Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение

Лейкоцидины staphylococcus aureus, терапевтические композиции и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка претендует на дату приоритета временной патентной заявки США № 61/331550, поданной 5 мая 2010 г., раскрытие которой настоящим включено сюда в качестве ссылки.

ПЕРЕЧНИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит перечни последовательностей, которые были направлены на рассмотрение с помощью системы EFS-Web и настоящим целиком включены сюда в качестве ссылок. Указанная копия в формате ASCII, созданная 2 мая 2011 г., названа Sequence Listing_Staphylococcus Aureus Leucocidins_ST25.txt и имеет размер 102 килобайта.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактерии Staphylococcus aureus или стафилококки ("staph") обычно присутствуют на коже или в носовой полости людей и животных. Стафилококковые бактерии обычно являются безвредными, если только они не попадают в организм через порез или другую рану. Как правило, стафилококковые инфекции создают незначительные кожные проблемы для здоровых людей. Исторически, стафилококковые инфекции лечат антибиотиками широкого спектра действия, такими как метициллин. Однако в настоящее время появились определенные штаммы стафилококков, резистентные к метициллину и другим β-лактамовым антибиотикам, таким как пенициллин и цефалоспорины. Они называются метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (также известным как Staphylococcus aureus с множественной лекарственной резистентностью, или "MRSA").

Стафилококковые инфекции, включая MRSA, обычно начинаются с появления маленьких красных бугорков, напоминающих прыщи, нарывы или укусы пауков. Такие бугорки или пятна могут быстро превращаться в глубокие, болезненные абсцессы, требующие хирургического дренирования. Иногда бактерии остаются в пределах кожи. В некоторых случаях, они могут проникать далеко вглубь тела, вызывая потенциально опасные для жизни инфекции в широком спектре человеческих тканей, включая кожу, мягкие ткани, кости, суставы, хирургические раны, кровоток, сердечные клапаны, легкие или другие органы. Таким образом, инфекции S. aureus могут приводить к потенциально смертельным болезням, таким как некротизирующий фасцит, пневмония, эндокардит, сепсис, токсический шок, и различные формы пневмонии. Инфекция MRSA создает особенно много проблем в условиях больницы или медицинских учреждений по уходу за инвалидами и престарелыми, где пациенты часто имеют открытые раны, подвергаются инвазивным процедурам с помощью разных приспособлений, и имеют ослабленные иммунные системы и, таким образом, подвержены большему риску инфекции, чем население в целом. Сотрудники, не придерживающиеся надлежащих санитарных процедур, могут переносить бактерии MRSA от одного пациента к другому.

S. aureus продуцирует широкий спектр вирулентных факторов и токсинов, позволяющих этой бактерии нейтрализовать и противостоять атакам разных видов иммунных клеток, конкретнее, субпопуляций белых кровяных клеток, образующих первичную защитную систему организма. Продуцирование таких вирулентных факторов и токсинов позволяет S. aureus поддерживать инфекционное состояние. См. Nizet, J. Allergy Clin. Immunol. 120:13-22 (2007). Наряду с этими вирулентными факторами, S. aureus продуцирует несколько бикомпонентных лейкотоксинов, которые повреждают мембраны защитных клеток хозяина и эритроцитов в результате синергичного действия двух неассоциированных белков или субъединиц. См. Supersac, et al., Infect. Immun. 61:580-7 (1993). Из таких бикомпонентных лейкотоксинов лучше всего исследованы гамма-гемолизин (HlgAB и HlgCB) и лейкоцидин Пантона–Валентайна (Pantone-Valentine Leukocidin, PVL).

Токсичность лейкоцидинов по отношению к клеткам млекопитающих связана с действием двух компонентов. Первая субъединица называется субъединицей класса S (т.е. "медленно элюирующаяся"), и вторая субъединица называется субъединицей класса F (т.е. "быстро элюирующаяся"). S- и F-субъединицы действуют синергично, образуя поры в белых кровяных клетках, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейтрофилы (коллективно называемые фагоцитами). См. Menestrina, et al., Toxicol. 39:1661-1672 (2001). Механизм, по которому бикомпонентные токсины образуют поры в мембранах клетки-мишени, до конца не выяснен. Предложенный механизм действия этих токсинов включает связывание S-субъединицы с мембраной клетки-мишени, наиболее вероятно, через рецептор, с последующим связыванием F-субъединицы с S-субъединицей, с образованием при этом олигомера, который в свою очередь образует предпору (pre-pore), проникающую в мембрану клетки-мишени (Jayasinghe, et al., Protein. Sci. 14:2550-2561 (2005)). Поры, образованные бикомпонентными лейкотоксинами, типично являются катионселективными. Образование пор вызывает гибель клетки вследствие лизиса, который в тех случаях, когда мишенями являются белые кровяные клетки, как сообщалось, вызван нарушением осмотического баланса вследствие притока катионов (Miles, et al., Biochemistry 40:8514-8522 (2001)).

