Изопропилмалат синтаза из nicotiana tabacum и способы и ее применение

Изопропилмалат синтаза из nicotiana tabacum и способы и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение раскрывает ген изопропилмалат синтазы из Nicotiana tabacum и его варианты, гомологи и фрагменты. В частности, здесь описана модификация экспрессии этого гена или активности кодируемого им белка с целью изменения состава сложных эфиров сахарозы растения - такого как растение табака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сложные эфиры сахарозы общепризнанны в качестве обладающих инсектицидными свойствами в растениях, для них показана токсичность в отношении мягкотелых насекомых, в том числе тлей, клещей, медяницы грушевой и белокрылок, а также антибиотическая активность. Сложные эфиры сахарозы также рассматриваются как предшественники ароматических веществ, они накапливаются на поверхности листа в течение жизни растения. Они представляют собой устойчивые соединения, которые могут быть идентифицированы в сушеных и курительных изделиях. Этерифицированные низшие карбоновые кислоты высвобождаются из сложных эфиров сахарозы при нагревании. Эти низшие карбоновые кислоты представляют собой очень сильные ароматические молекулы и, как полагают, частично ответственны за восточный аромат табака. Сложные эфиры сахарозы образуются в клетках железистых трихом растения. Клетки железистых трихом также являются местом синтеза других экссудатов из листьев - таких как белки (филлопланины) и дитерпеноиды (цембреноиды и лабденоиды). Сахароза и небольшие карбоновые кислоты, которые этерифицируют сахарозу с образованием сложных эфиров сахарозы, образуются в двух различных метаболических путях.

Сорта табака различаются по количеству и качеству сложных эфиров сахарозы, присутствующих на поверхности листа. Как правило, сорта дымовой сушки Burley и Maryland накапливают небольшие количества сложных эфиров сахарозы с ацильными группами до пяти атомов углерода в длину, тогда как большинство восточных сортов и многие типы сигарного табака накапливают большие количества сложных эфиров сахарозы, имеющих ацильные группы до шести атомов углерода в длину и, в меньшей степени, в них обнаруживаются эфиры, имеющие ацильные группы до семи атомов углерода в длину. Дихотомия, наблюдающаяся в сложных эфирах сахарозы, образуемых сортами табака, связана с одним доминантным локусом, названным BMVSE (бета-метилвалерил содержащие сложные эфиры сахарозы) для его функционального аллеля и bmvse для его нефункционального аллеля. Геномный локус BMVSE расположен на хромосоме А табака.

Kroumova and Wagner (2009) General and Applied Plant Physiology 35, 3-4, p95-110 описывают попытки изменить содержание ацильных групп сложного эфира сахарозы в различных растениях с использованием обратного генетического подхода подавления (нокдауна) экспрессии изопропилмалат синтазы с помощью двухцепочечной интерферирующей РНК. В этом исследовании ген изопропилмалат синтазы из Solanum pennellii использовали для амплификации части гена из кДНК. Затем они были введены в смысловой и антисмысловой ориентации в конструкцию двухцепочечной интерферирующей РНК и трансформированы посредством Agrobacterium в Nicotiana tabacum T.I. 1068, Nicotiana glutinosa cv. 24a и S. pennellii. Результаты, полученные с использованием растений N. tabacum, обнаружили некоторые изменения в количестве ацильных групп сложных эфиров сахарозы вследствие пониженного бета-метилвалерил- и повышенного 2-метилбутирил-ацилирования по сравнению с нетрансформированными контролями. Тем не менее, полученные растения N. tabacum были фенотипически ослаблены, так как были хлоротичными и некоторые из них имели закручивающиеся листья. Аналогичным образом, трансформированные растения N. glutinosa и S. pennellii были фенотипически ослабленными. Авторы приходят к выводу, что изопропилмалат синтаза является ключевым ферментом и что ее ослабление, вероятно, будет приводить к больному растению.

