНК, обеспеченную здесь, включающую в себя последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из: a) последовательности по меньшей мере с 85% идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; b) последовательности, содержащей любую из SEQ ID NO: 1-158 и 180-183; и c) фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-158 и 180-183, где этот фрагмент имеет ген-регуляторную активность; где эта последовательность функционально связана с гетерологичной транскрибируемой полинуклеотидной молекулой.

[0010] Еще в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ экспрессии транскрибируемой полинуклеотидной молекулы, который предусматривает получение трансгенного растения в соответствии с настоящим изобретением, такого как растение, содержащее молекулу ДНК, представленную в настоящем описании, и культивирование растения, где в этой молекуле ДНК экспрессируется транскрибируемый полинуклеотид.

[0011] Должно быть понятно, что во всем этом описании и в формуле изобретения, если нет других указаний, слово "содержат" и его вариации, такие как "содержит" и "содержащий", должны пониматься как включение указанных композиции, стадии и/или величины или их групп, а не как исключение любых других композиции, стадии и/или величины или их групп.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0012] Фигуры 1a-1h изображают сопоставление вариантов размеров промоторов, соответствующих промоторным элементам, выделенным из вида травянистого растения Andropogon gerardii. В частности, фиг. 1а-1h показывают сопоставление промоторной последовательности 2603 п.н. P-ANDge.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 2), обнаруженной в группе транскрипционного регуляторного элемента экспрессии EXP-ANDge.Ubq1:1:9 (SEQ ID NO: 1), с промоторными последовательностями, полученными с использованием делеционного анализа P-ANDge.Ubql-1:1:11. Делеция, например, 5’-конца P-ANDge.Ubq1-l:l:11, продуцировала промотор P-ANDge.Ubq1-1:l:9 (SEQ ID NO: 6), последовательность 2114 п.н. которого была обнаружена в EXP-ANDge.Ubq1-:1:7 (SEQ ID NO: 5). Другие промоторные последовательности на фиг. 1 включают в себя P-ANDge.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 9), последовательность 1644 п.н. содержащуюся в EXP-ANDge.Ubq1:1:8 (SEQ ID NO: 8); P-ANDge.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 11), последовательность 1472 п.н., содержащуюся в EXP-ANDge.Ubq1:1:10 (SEQ ID NO: 10); P-ANDge.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 13), последовательность 1114 п.н., содержащуюся в EXP-ANDge.Ubq1:1:6 (SEQ ID NO: 12); P-ANDge.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 15), последовательность 771 п.н., содержащуюся в EXP-ANDge.Ubq1:1:11 (SEQ ID NO: 14); и P-ANDge.Ubq1-1:1:14 (SEQ ID NO: 17), последовательность 482 п.н., содержащуюся в EXP-ANDge.Ubq1:1:12 (SEQ ID NO: 16).

[0013] Фигуры 2a-2g изображают сопоставление вариантов промоторов, выделенных из вида травянистого растения Saccharum ravennae (Erianthus ravennae). В частности, фигуры 2a-2g показывают сопоставление промоторной последовательности 2536 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:10 (SEQ ID NO: 19) (обнаруженной, например, в группе транскрипционного регуляторного элемента экспрессии, например, EXP-ERIra.Ubq1 (SEQ ID NO: 18)) с промоторными последовательностями, полученными из делеционного анализа P-ERIra.Ubq1-1:1:10; промоторной последовательностью 2014 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:9 (SEQ ID NO: 23); промоторной последовательностью 1525 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:11 (SEQ ID NO: 26); промоторной последовательностью 1044 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:8 (SEQ ID NO: 28); последовательностью 796 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:12 (SEQ ID NO: 30); и последовательностью 511 п.н. P-ERIra.Ubq1-1:1:13 (SEQ ID NO: 32).

[0014] Фигуры 3a-3c изображают сопоставление вариантов размеров промоторов, соответствующих промоторным элементам, выделенным из вида травянистого растения Setaria viridis. В частности, фигуры 3a-3c показывают сопоставление промоторной последовательности 1493 п.н., P-Sv.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 34) с промоторами, полученными из делеционного анализа 5’-конца P-Sv.Ubq1-1:1:1; промотором с размером 1035 п.н. P-Sv.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 38); и промоторной последовательностью 681 п.н. P-Sv.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 40).

