Стабильные препараты связывающего средства на основе igg4

Стабильные препараты связывающего средства на основе igg4

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США с регистрационным номером 61/615539, поданной 26 марта 2012 года, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Антиген LIGHT человека является одной из возможных мишеней цитокинов, которые вовлечены в процессы хронического воспалительного аутоиммунного заболевания. В качестве представителя надсемейства лигандов TNF (TNFSF) LIGHT также известен как TNFSF14 или CD258. LIGHT экспрессируется на поверхности T-клеток при активации строго регулируемым образом. Однако LIGHT также конститутивно присутствует на регистрируемых уровнях на поверхности незрелых дендритных клеток и на T-клетках природных киллеров (NK) кишечника. LIGHT опосредует свои биологические эффекты через связывание трех рецепторов надсемейства TNF, включая рецептор лимфотоксина β (LTβR), медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) и рецептор-ловушку 3 (DcR3). LIGHT-экспрессирующие лимфоциты могут индуцировать IBD-подобные симптомы у человека, и повышение экспрессии LIGHT наблюдали у пациентов с активной формой болезни Крона и другими воспалительными расстройствами, такими как болезнь «трансплантат против хозяина».

CXCR5, также известный как рецептор лимфомы Беркитта (BLR1), CD185, MDR15 и MGC117347, представляет собой сопряженный с G-белком рецептор, который является представителем семейства рецепторов хемокинов CXC. Не подвергнутый процессингу предшественник CXCR5 имеет длину 372 аминокислоты с молекулярной массой 42 кДа. CXCR5 играет роль в миграции и локализации B-клеток в конкретных анатомических компартментах. Нокаутированные мыши не имеют периферических лимфатических узлов, имеют меньше пейеровых бляшек и имеют пониженные уровни B-клеток. CXCL13, также известный как BLC, является лигандом CXCR5. CXCL13 является хемоаттрактантом B-клеток.

Связывающие анти-LIGHT-средства и связывающие анти-CXCR5-средства являются терапевтически значимыми, и существует необходимость в приготовлении таких связывающих средств в виде лекарственных продуктов, которые можно вводить субъектам, особенно человеку, для лечения воспалительных заболеваний.

Чтобы разработать фармацевтический препарат, содержащий связывающее анти-LIGHT-средство или связывающее анти-CXCR5-средство, подходящее для внутривенного или подкожного введения, связывающее средство должно быть сконцентрировано примерно до 20 мг/мл или больше, обычно примерно до 100-150 мг/мл и даже до 250 мг/мл. При таких высоких концентрациях может возникать множество осложнений, включая увеличение вязкости, сдвиг pH, изменение окраски раствора и образование видимых частиц и частиц довидимого диапазона.

Приготовление препаратов таких связывающих средств дополнительно осложняется тем фактом, что такие средства в высокой степени склонны к агрегации при таких высоких концентрациях.

Приготовление препаратов IgG4-антител еще более осложняется тем фактом, что IgG4-антитела имеют тенденцию образовывать полумолекулы при высоких концентрациях в растворе. Однако IgG4-антитела представляют терапевтический интерес, поскольку они обладают пониженной эффекторной функцией.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для удовлетворения указанных и других потребностей в настоящем изобретении предлагаются высокостабильные препараты связывающего IgG4-средства. Неожиданно были открыты высокостабильные препараты связывающего IgG4-средства в форме жидкостей и лиофилизированных порошков, которые содержат связывающее IgG4-средство и цитратный буфер, при этом pH препарата находится на уровне или ниже как значения pH около 6, так и значения изоэлектрической точки (pI) связывающего средства. Такие препараты улучшены по сравнению с обычными препаратами, которые часто приводят к димеризации связывающего средства, такого как антитело, при увеличении концентрации связывающего средства, такого как антитело, в препарате. В частности, препараты согласно изобретению способствуют снижению количества нежелательных побочных продуктов, включая агрегаты, полумолекулы, продукты распада, низкомолекулярные белки (LMWP), высокомолекулярные белки (HMWP) и перераспределение кислых, основных и нейтральных изоформ связывающего средства, такого как антитело, в препарате.