Известно, что в дополнение к PVL (также известным как лейкоцидин S/F-PV или LukSF-PV) и гамма-гемолизину (HlgAB и HlgCB), репертуар бикомпонентных лейкотоксинов, продуцируемых S. aureus, включает лейкоцидин E/D (LukED) и лейкоцидин M/F’ (LukMF’). Таким образом, субъединицы S-класса таких бикомпонентных лейкоцидинов включают HlgA, HlgC, LukE, LukS-PV и LukM, и субъединицы F-класса включают HlgB, LukD, LukF-PV и LukF’-PV (Menestrina, et al., supra.). S- и F-субъединицы S. aureus не являются лейкоцидин-специфичными. Это означает, что они являются взаимозаменяемыми таким образом, что другие бикомпонентные комбинации могут создавать функциональные поры в белой кровяной клетке, значительно расширяя репертуар лейкотоксинов (Meyer, et al., Infect. Immun. 77:266-273 (2009)).

Разработка эффективной терапии для лечения инфекции MRSA является особенно сложной проблемой. Было обнаружено, что в дополнение к вышеупомянутой резистентности к метициллину и родственным антибиотикам, MRSA также проявляет значительные уровни резистентности к макролидам (например, эритромицину), комбинациям ингибитора бета-лактамазы (например, уназин, аугментин) и фторхинолонам (например, ципрофлоксацин), а также к клиндамицину, триметоприму/сульфаметоксизолу (Bactrim) и рифампину. В случае серьезной инфекции S. aureus, клинические врачи прибегают к использованию внутривенно ванкомицина. Однако имеются сообщения о резистентности S. aureus к ванкомицину. Таким образом, существует потребность в разработке новых препаратов антибиотиков, эффективно борющихся с инфекцией S. aureus.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители обнаружили и охарактеризовали другой бикомпонентный член защитной системы нативного Staphylococcus aureus. Новый охарактеризованный полипептидный компонент нативной S-субъединицы, обозначенный здесь "LukA", охватывает нативные полипептиды и их аналоги, имеющие степень подобия последовательностей, по меньшей мере, 70% с последовательностями нативных полипептидов. Таким образом, один аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного LukA. Другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного полинуклеотида, кодирующего LukA, трансформированного хозяина (например, клетки), содержащего полинуклеотид, и способов получения рекомбинантного LukA путем экспрессии полинуклеотида в трансформированном хозяине.

Новый охарактеризованный полипептидный компонент F-субъединицы, обозначенный здесь "LukB", охватывает нативные полипептиды и их аналоги, имеющие степень подобия последовательностей, составляющую, по меньшей мере, 70% с последовательностями нативных полипептидов. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного LukB. Другой аспект настоящего изобретения касается изолированного и/или очищенного полинуклеотида, кодирующего LukB, трансформированного хозяина (например, клетки), содержащего полинуклеотид, и способов получения рекомбинантного LukB путем экспрессии полинуклеотида в трансформированном хозяине.

Еще один аспект данной заявки касается терапевтических композиций, пригодных для ингибирования начальных проявлений или лечения инфекции Staphyloccocus aureus, содержащих терапевтически эффективные количества LukA и/или LukB в композиции с фармацевтически приемлемым носителем. Таким образом, в одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество LukA. В другом варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество LukB. В еще одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества обоих LukA и LukB. В еще одних вариантах исполнения, композиция содержит аналог LukA с отсутствующими 10 C-концевыми остатками, являющийся нетоксичным (обозначается здесь LukAΔ10C или rLukAΔ10C). Такие композиции пригодны для комплексного терапевтического применения. В некоторых вариантах исполнения, композиции называются противовоспалительными композициями и могут быть использованы для лечения острых воспалительных состояний или расстройств, в частности, локализованных острых воспалительных состояний.

Такое применение использует сделанные заявителями дополнительные открытия того, что в физиологических условиях (т.е. LukAB продуцируется непосредственно S. aureus), комплекс LukAB обладает исключительной специфичностью к фагоцитам, но не к другим ядросодержащим клеткам, таким как эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки. Это означает, что комплекс образует поры в мембранах таких видов клеток, тем самым вызывая гибель клетки, что называется здесь "LukAB-опосредованной цитотоксичностью". С другой стороны, LukAB обладает относительно небольшой или пренебрежимо малой специфичностью по отношению к другим ядросодержащим клеткам млекопитающих. Таким образом, противовоспалительные композиции по настоящему изобретению используют специфичность LukAB к человеческим фагоцитам в целях лечения острых воспалительных состояний, характеризующихся массивной инфильтрацией фагоцитов к месту воспаления.