[0015] Фигуры 4a-4e изображают сопоставление вариантов групп транскрипционных регуляторных элементов экспрессии, полученных из подвида травянистого растения Zea mays subsp. mexicana. В частности, фигуры 4a-4e сравнивают группу транскрипционных регуляторных элементов экспрессии 2005 п.н., названную EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 49), с аллельным вариантом EXP-Zm.UbqM1:1:5 (SEQ ID NO: 53), а также с вариантами размеров EXP-Zm.UbqM1:1:1 (SEQ ID NO: 41), который имеет длину 1922 п.н., и EXP-Zm.UbqM1:1:4 (SEQ ID NO: 45), который имеет длину 1971 п.н.

[0016] Фигуры 5a-5b изображают сопоставление вариантов размеров промоторов, выделенных из травянистого растения Sorghum bicolor. В частности, фигуры 5a-5b показывают сопоставление промоторного элемента с размером 791 п.н., P-Sb.Ubq6-1:1:2 (SEQ ID NO: 60), содержащегося в группе транскрипционных регуляторных элементов экспрессии EXP-Sb.Ubq6 (SEQ ID NO: 59), с промоторным элементом 855 п.н. P-Sb.Ubq6-1:1:1 (SEQ ID NO: 64), содержащимся в EXP-Sb.Ubq6:1:1 (SEQ ID NO: 63).

[0017] Фигуры 6a-6с изображают сопоставление вариантов размеров промоторов, выделенных из травянистого растения Setaria italica. В частности, Фигуры 6a-6c показывают сопоставление варианта промотора 1492 п.н. P-SETit.Ubq1-1:1:1 (SEQ ID NO: 70) с вариантом промотора 1492 п.н. P-SETit.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 74), промоторным элементом 1034 п.н. P-SETit.Ubq1-1:1:2 (SEQ ID NO: 76) и промоторным элементом 680 п.н. P-SETit.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 78).

[0018] Фигуры 7a-7b изображают варианты размеров промоторов и энхансерного элемента, соответствующего промоторным элементам, выделенным из вида травянистого растения Coix lachryma-jobi. В частности, фигуры 7a и 7b показывают сопоставление варианта промотора 837 п.н., P-Cl.Ubq1-1:1:l (SEQ ID NO: 80), обнаруженного в группе транскрипционных регуляторных элементов экспрессии EXP-Cl.Ubq1:1:1 (SEQ ID NO: 79), с энхансерным фрагментом, полученным из P-Cl.Ubq1-1:1:1, названным E-Cl.Ubq1: 1:1 (SEQ ID NO: 89), который имеет длину 798 п.н., а также с тремя 5’-концевыми делеционными вариантами P-Cl.Ubq1-1:1:1: элементом 742 п.н. P-Cl.Ubq1-1:1:4 (SEQ ID NO: 84); элементом 401 п.н. P-Cl.Ubq1-1:1:3 (SEQ ID NO: 86); и минимальным промоторным элементом 54 п.н. P-Cl.Ubq1-1:1:5 (SEQ ID NO: 88).

[0019] Фигура 8 изображает конфигурации трансгенных кассет настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0020] SEQ ID NO: 1, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 45, 49, 53, 55, 59, 63, 65, 69, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87, 90, 93, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 115, 116, 117, 119, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 180, 181 и 183 являются последовательностями групп транскрипционных регуляторных элементов экспрессии или EXP-последовательностями, содержащими промоторную последовательность, функционально связанную 5’ (слева) от лидерной последовательности, которая функционально связана 5’ (слева) от последовательности интрона.

[0021] SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135 являются промоторными последовательностями.

[0022] SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 и 81 являются лидерными последовательностями.

[0023] SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 и 182 являются последовательностями интронов.