В некоторых аспектах изобретение относится к стабильному препарату, содержащему: связывающее средство, содержащее, по меньшей мере, часть Fc-области IgG4-антитела; и от примерно 5 до примерно 50 мМ цитрата в качестве буферного средства; при этом pH препарата находится на уровне или ниже как значения pH около 6, так и pI связывающего средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающим средством является антитело.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающее средство или антитело связывается с лимфотоксин-подобным, проявляющим индуцируемую экспрессию и конкурирующим с гликопротеидом D вируса герпеса, за медиатор проникновения вируса герпеса, рецептор, экспрессируемый на лимфоцитах (LIGHT). В конкретных вариантах осуществления изобретения связывающее анти-LIGHT-средство или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6. В других конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полностью человеческое IgG4 анти-LIGHT-антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающее средство или антитело связывается с рецептором хемокина C-X-C типа 5 (CXCR5). В конкретных вариантах осуществления изобретения связывающее анти-CXCR5-средство или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 16 и 17, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20. В других конкретных вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное IgG4 анти-CXCR5-антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет от примерно 5 до примерно 280 мг/мл. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 150 мг/мл. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 50 мг/мл. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 20 мг/мл. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация антитела составляет примерно 100 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация цитрата составляет от примерно 5 до примерно 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения концентрация цитрата составляет примерно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитратный буфер представляет собой дигидрат цитрата натрия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения pH препарата составляет от примерно pH 5 до примерно pH 6. В конкретных вариантах осуществления изобретения значение pH препарата выбрано из группы, состоящей из значений pH примерно pH 5,0, примерно pH 5,5 и примерно pH 6,0.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения pI связывающего средства или антитела составляет от примерно 6,8 до примерно 7,2. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения pI связывающего средства или антитела составляет от примерно 7,6 до примерно 8,4.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация поверхностно-активного вещества составляет от примерно 0,001% до примерно 0,1% масс./об. В некоторых вариантах осуществления изобретения поверхностно-активным веществом является полисорбат. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полисорбат представляет собой полисорбат 20. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,005% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,01% масс./об. В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация полисорбата 20 составляет примерно 0,02% масс./об.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит средство для тоничности. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация средства для тоничности составляет от примерно 0,1% до примерно 10% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения средством для тоничности является сахарид. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения сахарид представляет собой маннит. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация маннита составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация маннита составляет примерно 4%. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения сахарид представляет собой сахарозу. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 5% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 6% масс./об. В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 4,5% масс./об. В следующих конкретных альтернативных вариантах осуществления изобретения средством для тоничности является хлорид натрия. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет от примерно 0,01% до примерно 1%. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%. В других конкретных вариантах осуществления изобретения средство для тоничности представляет собой сочетание сахарозы и хлорида натрия. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет от примерно 1% до примерно 10% масс./об. в следующих конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация хлорида натрия составляет от примерно 0,01% до примерно 1%. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 6% масс./об. и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%. В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация сахарозы составляет примерно 4,5% масс./об., и концентрация хлорида натрия составляет примерно 0,2%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат дополнительно содержит аминокислоту. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация аминокислоты составляет от примерно 0,1% до примерно 5% масс./об. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения аминокислота представляет собой пролин или аргинин. В конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация пролина или аргинина составляет от примерно 1% до примерно 2% масс./об. В других конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация пролина составляет примерно 1,5% масс./об. В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения концентрация аргинина составляет примерно 1% масс./об.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат представляет собой жидкий препарат. В других конкретных вариантах осуществления изобретения препарат представляет собой лиофилизированный препарат.