В других вариантах исполнения, терапевтические композиции могут быть названы композицией (активной) вакцины. Композиции могут быть использованы для индукции продуцирования нейтрализующих антител к LukA и к LukB у субъекта с риском инфекции S. aureus или субъекта с диагностированной инфекцией S. aureus, такой как MRSA.

Другие аспекты настоящего изобретения касаются антител, которые специфически связывают LukA, антител, которые специфически связывают LukB, терапевтических композиций, содержащих антитела LukA и/или LukB, и их применения для лечения инфекционных состояний, связанных с S. aureus. Такие терапевтические композиции могут быть названы пассивными композициями вакцины. Таким образом, в одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество антител к LukA. В другом варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество антител к LukB. В еще одном варианте исполнения, терапевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества как антител к LukA, так и антител к LukB.

Пассивные и активные композиции вакцин по настоящему изобретению используют еще одно сделанное заявителями открытие - что инфекционные вирулентные штаммы S. aureus, такие как MRSA, экспрессируют LukA и LukB. Неизменность LukA и LukB для широкого спектра штаммов S. aureus позволяет вакцинам по настоящему изобретению обеспечивать полный спектр терапевтической эффективности. LukA, LukB, антитела к LukA и антитела к LukB также называются здесь активными агентами.

Другой аспект настоящего изобретения касается способов применения LukAB, LukA и/или LukB для идентификации потенциальных ингибиторов LukAB-опосредованной цитотоксичности. Такие способы могут использовать комплекс LukAB, per se, в комбинации с фагоцитом, или его часть, связывающуюся с мембраной фагоцита. Идентифицированные таким образом ингибиторы могут быть кандидатами для терапии с целью лечения инфекции S. aureus.

Еще один аспект настоящего изобретения касается способа прогнозирования или оценки тяжести инфекции S. aureus, предусматривающего детектирование присутствия или количества LukA и/или LukB, или детектирование соответствующих генов LukA и/или LukB, в биологическом образце, полученном от инфицированного субъекта. Этот аспект настоящего изобретения основан на еще одном сделанном заявителями открытии - того, что из многих цитотоксинов, продуцируемых S. aureus, LukAB проявляет сильную токсичность по отношению к человеческим фагоцитам. Таким образом, детектирование присутствия или относительно высоких количеств LukA и/или LukB, или их соответствующих генов (например, демонстрируемое штаммами S. aureus Newman, 4645 и штаммами MRSA USA300 и USA500) по сравнению с контролем (например, штаммами S. aureus USA100 и USA400), который продуцирует небольшие или недектируемые количества LukA и/или LukB, указывает на тяжелую инфекцию S. aureus.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения более полно описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой выравнивание, содержащее аминокислотную последовательность мажоритарной (majority) последовательности LukA (обозначенной как SEQ ID NO:1) и полипептидов LukA от тринадцати (13) разных штаммов S. aureus, которым она соответствует (обозначенным как SEQ ID NO:2-14).

Фигура 2 представляет собой выравнивание, содержащее аминокислотную последовательность мажоритарной последовательности LukB (обозначенной как SEQ ID NO:15) и полипептидов LukB от двенадцати (12) разных штаммов S. aureus, которым она соответствует (обозначенным как SEQ ID NO:16-27).

Фигура 3. LukAB является сильным стафилококковым цитотоксином, который нацелен на и уничтожает первичные человеческие фагоциты. (a) Интоксикация первичных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) фильтратом культуры (2,5% об./об.) S. aureus, штамм Newman (дикого типа, WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, где клетки, обработанные средой, принимались за 100%. Результаты представляют средние значения для трех параллельных образцов + стандартное отклонение (S.D.). (b) Интоксикация первичных человеческих моноцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC) фильтратом культуры (2,5% об./об.) S. aureus, штамм Newman (WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как описано выше. Результаты представляют среднее для двух доноров, где клетки от каждого донора интоксицируют тремя независимыми препаратами экзопротеина, + S.E.M. (стандартная ошибка средней). (c) Интоксикация первичных человеческих PMN (полиморфоядерных нейтрофилов) различными разбавлениями фильтратов культур S. aureus штамм Newman (WT) и указанных изогенных мутантных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как описано выше. Результаты представляют среднее для PMN, выделенных у четырех доноров ±S.E.M. (d) Интоксикация первичных человеческих PMN очищенными rLukA, rLukB, или комбинацией rLukA и rLukB в указанных концентрациях. * указывает статистическую значимость при сравнении с вместе взятыми rLukA и rLukB, P<0,05. Для панелей (a-c) * указывает статистическую значимость при сравнении с WT, ** указывает статистическую значимость при сравнении с ΔLukAB/p, P<0,05 (t-критерий Стьюдента p<0,05).