[0024] SEQ ID NO: 89 является последовательностью энхансера.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0025] Описанное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, имеющие выгодную ген-регуляторную активность, полученные из растительных источников. Изобретение обеспечивает дизайн, конструирование и использование этих полинуклеотидных молекул. Нуклеотидные последовательности этих полинуклеотидных молекул обеспечены среди SEQ ID NO: 1-158 и 180-183. Эти полинуклеотидные молекулы способны, например, влиять на экспрессию функционально связанной транскрибируемой молекулы в тканях растений и, следовательно, регулировать экспрессию гена, или активность кодируемого геном продукта, в трансгенных растениях. Настоящее изобретение обеспечивает также способы их модификации, получения и применения. Настоящее изобретение обеспечивает также композиции, трансформированные клетки-хозяева, трансгенные растения и семена, содержащие эти промоторы, и/или другие описанные нуклеотидные последовательности и способы их получения и применения.

[0026] Следующие определения и способы обеспечены для лучшего определения настоящего изобретения и помощи специалистам с обычной квалификацией в данной области в применении на практике настоящего изобретения. Если нет других указаний, термины должны пониматься в соответствии с общепринятым применением их специалистами с обычной квалификацией в релевантной области.

Молекулы ДНК

[0027] В данном контексте, термин "ДНК" или "молекула ДНК" относится к двухцепочечной молекуле ДНК геномного или синтетического происхождения, т.е. к полимеру дезоксирибонуклеотидных оснований, или к молекуле полинуклеотида, считываемой от 5’ (левого) конца к 3’ (правому) концу. В данном контексте, термин "последовательность ДНК" относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Используемая здесь номенклатура соответствует номенклатуре Title 37 of the United States Code of Federal Regulations § 1.822, и представлена в таблицах в WIPO Standard ST.25 (1998), Appendix 2, Tables 1 and 3.

[0028] В этом контексте, термин “выделенная молекула ДНК" относится к молекуле ДНК, по меньшей мере частично отделенной от других молекул, обычно ассоциированных с ней в ее нативном или природном состоянии. В одном варианте осуществления, термин "выделенная” молекула ДНК относится к молекуле ДНК, которая по меньшей мере частично отделена от некоторых нуклеиновых кислот, которые обычно фланкируют эту молекулу ДНК в ее нативном или природном состоянии. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями, с которыми они обычно не ассоциированы, например, в результате рекомбинантных способов, считаются здесь выделенными. Такие молекулы считаются выделенными при интеграции в хромосому клетки-хозяина или при присутствии в растворе нуклеиновых кислот с другими молекулами ДНК, в том смысле, что они не находятся в их нативном состоянии.

[0029] Любое количество способов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам, могут быть использованы для выделения и манипуляции молекулы ДНК, или ее фрагмента, описанных в настоящем изобретении. Например, технология ПЦР (полимеразной цепной реакции) может быть использована для амплификации конкретной исходной молекулы ДНК и/или получения вариантов этой первоначальной молекулы. Молекулы ДНК или их фрагмент могут быть также получены другими способами, такими как непосредственный синтез этого фрагмента химическим способом, как обычно практикуется с использованием автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов.

[0030] В данном контексте, термин "идентичность последовательности" относится к степени, до которой являются идентичными две оптимально сопоставленные полинуклеотидные последовательности или две оптимально сопоставленные полипептидные последовательности. Оптимальное сопоставление последовательностей создается ручным сопоставлением двух последовательностей, например, ссылочной последовательности и другой последовательности, для максимизации количества нуклеотидных совпадений в этом сопоставлении последовательностей с подходящими внутренними нуклеотидными инсерциями, делециями или гэпами. В данном контексте, термин "ссылочная последовательность" относится к последовательности, обеспеченной в качестве полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-158 и 180-183.

[0031] В данном контексте, термин "процентная идентичность последовательности" или “процентная идентичность" или "%-ная идентичность" обозначает умножение полученной идентичности в виде дроби на 100. Эта "дробь идентичности" для последовательности, оптимально сопоставленной со ссылочной последовательностью, является числом совпадений нуклеотидов в оптимальном сопоставлении, деленным на общее число нуклеотидных совпадений в ссылочной последовательности, например, общее число нуклеотидов в полной длине всей ссылочной последовательности. Таким образом, одним вариантом настоящего изобретения является молекула ДНК, содержащая последовательность, которая при оптимальном сопоставлении со ссылочной последовательностью, обеспеченной в виде SEQ ID NO: 1-158 и 180-183, имеет по меньшей мере приблизительно 85-процентную идентичность, по меньшей мере приблизительно 90-процентную идентичность, по меньшей мере приблизительно 95-процентную идентичность, по меньшей мере приблизительно 96-процентную идентичность, по меньшей мере приблизительно 97-процентную идентичность, по меньшей мере приблизительно 98-процентную идентичность или по меньшей мере приблизительно 99-процентную идентичность со ссылочной последовательностью. В конкретных вариантах такие последовательности могут быть определены как имеющие ген-регуляторную активность.