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат является стабильным в течение, по меньшей мере, 6 месяцев при +5°C. В альтернативных вариантах осуществления изобретения препарат является стабильным в течение, по меньшей мере, 9 месяцев при +5°C.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в препарате наблюдают уменьшенное количество, по меньшей мере, одного побочного продукта, выбранного из группы, состоящей из агрегатов, полумолекул, продуктов распада, низкомолекулярных белков, высокомолекулярных белков и перераспределение кислых/основных/нейтральных изоформ антитела по сравнению либо с эталонным анти-LIGHT-препаратом, содержащим анти-LIGHT-антитело в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3, либо с эталонным анти-CXCR5-препаратом, содержащим анти-LIGHT-антитело в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для подкожного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 150 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,005% полисорбат 20; и

d) примерно 4% маннит;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 50 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер; и

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В следующих конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату антитела, подходящему для внутривенного введения, при этом препарат содержит:

a) примерно 50 мг/мл полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT (лимфотоксин-подобный, проявляет индуцируемую экспрессию и конкурирует с гликопротеидом D HSV за HVEM, рецептор, экспрессируемый T-лимфоцитами), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

d) примерно 5% сахарозы; и

e) примерно 1,5% пролина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 5,5.

В альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 20 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептора хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,02% полисорбата 20;

d) примерно 6% сахарозы; и

e) примерно 0,2% хлорида натрия;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В следующих альтернативных конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к стабильному препарату антитела, содержащему:

a) примерно 100 мг/мл гуманизированного IgG4-антитела против CXCR5 (рецептора хемокина C-X-C типа 5), содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

b) примерно 10 мМ цитратный буфер;

c) примерно 0,01% полисорбата 20;

d) примерно 4,5% сахарозы;

e) примерно 0,2% хлорида натрия; и

f) примерно 1% аргинина;

при этом pH препарата составляет примерно pH 6,0.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, изобретение относится к набору, содержащему емкость, содержащую: 1) препарат по любому из предшествующих пунктов и 2) ярлык или инструкции по введению и применению препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения ярлык содержит одну или несколько или из следующих инструкций: инструкции по введению препарата, инструкции по применению препарата, инструкции, касающиеся условий хранения препарата, информацию, касающуюся номера партии и серии препарата и/или набора, информацию, касающуюся состава препарата, информацию о безопасности, информацию, касающуюся возможных неблагоприятных реакций, вторичных эффектов и/или побочных эффектов в связи с введением препарата, или информацию, касающуюся возможных показаний и/или противопоказаний препарата.

В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к предварительно наполняемому устройству или предварительно наполняемой емкости, такой как шприц, картридж, флакон, ампула или шприц для самоинъекции, содержащий препарат согласно изобретению.

В некоторых других вариантах изобретение относится к набору, содержащему такой предварительно наполняемый шприц, картридж, флакон, ампулу или шприц для самоинъекции.

В некоторых вариантах изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания кишечника, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, препарата согласно изобретению.

В некоторых других вариантах изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, препарата согласно изобретению.

В некоторых вариантах изобретение относится к препарату для применения в способе диагностики или лечения организма человека или животного. В конкретных вариантах препарат применяют для лечения воспалительного заболевания кишечника. В альтернативных вариантах препарат применяют для лечения ревматоидного артрита.

В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к способу получения препарата согласно изобретению, включающему в себя смешивание компонентов препарата и корректировку pH, при этом получение осуществляют в стерильных условиях или препарат стерилизуют после смешивания компонентов и корректировки pH или обеих процедур.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения изобретение относится к способу получения стабильного препарата антитела, включающему в себя: a) получение связывающего анти-LIGHT-средства; b) ресуспендирование связывающего анти-LIGHT-средства в цитратном буфере, имеющем концентрацию от примерно 5 до примерно 50 мМ; и c) доведение значения pH препарата до pH 5,0 - pH 6,0.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 является изображением геля, на котором показаны результаты экспериментов по изоэлектрическому фокусированию в денатурированном состоянии, которые использовали для определения изоэлектрической точки (pI) полностью человеческого IgG4-антитела против LIGHT, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, приготовленного в виде препарата в фосфатно-солевом буфере при pH 7,3 в концентрации 5,5 мг/мл («исходный препарат», «PBS-препарат» или «эталонная партия»). Дорожки 1 и 5: набор для калибровки IEF в широком диапазоне pI 5-10,5; дорожки 2 и 4: первая серия эталонной партии; дорожки 3 и 4: вторая серия эталонной партии. Значения pI указаны числами.