Фигура 4. LukAB предпочтительно нацелен на человеческие фагоцитарные клетки. Интоксикация (a, c и d) PMN-HL60 или (b) клеток THP1 различными разведениями фильтрата культуры S. aureus WT штамм Newman, изогенных мутантных штаммов, не содержащих указанных генов/токсинов, (c) фильтратом культуры S. aureus WT, содержащей пустую плазмиду (WT/p), штамма, не содержащего LukAB, с пустой плазмидой (ΔLukAB/p) и штамма, не содержащего LukAB, с LukAB-комплементирующей плазмидой (ΔLukAB/pLukAB), или (d) очищенным рекомбинантным LukA (rLukA), LukB (rLukB) или комбинаций rLukA и rLukB (rLukA+rLukB) в указанных концентрациях. Для интоксикаций вместе взятыми rLukA и rLukB, общая концентрация белка складывается из равных количеств rLukA и rLukB (например, 2,8 мкг общего белка соответствует 1,4 мкг rLukA и 1,4 мкг rLukB). (e) Интоксикация указанных человеческих клеточных линий 10 мкг/мл rLukAB. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. Символ звездочки (*) обозначает статистически значимое различие по сравнению с WT (однофакторный дисперсионный анализ).

Фигура 5. LukAB является важным токсином разных стафилококковых штаммов. (A) Экспрессия LukB различными штаммами S. aureus, определенная методом вестерн-блоттинга с использованием анти-LukB поликлональных сывороток. (B) Интоксикация PMN-HL60 разбавлениями экзопротеинов от разных штаммов S. aureus. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100% жизнеспособности. (C) Экспрессия LukB и α-токсина WT и LukAB-изогенными штаммами, определенная методом вестерн-блоттинга с использованием токсин-специфичных сывороток. (D) Интоксикация PMN-HL60 экзопротеинами WT-штаммов Newman (New.) и 4645 и LukAB-изогенных штаммов. Жизнеспособность клеток контролируют, как на панели B. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов + S.D. * обозначает статистически значимое различие по сравнению с Newman (C) или с WT (E) (t-критерий Стьюдента p<0,05).

Фигура 6. LukAB разрушает плазматические мембраны клеток-мишеней. (a) Полученные методом световой микроскопии изображения клеток PMN-HL60, интоксицированных фильтратом культуры S. aureus, штамма дикого типа (WT), и изогенного штамма, не содержащего LukAB (ΔLukAB). (b-c) Интоксикация клеток PMN-HL60 фильтратами культур штамма WT (WT/p), изогенного штамма, не содержащего LukAB (ΔLukAB/p), комплементированного штамма (ΔLukAB/pLukAB), или псевдо-интоксикация средой. Клетки с нарушенными мембранами окрашивают SYTOX Green, визуализируют методом флуоресцентной микроскопии (c) и измеряют интенсивность зеленой флуоресценции (b). (d) PMN инфицировали ex vivo S. aureus, штамм Newman (MSSA) или штамм USA300 LAC (MRSA), и указанными изогенными мутантами с различными кратностями инфекции (MOI). Повреждение мембраны контролируют с помощью красителя SYTOX green. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. Символы звездочки (*) обозначают статистически значимое различие по сравнению с WT (t-критерий Стьюдента p<0,05).

Фигура 7. LukAB защищает S. aureus от медиируемой хозяином гибели путем нацеливания на фагоциты и их уничтожения. (a) Инфекция клеток PMN-HL60 S. aureus WT, штаммом, не содержащим IukAB, и штаммом, не содержащим IukAB, с IukAB-комплементирующей плазмидой (ΔlukAB/plukAB), при различных кратностях инфекции (MOI). Клетки млекопитающих с нарушенными мембранами контролируют с помощью SYTOX Green, как описано на Фигуре 6. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов + S.D. (b) Жизнеспособность указанных штаммов S. aureus при ex vivo инфицировании человеческой цельной крови. Результаты представляют среднее для цельной крови, полученной от 12 доноров + S.E.M. (c) Жизнеспособность указанных S. aureus штаммов Newman при инфицировании первичных человеческих нейтрофилов (PMN). Результаты представляют среднее для PMN, полученных от 12 доноров + S.E.M. (d) Интоксикация первичных человеческих PMN различными разбавлениями фильтрата культуры штаммов WT/p, ΔlukAB/p и ΔlukAB/plukAB. В качестве индикатора клеточного лизиса измеряют высвобождение LDH (лактатдегидрогеназы). Результаты представляют среднее для PMN, полученных от 6 доноров + S.E.M. Символы звездочки (*) обозначают статистически значимое различие по сравнению с WT штаммом Newman (t-критерий Стьюдента p<0,05).