Регуляторные элементы

[0032] Одним регуляторным элементом является молекула ДНК, имеющая ген-регуляторную активность, т.е. молекула ДНК, которая имеет способность влиять на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Таким образом, термин "ген-регуляторная активность” относится к способности влиять на характер экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы влиянием на транскрипцию и/или трансляцию этой функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. В данном контексте, группа транскрипционных регуляторных элементов экспрессии или "EXP"-последовательность, может состоять из элементов экспрессии, таких как энхансеры, промоторы, лидеры и интроны, функционально связанные. Таким образом, группа элементов транскрипционной регуляторной экспрессии может состоять, например, из промотора, функционально связанного 5’ (слева) от лидерной последовательности, которая, в свою очередь, функционально связана 5’ (слева) от интронной последовательности. Эта интронная последовательность может содержать последовательность, начинающуюся в точке первой интрон/экзонной границы сплайсинга нативной последовательности, и может дополнительно состоять из малого лидерного фрагмента, содержащего вторую интрон/экзонную границу сплайсинга, чтобы обеспечить должный процессинг интрона/экзона для облегчения транскрипции и должный процессинг полученного транскрипта. Лидеры и интроны могут положительно влиять на транскрипцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы, а также на трансляцию полученной транскрибируемой РНК. Эта пре-процессированная молекула РНК содержит лидеры и интроны, которые могут влиять на посттранскрипционный процессинг транскрибируемой РНК и/или экспорт этой молекулы транскрибируемой РНК из ядра клетки в цитоплазму. После посттранскрипционного процессинга этой транскрибируемой молекулы РНК, лидерная последовательность может удерживаться в виде части конечной мессенджер-РНК и может положительно влиять на трансляцию этой молекулы мессенджер-РНК.

[0033] Регуляторные элементы, такие как промоторы, лидеры, интроны и районы терминации транскрипции (или 3’-UTR) являются молекулами ДНК, которые имеют ген-регуляторную активность и играют интегральную (существенную) роль во всей экспрессии генов в живых клетках. Термин "регуляторный элемент" относится к молекуле ДНК, имеющей ген-регуляторную активность, т.е. она способна влиять на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Поэтому, выделенные регуляторные элементы, такие как промоторы и лидеры, которые функционируют в растениях, применимы для модификации фенотипов растений посредством способов генетической инженерии.

[0034] Регуляторные элементы могут характеризоваться по их характеру (паттерну) действий на экспрессию (количественно и/или качественно), например, положительных или отрицательных действий и/или других действий, например, по их временному, пространственному, относящемуся к развитию, тканевому, относящемуся к окружающей среде, физиологическому, патологическому, относящемуся к клеточному циклу и/или химически реагировать характеру экспрессии, и любой их комбинации, а также по количественным или качественным показателям. Промотор применим в качестве регуляторного элемента для модификации экспрессии функционально связанной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы.

[0035] В данном контексте, "паттерн экспрессии гена" является любым паттерном транскрипции функционально связанной молекулы ДНК в транскрибируемую молекулу РНК. Эта транскрибируемая молекула РНК может быть транслирована для получения молекулы белка или может обеспечивать антисмысловую или другую регуляторную молекулу РНК, такую как dsRNA, tRNA, rRNA, miRNA и т.п.

[0036] В данном контексте, термин "экспрессия белка" обозначает любой паттерн трансляции транскрибируемой молекулы РНК в молекулу белка. Экспрессия белка может характеризоваться по его временным, пространственным, относящимся к развитию или морфологическим качествам, а также по количественным или качественным показателям.