Фиг. 2 является изображением SDS-ПААГ-геля, на котором сравнивали разные серии эталонной партии в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. Дорожки 1 и 10: стандарт белка Biorad Precision Plus; дорожка 5: пустая; дорожка 2: первая серия эталонной партии в не восстанавливающих условиях; дорожки 3 и 4: вторая серия эталонной партии в не восстанавливающих условиях; дорожка 6: первая серия эталонной партии в восстанавливающих условиях; дорожки 7 и 8: вторая серия эталонной партии в восстанавливающих условиях; и дорожка 9: контроль системы. Размеры указаны числами в рядах.

На фиг. 3 показан график ELISA, который использовали для определения активности связывания антигена первой и второй серий эталонной партии.

На фиг. 4 показана хроматограмма, полученная при эксклюзивной хроматографии по размеру (SEC) первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 4, при SEC выявляли белки с высокой молекулярной массой (HMWP), например, ди/олигомеры (RRT0.8) или агрегаты, и белки с низкой молекулярной массой (LMWP) или продукты распада. Первая серия эталонной партии имела чистоту с содержанием мономера 97%.

На фиг. 5 показана хроматограмма, полученная при слабо-катионообменной хроматографии в случае первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 5, во время исследований стабильности происходило перераспределение кислых, нейтральных и основных изоформ. Первая серия эталонной партии имела распределение кислых/нейтральных/основных изоформ 42,3/55,6/1,9%.

На фиг. 6 показана термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии первой серии эталонной партии. Как показано на фиг. 6, разворачивание трех доменов антитела происходит при 68°C, 75°C и 78°C.

На фиг. 7 показана картина динамического светорассеяния первой серии эталонной партии, которую не подвергали фильтрации. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела первой серии эталонной партии.

На фиг. 8 показана картина динамического светорассеяния первой серии эталонной партии, которую подвергали фильтрации. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела первой серии эталонной партии.

Фиг. 9 представляет собой схему операций в процессе производства лекарственного продукта в случае препарата с высокой концентрацией антитела.

На фиг. 10 показана картина динамического светорассеяния препарата 14. DLS использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела.

На фиг. 11 представлена картина геля, показывающая результаты изоэлектрического фокусирования для определения pI (изоэлектрической точки) лидирующего CXCR5-антитела. Дорожки 1,6: набор для калибровки IEF в широком диапазоне pI; дорожки 2,4: эталонное стандартное лидирующее антитело LP08031; и дорожки 3,5: лекарственная субстанция лидирующего антитела, RSN0151.

Фиг. 12 представляет собой картину SDS-ПААГ-геля, на котором сравнивали разные партии лекарственной субстанции в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях. Гель также использовали для определения молекулярной массы лидирующего CXCR5-антитела и присутствия каких-либо агрегатов.

Фиг. 13 представляет собой график ELISA, который использовали для определения активности связывания с антигеном лидирующего CXCR5-антитела с 28-мерным пептидом антигена CXCR5.

Фиг. 14 представляет собой хроматограмму SEC подвергнутого стрессу лидирующего CXCR5-антитела. SEC позволяет выявлять белки с высокой молекулярной массой (HMWP), например, ди/олигомеры или агрегаты, и белки с низкой молекулярной массой (LMWP) или продукты распада. Лидирующее CXCR5-антитело имело чистоту 99% по содержанию мономера.

Фиг. 15 представляет собой хроматограмму WCX, которую использовали для определения кислых, нейтральных и основных изоформ лидирующего CXCR5-антитела. Лидирующее CXCR5-антитело имело распределение кислых/нейтральных/основных изоформ 14/85/1%.

На фиг. 16 показано измерение DLS, которое использовали для определения гидродинамического диаметра мономера и потенциальных растворимых агрегатов антитела.

Фиг. 17 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в ацетатном буфере с pH 5,0 (слева) и pH 5,5 (справа); каждый по сравнению с WFI (водой для инъекции) и после термического стресса. Данная фигура показывает, что ацетат является подходящей буферной системой.

Фиг. 18 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в гистидиновом буфере с pH 6,0 (слева), pH 5,5 (в середине) и pH 5,0 (справа); каждый по сравнению с WFI (водой для инъекций) и после термического стресса. На данной фигуре показано, что гистидин является подходящим буфером.