Фигура 8. LukAB важен для патогенеза S. aureus in vivo, (a) Биолюминесцентные изображения почек мышей, инфицированных WT штаммом LAC S. aureus, содержащим pXen1 или pLukAB.Xen1. Показаны почки двух типичных мышей в каждой группе. (b) Бактериальная нагрузка, выделенная из почек мышей, инфицированных ретроорбитально указанными штаммами S. aureus LAC. Каждая точка данных представляет число бактерий (CFU, колониеобразующих единиц) на миллилитр гомогената ткани для отдельного животного. Пунктирная линия показывает предел детектирования. Для панелей (A-C и E) * указывает статистическую значимость при сравнении с WT, ** указывает статистическую значимость при сравнении с ΔLukAB/p, P<0,05.

Фигура 9. LukAB уничтожает человеческие фагоциты путем образования пор в клеточных мембранах. (a) Клетки PMN-HL60 интоксицируют rLukA+rLukB и связывание токсина контролируют методами ДСН-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных к LukA или LukB. (b) PMN-HL60 инкубируют с rLukAB и связывание токсина определяют методом FACS (сортировки клеток с активируемой флуоресценцией) с использованием кроличьего анти-His антитела, (c) Клетки PMN-HL60 интоксицируют rLukAB и образование олигомеров LukAB в плазматической мембране определяют методом ДСН-ПААГ и иммуноблоттинга с использованием антитела к LukB, (d) PMN-HL60 интоксицируют rLukAB или обрабатывают сапонином в присутствии или в отсутствие ПЭГ-400. Поры LukAB детектируют бромидом этидия. (e) Жизнеспособность PMN-HL60, обработанных как указано на панели, определяют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты на панелях (d) и (e) представляют среднее для трех параллельных образцов ±SEM. * обозначает статистически значимое различие с ПЭГ (панели d-e) (t-критерий Стьюдента p<0,05).

Фигура 10. Цитотоксичность LukAB может быть нейтрализована с помощью α-LukA поликлонального антитела. PMN-HL60, интоксицированные 5% (об./об.) фильтратом культуры S. aureus штамм Newman, инкубируют с указанными количествами α-LukA поликлональных антител или неиммунной сывороткой, полученной из разных порций крови (production bleeds) двух разных кроликов. Жизнеспособность клеток контролируют с помощью CellTiter, принимая клетки, обрабатываемые средой, за 100%. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ± стандартное отклонение (S.D.).

Фигура 11. C-концевой выступающий участок LukA необходим для цитотоксичного эффекта LukAB, но не влияет на распознавание α-LukA поликлональным антителом. (a) Выравнивание аминокислотных последовательностей различных S-субъединиц лейкотоксина S. aureus (обозначенных как SEQ ID NO:44-49), проведенное с использованием метода MegAlign Clustal W прикладной программы Lasergene. N- и C-концевые выступающие участки, присутствующие только в последовательности LukA, обведены рамкой. (b) Окрашивание кумасси голубым 2 мкг рекомбинантного LukA (rLukA), LukB (rLukB), LukA, не имеющего C-концевого выступающего участка (rLukAΔ10C) и LukA, не имеющего N-концевого выступающего участка (rΔ33NLukA), выделенного из E. coli и разделенного методом ДСН-ПААГ, сопровождаемое интоксикацией PMN-HL60 различными количествами rLukA, rLukAΔ10C и rΔ33NLukA в комбинации с rLukB. Конечная концентрация белка состоит из равных количеств rLukA, rLukAΔ10C или rΔ33NLukA и rLukB. Результаты представляют среднее для трех параллельных образцов ±S.D. (c) Иммуноблот, демонстрирующий эквивалентность распознавания 6×His-меченого rLukAΔ10C как α-LukA, так и α-His поликлональными антителами.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ

Приведенное далее раскрытие касается, в последовательном порядке, полипептидов LukA, полипептидов LukB, полинуклеотидов LukA и LukB, антител к LukA и к LukB, терапевтических композиций, содержащих LukA и/или LukB, или антитела к LukA и/или к LukB, способов применения терапевтических композиций, способов идентификации ингибиторов LukAB-опосредованной цитотоксичности и способов прогнозирования или оценки тяжести инфекции S. aureus.