[0037] В данном контексте, термин "промотор" относится обычно к молекуле ДНК, которая участвует в узнавании и связывании РНК-полимеразой II или другими белками (транс-активирующими факторами транскрипции) для инициации транскрипции. Промотор может быть сначала выделенным из 5’-нетранслируемого района (5’-UTR) геномной копии гена. Альтернативно, промоторы могут быть полученными синтетически или подвергнутыми модуляции молекулами ДНК. Промоторы могут быть также химерными, т.е. промотором, полученным через слияние двух или более гетерологичных молекул ДНК. Промоторы, применимые в практике настоящего изобретения, включают в себя SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135, или их фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления изобретения, такие молекулы и их любые варианты или производные, описанные здесь, дополнительно определяются как содержащие промоторную активность, т.е. способные действовать в качестве промотора в клетке-хозяине, например, в трансгенном растении. В других конкретных вариантах осуществления, фрагмент может быть определен как проявляющий промоторную активность, которой обладала исходная молекула промотора, из которого он получен, или фрагмент может содержать "минимальный промотор", который обеспечивает фоновый уровень транскрипции и состоит из TATA-бокса или эквивалентной последовательности для узнавания и связывания комплекса РНК-полимеразы II для инициации транскрипции.

[0038] В одном варианте осуществления, обеспечены фрагменты описанной здесь промоторной последовательности. Фрагменты промотора могут иметь промоторную активность, как описано выше, и могут быть применимы по отдельности или в комбинации с другими промоторами и фрагментами промоторов, например, в конструировании химерных промоторов. В конкретных вариантах осуществления, обеспечены фрагменты промотора, содержащие по меньшей мере приблизительно 50, 95, 150, 250, 500, 750 или по меньшей мере приблизительно 1000 смежных нуклеотидов, или более длинные, полинуклеотидной молекулы, имеющей промоторную активность, описанную в данном документе.

[0039] Композиции, произведенные из любого из промоторов, представленных как SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135, такие как внутренние или 5’-делеции, например, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области, для улучшения или изменения экспрессии, в том числе удалением элементов, которые имеют либо положительные, либо отрицательные действия на экспрессию; дупликацией элементов, которые имеют положительные или отрицательные действия на экспрессию; и/или дупликацией или удалением элементов, которые имеют тканеспецифические или клеткоспецифические действия на экспрессию. Композиции, произведенные из любого из промоторов, представленных как SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135, состоящих из 3’-делеций, в которых элемент ТАТА-бокс или его эквивалентная последовательность и последовательность слева удалены, могут быть использованы, например, для получения энхансерных элементов. Кроме того, делеции могут быть получены для удаления любых элементов, которые являются положительными или отрицательными; тканеспецифическими; клеткоспецифическими; или специфическими в отношении тайминга (но не ограничиваемые циркадным ритмом) действиями на экспрессии. Любой из промоторов, представленных как SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135, и фрагментов или энхансеров, произведенных из них, может быть использован для получения химерных композиций транскрибируемых регуляторных элементов, состоящих из любого из промоторов, представленных как SEQ ID NO: 2, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 23, 26, 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42, 46, 50, 56, 60, 64, 66, 70, 74, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 91, 96 и 135, и произведенных из них фрагментов или энхансеров, функционально связанных с другими энхансерами и промоторами. Эффективность этих модификаций, дупликаций или делеций, описанных здесь, на желаемых аспектах экспрессии конкретного трансгена могут быть тестированы эмпирически в стабильных и транзиторных анализах растений, таких как анализы, описанные в рабочих примерах здесь, для валидизации результатов, которые могут варьироваться в зависимости от произведенных изменений и цели этого изменения в исходной молекуле.

[0040] В данном контексте, термин "лидер" относится к молекуле ДНК, выделенной из нетранслированного 5’-района (5’-UTR) геномной копии гена, и определяется обычно как нуклеотидный сегмент между стартовым сайтом транскрипции (TSS) и стартовым сайтом кодирующей белок последовательности. Альтернативно, лидеры могут быть получены синтетически или манипуляцией элементами ДНК. Молекулы лидера могут быть использованы для модуляции экспрессии функциональной транскрибируемой полинуклеотидной молекулы. Молекулы лидера могут быть использованы с гетерологичным промотором или с их природным промотором. Таким образом, промоторные молекулы настоящего изобретения могут быть функционально связаны с их природным лидером или могут быть функционально связаны с гетерологичным лидером. Лидеры, применимые в практике настоящего изобретения, включают в себя SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 и 81 или их фрагменты или варианты. В конкретных вариантах осуществления, могут быть обеспечены такие последовательности, определяемые как последовательности, способные действовать в качестве лидера в клетке-хозяине, в том числе, например, трансгенной клетке растения. В одном варианте осуществления, такие последовательности декодируются как содержащие лидерную активность.