Фиг. 19 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в трис-буфере с pH 7,5 после UF/DF (слева) и после фильтрации (справа); каждый против WFI (воды для инъекций) и после термического стресса. На данной фигуре показано, что трис является несовместимой буферной системой.

Фиг. 20 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в цитратном буфере с pH 6,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 21 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в ацетатном буфере pH с 5,5 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 22 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в сукцинатном буфере с pH 5,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 23 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в гистидиновом буфере с pH 5,0 после UF/DF и фильтрации.

Фиг. 24 представляет собой изображение лидирующего CXCR5-антитела в аргининовом буфере с pH 6,0 после UF/DF и фильтрации.

На фиг. 25 представлена картина внешнего вида растворов лидирующего CXCR5-антитела LA_09_016 с разными поверхностно-активными веществами (без поверхностно-активного вещества, с полисорбатом 20, полисорбатом 80, лутролом F68, кремофором RH40, солутолом HS15 и SDS) после механического стресса (350 об./мин, 2,5 часа, комнатная температура).

Фиг. 26 представляет собой график, который показывает увеличение количества димеров в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали, используя SEC. Можно было наблюдать увеличение образования димеров до 10% после трех месяцев хранения во всех четырех гистидиновых препаратах. В ацетатных препаратах наблюдали повышение содержания димеров до 6%. Во всех четырех цитратных препаратах концентрация димеров была ниже 2% даже после трех месяцев при +40°C.

Фиг. 27 представляет собой график, показывающий увеличение содержания основных изоформ в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали с использованием WCX. Гистидин является плохим для стабильности лидирующего CXCR5-антитела в условиях ускоренных испытаний. Можно отметить небольшое увеличение содержания основных изоформ для всех четырех ацетатных препаратов. Интересно, что невозможно было отличить между собой четыре цитратных препарата.

Фиг. 28 представляет собой график, показывающий уменьшение содержания нейтральных изоформ в условиях ускоренных испытаний, которое анализировали с использованием WCX. Данная фигура показывает сильное снижение содержания нейтральных изоформ в случае гистидиновых препаратов. Небольшое снижение наблюдали в ацетате. Цитрат влиял меньше всего.

На фиг. 29 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в цитратном буферу в условиях ускоренных испытаний. Препараты, в наибольшей степени стабилизирующие pH, забуферены цитратом и особенно препарат B и D.

На фиг. 30 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в ацетатном буфере в условиях ускоренных испытаний. В забуференных ацетатом растворах лидирующего CXCR5-антитела pH сдвигалось к более высокому значению.

На фиг. 31 показана разница pH всех четырех препаратов (A-D) в гистидиновом буфере в условиях ускоренных испытаний. В забуференных гистидином растворах лидирующего CXCR5-антитела значение pH немного снижалось.

Фиг. 32 представляет собой график, показывающий гидродинамический диаметр CXCR5 LA_09_027 A-D после 3 месяцев хранения при 40°C. В забуференных цитратом препаратах наблюдали только небольшие агрегаты спустя три недели в случае препарата C и после шести недель хранения в случае препарата A. Некоторое количество агрегатов также можно было выявить спустя три месяца в случае препарата B. Но по сравнению с забуференными ацетатом препаратами количество было очень маленьким.

Фиг. 33 представляет собой график, показывающий гидродинамический диаметр CXCR5 LA_09_028 A-D после 3 месяцев хранения при 40°C. В забуференном ацетатом препарате C наблюдали некоторое количество агрегатов <200 нм спустя три недели. В препарате A наблюдали некоторое количество агрегатов через три месяца.

Фиг. 34 представляет собой диаграмму, показывающую влияние возрастающих концентраций лидирующего CXCR5-антитела на Z-среднее. В случае лидирующего CXCR5-антитела наблюдали значимое увеличение гидродинамического диаметра (Z-среднее) при возрастании концентрации антитела.