Полипептиды LukA

Полипептиды, нативные для Staphylococcus aureus, были изолированы и идентифицированы заявителями как проявляющие профиль активности известной S-субъединицы лейкоцидинов (например, LukS-PVL, LukE и HlgC). Такие полипептиды, обозначенные здесь коллективно как LukA, специфически нацелены на и связывают человеческие фагоциты (но не человеческие эпителиальные или человеческие эндотелиальные клетки, или мышиные клетки), и после связывания с мембраной фагоцита, LukA олигомеризуется с F-субъединицей лейкоцидина S. aureus (например, LukF-PVL, LukD и HlgB и LukB, раскрытые здесь), а после олигомеризации образуют трансмембранную пору (что обобщенно называется LukA-активностью). Выравнивание, приведенное на Фиг.1, содержит аминокислотные последовательности мажоритарной (majority) последовательности LukA (обозначенной здесь SEQ ID NO:1) и полипептидов LukA от 13 разных штаммов S. aureus, которым они соответствуют (обозначены здесь SEQ ID NO:2-14).

N-концевые 27 аминокислотных остатков каждой из SEQ ID NO:1-14 представляют нативную секреторную/сигнальную последовательность. Таким образом, зрелая секретируемая форма LukA, представленная аминокислотными остатками 28-351 в каждой из SEQ ID NO:1-14, может быть обозначена здесь "LukA(28-351)" или "зрелый LukA". Соответственно, незрелая форма LukA может быть обозначена здесь "LukA(1-351)".

Консенсусная последовательность LukA, определенная на основании SEQ ID NO:2-14 (которые не являются исчерпывающими по отношению к нативному LukA S. aureus) будет, таким образом, включать различающиеся варианты минимум в 64 положениях LukA (где последовательно расположенные положения изменчивости обозначены X¹-X⁶⁴), определяемые следующим образом: 8 (X¹=L или F), 16 (X²=A или V), 17 (X³=I или L), 24 (X⁴=T или Ν), 26 (X⁵=Q или Ε), 31 (X⁶=H или Ν), 38 (X⁷=N или Τ), 46 (X⁸=S или A), 50 (X⁹=E или D), 55 (X¹⁰=T или Ν), 56 (X¹¹=N или D), 61 (X¹²=S или Τ), 62 (X¹³=T или Ρ), 63 (X¹⁴=A, G или V), 73 (X¹⁵=I или V), 78 (X¹⁶=E или V), 77 (X¹⁷=T или S), 80 (X¹⁸=V или Ε), 83 (X¹⁹=E или Κ), 84 (X²⁰=E или Κ), 105 (X²¹=V или I), 124 (X²²=K или R), 125 (X²³=E или Ν), 127 (X²⁴=K, T или Ν), 129 (X²⁵=S или A), 130 (X²⁶=N или S), 135 (X²⁷=K или Q), 146 (X²⁸=R или S), 148 (X²⁹=R или Ρ), 173 (X³⁰=S или Ν), 174 (X³¹=S или L), 181 (X³²=T или V), 184 (X³³=I или V), 195 (X³⁴=T или S), 202 (X³⁵=N или Κ), 208 (X³⁶=S или I), 214 (X³⁷=W или R), 221 (X³⁸=I или V), 229 (X³⁹=G или Ν), 231 (X⁴⁰=V или I), 237 (X⁴¹=E или D), 239 (X⁴²=L или F), 243 (X⁴³=N или Τ), 246 (X⁴⁴=I или L), 247 (X⁴⁵=A или S), 278 (X⁴⁶=L или I), 283 (X⁴⁷=S или Τ), 285 (X⁴⁸=E или D), 288 (X⁴⁹=Q или R), 299 (X⁵⁰=I или V), 303 (X⁵¹=R или Κ), 309 (X⁵²=A или G), 310 (X⁵³=P или Q), 315 (X⁵⁴=K или Q), 318 (X⁵⁵=D или Ε), 322 (X⁵⁶=L или F), 325 (X⁵⁷=T или V), 338 (X⁵⁸=V или I), 339 (X⁵⁹=D или Ε), 342 (X⁶⁰=S или Τ), 344 (X⁶¹=D, E или Q), 347 (X⁶²=P или S), 348 (X⁶³=Y или F) и 349 (X⁶⁴=K или R).

Полипептиды LukB

Полипептиды, нативные для Staphylococcus aureus, были идентифицированы заявителями как проявляющие профиль активности известной F-субъединицы лейкоцидинов (например, LukF-PVL, LukD и HlgB). Такие полипептиды, обозначенные здесь коллективно как LukB, специфически олигомеризуются с S-субъединицей лейкоцидина S. aureus (например, LukS-PVL, LukE и HlgC и LukA, раскрытыми здесь), связанной с человеческим фагоцитом; и после олигомеризации образуют трансмембранную пору в фагоците (что обобщенно называется LukB-активностью). Выравнивание, приведенное на Фиг.2, содержит аминокислотные последовательности мажоритарной последовательности LukB (обозначенной здесь SEQ ID NO:15) и полипептидов LukB от 12 разных штаммов S. aureus, которым они соответствуют (обозначены здесь SEQ ID NO:16-27).