[0041] Эти лидерные последовательности (5’-UTR), представленные как SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 и 81, могут состоять из регуляторных элементов или могут принимать вторичные структуры, которые могут влиять на транскрипцию или трансляцию трансгена. Лидерные последовательности, представленные как SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 и 81, могут быть использованы в соответствии с данным изобретением для получения химерных регуляторных элементов, которые влияют на транскрипцию или трансляцию трансгена. Кроме того, лидерные последовательности, представленные как SEQ ID NO: 3, 20, 35, 43, 47, 51, 57, 61, 67, 71 и 81, могут быть использованы для получения химерных лидерных последовательностей, которые влияют на транскрипцию или трансляцию трансгена.

[0042] Введение чужеродного гена в новое растение-хозяин не всегда приводит к высокой экспрессии получаемого гена. Кроме того, при рассмотрении комплексных признаков, иногда необходимо модулировать несколько генов, с пространственно или транзиторно отличающимися паттернами (характерами) экспрессии. Такую модуляцию могут обеспечивать в основном интроны. Однако, показано, что множественное применение одного и того же интрона обнаруживает недостатки. В этих случаях, необходимо иметь коллекцию интронов, известную в данной области, с усиливающими экспрессию свойствами. Поскольку доступная коллекция интронов, известная в данной области, с усиливающими экспрессию свойствами, является ограниченной, необходимы альтернативы.

[0043] Композиции, произведенные из любых из интронов, представленных как SEQ ID NO: 4, 7, 21, 24, 36, 44, 48, 52, 54, 58, 62, 68, 72, 82, 92, 94, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 118, 120, 122, 127, 129, 131, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 и 182, могут состоять из внутренних делеций или дупликаций цис-регуляторных элементов; и/или изменений 5’- и 3’-последовательностей, содержащих границы сплайсинга интрон/экзон, могут быть использованы для улучшения экспрессии или специфичности экспрессии при функциональном связывании с промотором + лидером или химерным промотором + лидером и кодирующей последовательностью. Изменения 5’- и 3’-районов, содержащих границу сплайсинга интрон/экзон, могут быть также произведены для уменьшения потенциала для введения фальстарта и стоп-кодонов, продуцирующихся в полученном транскрипте, после процессинга и сплайсинга этой мессенджер-РНК. Эти интроны могут быть тестированы эмпирически, как описано в рабочих примерах, для определения действия интрона на экспрессию трансгена.

[0044] В соответствии с изобретением, промотор или фрагмент промотора могут быть анализированы на присутствие известных промоторных элементов, т.е. такие характеристики последовательности ДНК, как ТАТА-бокс и другие известные мотивы сайта связывания факторов транскрипции. Идентификация таких известных промоторных элементов может быть использована квалифицированным в данной области специалистом для конструирования вариантов промотора, имеющих сходный паттерн (характер) экспрессии с исходным промотором.