Фиг. 35 представляет собой диаграмму, показывающую влияние разных стабилизаторов (эксципиентов) на Z-среднее в случае концентрации 100 мг/мл лидирующего CXCR5-антитела после термического стресса. Z-среднее измеряли до и после термического стресса. Стабилизирующий эффект был сходен в случае всех тестированных эксципиентов, но увеличение Z-среднего, в общем, было понижено при использовании в качестве стабилизаторов аминокислот (аргинина, лизина или глицина). Лизин исключали из-за более высокого содержания агрегатов после стресса. Аргинин влиял лучше, чем глицин.

Фиг. 36 представляет собой диаграмму, показывающую влияние разных стабилизаторов на Z-среднее в случае концентрации 100 мг/мл лидирующего CXCR5-антитела после механического стресса. Z-среднее измеряли до и после механического стресса. Такое же снижение Z-среднего было отмечено в присутствии аминокислот. Сахароза оказывала лучшее защитное действие, чем трегалоза от механического стресса. Аргинин и глицин работали лучше в сочетании с NaCl.

Фиг. 37 представляет собой набор графиков, показывающих распределение размера частиц, которое измеряли, используя DLS, лидирующего CXCR5-антитела, приготовленного в виде препарат в 10 мМ цитратном буфере при pH 6, до механического стресса (A) и после механического стресса (B). Виды с более высокой молекулярной массой измеряли, используя DLS, после механического стресса лекарственной субстанции (ЛС).

Фиг. 38 представляет собой набор графиков, показывающих распределение размера частиц, которое измеряли, используя DLS, в прототипных препаратах лекарственного продукта лидирующего CXCR5-антитела (A-D; таблица 111) до (A) и после (B) механического стресса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

A. Определения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которые обычно подразумевает специалист в данной области.

Следует отметить, что в используемом в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа также включают указание и множественного числа, если контекст ясно не диктует иное.

Термин «примерно» или «приблизительно» означает в пределах 10%, например, в пределах 5% (или 1% или меньше) от данного значения или диапазона.

Термины «вводить» или «введение» относятся к действию, осуществляемому в виде инъекции или другой физической доставки пациенту вещества, которое находится вне организма (например, препарата согласно изобретению), такой как мукозальная, интрадермальная, внутривенная, подкожная, внутримышечная доставка и/или любой другой способ физической доставки, описанный в настоящей публикации или известный в данной области. В том случае, когда заболевание или его симптом подвергают лечению, введение вещества обычно происходит после появления заболевания или его симптомов. В том случае, когда заболевание или его симптомы подвергают профилактике, введение вещества обычно происходит до наступления заболевания или его симптомов.

В контексте полипептида термин «аналог» относится к полипептиду, который обладает сходной или идентичной функцией, что и полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело, но не обязательно содержит аминокислотную последовательность, сходную или идентичную аминокислотной последовательности полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело, или обладает структурой, сходной или идентичной структуре полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела. Полипептид, который имеет сходную аминокислотную последовательность, относится к полипептиду, который удовлетворяет, по меньшей мере, одному из следующих условий: (a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида LIGHT или CXCR5 (например, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:14, соответственно), фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела, описанного в настоящей публикации; (b) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело (или его VH- или VL-область), описанное в настоящей публикации, длиной по меньшей мере, 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 10 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 15 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 20 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 25 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 40 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 60 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 70 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 80 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 90 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере, 125 аминокислотных остатков, или по меньшей мере 150 аминокислотных остатков (смотрите, например, Sambrook с соавторами (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Maniatis с соавторами (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); и (c) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 99% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид LIGHT или CXCR5, фрагмент полипептида LIGHT или CXCR5, эпитоп LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитело (или его VH- или VL-область), описанные в настоящей публикации. Полипептид со структурой, сходной со структурой полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или анти-LIGHT- или анти-CXCR5-антитела относится к полипептиду, который имеет вторичную, третичную или четвертичную структуру, сходную со структурой полипептида LIGHT или CXCR5, фрагмента полипептида LIGHT или CXCR5, эпитопа LIGHT или CXCR5 или антитела против LIGHT или CXCR5. Структуру полипептида можно определить способами, известными специалистам в данной области, включая без ограничения рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс и кристаллографическую электронную микроскопию.

Чтобы определить идентичность в процентах двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в последовательность первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или