N-концевые 29 аминокислотных остатков каждой из SEQ ID NO:15-27 представляют собой секреторную/сигнальную последовательность. Таким образом, зрелая секретируемая форма LukB, представленная аминокислотными остатками 30-339 в каждой из SEQ ID NO:16-27, может быть обозначена здесь "LukB(30-339)" или "зрелая LukB". Соответственно, незрелая форма LukB может быть обозначена здесь "LukA(1-339)".

Консенсусная последовательность LukB, определенная на основании SEQ ID NO:15-28 (которые не являются исчерпывающими по отношению к нативному LukB S. aureus) будет, таким образом, включать различающиеся варианты минимум в 49 положениях LukB (где последовательно расположенные положения изменчивости обозначены X¹-X⁴⁹), определяемые следующим образом: 5 (X¹=L или V), 6 (X²=C или Υ), 13 (X³=S или Τ), 15 (X⁴=A или Τ), 16 (X⁵=L или I), 19 (X⁶=A или Τ), 20 (X⁷=L или F), 23 (X⁸=F или L), 26 (X⁹=S или Τ), 28 (X¹⁰=Y или F), 34 (X¹¹=E или Κ), 36 (X¹²=K или Τ), 37 (X¹³=Q, T или A), 46 (X¹⁴=D или Ε), 59 (X¹⁵=S или Τ), 60 (X¹⁶=Q или Ε), 62 (X¹⁷=N или Κ), 64 (X¹⁸=T или S), 75 (X¹⁹=P или Κ), 95 (X²⁰=K или R), 98 (X²¹=N, d или Ε), 126 (X²²=S или делеция), 159 (X²³=R или Q), 163 (X²⁴=T или Ρ), 170 (X²⁵=S или Κ), 187 (X²⁶=L или I), 190 (X²⁷=S или Ρ), 192 (X²⁸=S или Τ), 193 (X²⁹=S или Τ), 193 (X²⁹=H или Ν), 197 (X³⁰=G или A), 204 (X³¹=S или L), 222 (X³²=D или Ν), 224 (X³³=T или V), 247 (X³⁴=N или D), 270 (X³⁵=N или Κ), 272 (X³⁶=K или Ε), 276 (X³⁷=R, Q или Κ), 287 (X³⁸=D или Ε), 290 (X³⁹=L или I), 294 (X⁴⁰=K или R), 309 (X⁴¹=Q или K0), 327 (X⁴²=D или Ν), 329 (X⁴³=L или F), 330 (X⁴⁴=I или V), 332 (X⁴⁵=t или V), 333 (X⁴⁶=f, I или L), 336 (X⁴⁷=K или Ν) и 338 (X⁴⁸=K или Q).

Лейкоцидины LukA и LukB могут отличаться от нативных полипептидов, обозначенных как SEQ ID NO:2-14 и 16-27, соответственно, вследствие одной или нескольких дополнительных инсерций, замещений или делеций аминокислот, например, один или несколько аминокислотных остатков в SEQ ID NO:2-14 или 16-27 могут быть замещены на другую аминокислоту схожей полярности, которая выступает в роли функционального эквивалента, приводя к молчащему изменению. Это означает, что изменение по сравнению с нативной последовательностью существенно не ослабит основные свойства нативных LukA и LukB. Примеры включают SEQ ID NO:1 и 15. Любой такой аналог LukA или LukB может быть подвергнут скринингу в соответствии с протоколами, раскрытыми здесь (например, анализ клеточной токсичности и анализ повреждения мембраны) для определения того, сохраняет ли он активность нативного LukA или LukB. Замещения в таких лейкоцидинах могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит данная аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

В других вариантах исполнения, неконсервативные изменения (например, одно или аминокислотных замещений, делеций и/или аддиций) могут быть проведены с целью инактивации или детоксификации LukA и LukB. В одном варианте исполнения, нетоксичный аналог LukA отличается от нативных полипептидов тем, что C-концевые аминокислоты в положениях 342-351 подвергаются делеции. За исключением SEQ ID NO:4-6 (которые содержат 9 аминокислот в этих положениях), в аналоге отсутствуют 10 C-концевых аминокислотных остатков. Коллективно, такие аналоги обозначаются LukAΔ10C. Детоксифицированные LukA и LukB могут быть использованы в композициях активных вакцин, описанных здесь. Молекулярные изменения могут быть проведены способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, включая метод удлинения праймера на плазмидной матрице с использованием одноцепочечных матриц (Kunkel, Proc. Acad. Sci., USA 82:488-492 (1985)), двухцепочечных ДНК-матриц (Papworth, et al., Strategies 9(3):3-4 (1996)), и ПЦР-клонирование (Braman, J. (ed.), IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2nd ed. Humana Press, Totowa, N.J. (2002). Способы определения того, будет ли данное молекулярное изменение LukA или LukB уменьшать цитотоксичность LukAB, описаны здесь.