[0045] В данном контексте, термин "энхансер" или "энхансерный элемент" относится к цис-действующему транскрипционному регуляторному элементу, a.k.a. цис-элементу, который придает аспект общего паттерна экспрессии, но обычно является недостаточным в отдельности для управления транскрипцией, функционально связанной полинуклеотидной последовательности. В отличие от промоторов, энхансерные элементы обычно не включают в себя стартовый сайт транскрипции (TSS) или TATA-бокс или эквивалентную последовательность. Промотор может природно содержать один или несколько энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанной полинуклеотидной последовательности. Выделенный энхансерный элемент может быть также слит с промотором для продуцирования химерного промоторного цис-элемента, который придает аспект общей модуляции транскрипци гена. Промотор или фрагмент промотора может содержать один или несколько энхансерных элементов, которые влияют на транскрипцию функционально связанных генов. Считается, что многие энхансерные элементы промотора связывают ДНК-связывающие белки и/или влияют на топологию ДНК, производя локальные конформации, которые селективно позволяют или ограничивают доступ РНК-полимеразы к ДНК-матрице или, которые облегчают селективное открывание двойной спирали в сайте инициации транскрипции. Некоторые энхансерные элементы связывают более одного фактора транскрипции, и факторы транскрипции могут взаимодействовать с различными аффинностями с более чем одним энхансерным доменом. Энхансерные элементы могут быть идентифицированы рядом способов, включающих в себя делеционный анализ, т.е. делеции одного или нескольких нуклеотидов из 5’-конца или внутренних относительно промотора; анализ ДНК-связывающего белка с использованием футпринтинга с ДНКазой I, интерференцию метилирования, анализы смещения мобильности в электрофорезе, in vivo геномный футпринтинг с использованием опосредованной лигированием ПЦР и другие общепринятые анализы; или анализ сходства последовательности ДНК с использованием известных мотивов цис-элементов или энхансерных элементов в качестве последовательности-мишени или мотива-мишени с общепринятыми способами сравнения последовательностей ДНК, такими как BLAST. Тонкая структура энхансерного домена может быть дополнительно исследована мутагенезом (или заменой) одного или нескольких нуклеотидов или другими общепринятыми способами. Энхансерные элементы могут быть получены химическим синтезом или выделением из регуляторных элементов, которые включают в себя такие элементы, и они могут быть синтезированы с дополнительными фланкирующими нуклеотидами, которые содержат применимые сайты рестрикционных ферментов для облегчения манипуляции субпоследовательности. Таким образом, дизайн, конструирование и применение энхансерных элементов в соответствии со способами, описанными здесь, для модуляции экспрессии функционально связанных полинуклеотидных молекул включены в настоящее изобретение.

[0046] В растениях, включение некоторых интронов в генные конструкты приводит к увеличенному накапливанию мРНК и белка относительно конструктов, лишенных этого интрона.

[0047] Этот эффект был назван "опосредуемым интроном усилением" (IME) экспрессии генов (Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Интроны, о которых известно, что они стимулируют экспрессию в растениях, были идентифицированы в генах кукурузы {например, tubA1, Adh1, Shi, Ubi1 (Jeon et al. (2000) Plant Physiol. 123: 1005-1014; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Vasil et al. (1989) Plant Physiol. 91:1575-1579; Christiansen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) и генах риса (e.g. salt, tpi: McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990); Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467 (1994)). Подобным образом, было обнаружено, что интроны из генов двудольных растений, такие как интроны из петунии (например, rbcS), картофеля (например, st-ls1) и из Arabidopsis thaliana (например, ubq3 и pat1) повышают скорости экспрессии генов (Dean et al. (1989) Plant Cell 1:201-208; Leon et al. (1991) Plant Physiol. 95:968-972; Norris et al. (1993) Plant Mol Biol 21:895-906; Rose and Last (1997) Plant J.11:455-464). Было показано, что сплайсинг может быть необходимым для некоторых IME (Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol Biol. 15:913-920; Clancy and Hannah (2002) Plant Physiol. 130:918-929). Однако было показано с использованием точковых мутаций в сайтах сплайсинга гена pat1 из A. thaliana, что сплайсинг сам по себе, не является необходимым для некоторых IME в двудольных растениях (Rose and Beliakoff (2000) Plant Physiol. 122:535-542).

[0048] Усиление экспрессии генов интронами не является общим феноменом, так как некоторые инсерции интронов в рекомбинантные экспрессионные кассеты не усиливали экспрессию (например, интроны из генов двудольных растений (гена rbcS из гороха, гена фазеолина из фасоли и гена stls-1 из Solarium tuberosum) и интроны из генов кукурузы (гена adh1 девятого интрона, гена hsp81 первого интрона)) (Chee et al. (1986) Gene 41:47-57; Kuhlemeier et al. (1988) Mol Gen Genet 212:405-411; Mascarenhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920; Sinibaldi and Mettler (1992) В WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229-257; Vancanneyt et al. 1990 Mol. Gen. Genet. 220:245-250). Таким образом, не каждый интрон может быть использован для манипуляции уровня экспрессии неэндогенных генов или эндогенных генов в трансгенных растениях. В известном уровне техники невозможно предсказать, какие