Таким образом, учитывая приведенное выше описание и в целях настоящего изобретения, LukA может быть более широко описан как любая из последовательностей SEQ ID NO:1-14 (например, SEQ ID NO:2, которая представляет собой полипептид LukA, нативный для штамма Newman S. aureus), или (нативный или ненативный) полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% подобия с этими последовательностями.

Аналогично, с учетом приведенного выше описания и в целях настоящего изобретения, LukB может быть более широко описан как любая из последовательностей SEQ ID NO:15-27 (например, SEQ ID NO:27, которая представляет собой полипептид LukB, нативный для штамма Newman S. aureus), или (нативный или ненативный) полипептид, имеющий, по меньшей мере, примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% подобия с этими последовательностями.

Таким образом, если не будет указано иное, как незрелая, так и зрелая формы нативных LukA и LukB, и последовательности, имеющие менее 100% подобия с нативной LukA (т.е. нативные последовательности и аналоги в равной степени, коллективно обозначаемые здесь "LukA" и "LukB"), могут быть использованы в композициях и способах, и для приготовления антител к LukA и к LukB по настоящему изобретению.

Полинуклеотиды, кодирующие LukA и LukB, и способы синтеза или изоляции LukA и LukB

Лейкоцидины LukA и LukB могут быть синтезированы методами рекомбинантных ДНК, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, нуклеотидная последовательность (обозначенная SEQ ID NO:28), кодирующая полипептид LukA S. aureus (Newman) (SEQ ID NO:2), приведена ниже. Вырожденные последовательности (например, такие, которые могут быть полезны с учетом предпочтительно используемых кодонов у хозяев, выбранных для рекомбинантной экспрессии), кодирующие этот полипептид, и полинуклеотиды, кодирующие другие полипептиды LukA, известны в данной области техники или могут быть сконструированы квалифицированными специалистами в данной области техники.

Нуклеотидная последовательность (обозначенная здесь SEQ ID NO:29), кодирующая полипептид LukB S. aureus (Newman), (SEQ ID NO:27), приведена ниже. Вырожденные последовательности (например, такие, которые могут быть полезны с учетом предпочтительно используемых кодонов у хозяев, выбранных для рекомбинантной экспрессии), кодирующие этот полипептид, и полинуклеотиды, кодирующие другие полипептиды LukB, известны в данной области техники или могут быть сконструированы квалифицированными специалистами в данной области техники.

Полинуклеотиды, кодирующие LukA и LukB, могут быть экспрессированы в хозяине, таком как бактерии (E. coli), растения и/или дрожжи, и затем выделены и очищены. Альтернативно, лейкоцидины LukA и LukB могут быть выделены из бактерий S. aureus (например, штамм Newman) в соответствии со стандартными методиками. Таким образом, такие лейкоцидины могут быть выделены (из нативной или ненативной среды). Они также могут быть очищены так, чтобы они по существу не содержали других белков и клеточных компонентов, с которыми LukA и LukB S. aureus ассоциированы в своем нативном состоянии (т.е. белков и клеточных компонентов, присутствующих в клетках S. aureus) или ненативном состоянии (т.е. белков и клеточных компонентов рекомбинантной клетки-хозяина). Пригодные схемы очистки, которые типично предусматривают комбинацию, по меньшей мере, двух последовательных процедур, известны специалистам в данной области техники. См. Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, N.Y. (1982), использующие одну или комбинацию двух или больше стандартных методик, таких как аффинная хроматография на колонке и катионообменная жидкостная хроматография.

Антитела к LukA и антитела к LukB

Аспекты настоящего изобретения касаются антител к LukA, которые специфически связываются с LukA, и антител к LukB, которые специфически связываются с LukB, терапевтических композиций, содержащих антитела, и способов их применения. В целях настоящего изобретения, термин "антитело" включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител и генетически модифицированные формы антител и их комбинации. Более конкретно, термин "антитело", который используется взаимозаменяемо с термином "иммуноглобулин", включает полноразмерные (т.е. встречающиеся в природе или полученные с помощью процессов рекомбинации фрагментов нормального гена иммуноглобулина) иммуноглобулиновые молекулы (например, IgG-антитело) и их иммунологически активные фрагменты (т.е. включая специфический связывающий участок полноразмерной молекулы иммуноглобулина), которые также могут быть природными или синтетическими по характеру. Соответственно, термин "фрагмент антитела" включает участок антитела, такой как F(ab’)₂, F(ab)₂, Fab’, Fab, Fv, scFv и т.п. Независимо от структуры, фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который распознается полноразмерным антителом и, в контексте настоящего изобретения, специфически связывается с LukA, LukB или комплексом LukAB. Способы получения и скрининга фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области техн