Существует потребность в области техники в растениях, в которых композиция сложных эфиров сахарозы модулируется при минимизации нежелательных эффектов для растения. Задачей настоящего изобретения является удовлетворить этой потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на неожиданном открытии того, что модулирование активности или экспрессии гена изопропилмалат синтазы из Nicotiana tabacum приводит к изменению состава сложных эфиров сахарозы с меньшим числом нежелательных эффектов на общий метаболизм растений. Большинство этих эффектов осуществляется в трихомах растения и относятся к вторичному метаболизму. Таким образом, модулирование активности или экспрессии гена изопропилмалат синтазы Nicotiana tabacum, no существу, не приводит к изменениям во внешнем виде растения по сравнению с контрольным растением. Это выгодно, потому что растения могут быть использованы для коммерческого производства различных продуктов, при этом изменения во внешнем виде будут либо не приемлемы для промышленности, либо могут привести к неприемлемому снижению урожайности. Предпочтительно, чтобы профиль аромата аэрозоля, полученного из табака, мог быть модифицирован таким образом, чтобы можно было создать новые вкусовые профили. Кроме того, у растений, профиль сложных эфиров сахарозы которых был модифицирован, может быть изменена устойчивость к вредителям. Композиции сложных эфиров сахарозы могут быть выделены из растений для различных применений - например, в лекарствах, пищевых добавках, курительных ароматизаторах и в качестве компонентов органических пестицидов и тому подобном.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения приведены в прилагаемой формуле изобретения.

В первом аспекте здесь предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий или состоящий или состоящий в основном из последовательности, кодирующей изопропилмалат синтазу и, по меньшей мере, на 60% идентичной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14.

В другом аспекте здесь предусмотрен выделенный полипептид, кодируемый этим полинуклеотидом.

В другом аспекте здесь предусмотрен выделенный полипептид, последовательность которого, по меньшей мере, на 60% идентична SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15.

Конструкция, вектор или вектор экспрессии, содержащий выделенную полинуклеотидную последовательность, где указанная конструкция, вектор или вектор экспрессии необязательно дополнительно содержат промотор, содержащий, состоящий или состоящий в основном из последовательности, приведенной в SEQ ID NO:8 или его вариант, по меньшей мере, на 60% идентичный ему, или промотор трихомы или природный промотор изопропилмалат синтазы.

В другом аспекте здесь предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий в основном из SEQ ID NO:8, или его вариант, который, по меньшей мере, на 60% ему идентичен.

В другом аспекте здесь предусмотрен мутант, не встречающаяся в природе или трансгенная растительная клетка, содержащая, по меньшей мере, один из полинулеотидов, по меньшей мере, один из полипептидов, или конструкцию, вектор или вектор экспрессии из настоящего изобретения.

В другом аспекте здесь предусмотрен мутант, не встречающееся в природе или трансгенное растение, содержащие растительную клетку из настоящего изобретения.

В другом аспекте здесь предусмотрен способ модулирования количества сложных эфиров сахарозы в части растения, включающий стадии: (i) модулирования экспрессии или активности изопропилмалат синтазы в растении, где изопропилмалат синтаза предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность или полипептидную последовательность, описанные здесь; (ii) измерения количества сложных эфиров сахарозы, по меньшей мере, в части мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, полученных на стадии (i); и (iii) определение мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, в котором количество сложных эфиров сахарозы было изменено по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность изопропилмалат синтазы не модулировалась, и, предпочтительно, где внешний вид указанного мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, по существу, такой же, как у контрольного растения.

В другом аспекте здесь предусмотрен мутант, не встречающееся в природе или трансгенное растение, полученное или получаемое этим способом.

В другом аспекте здесь предусмотрен мутант, не встречающееся в природе или трансгенное растение, в котором экспрессия гена изопропилмалат синтазы или активность белка, кодируемого им, модулирована и, по меньшей мере, у части растения изменен состав сложных эфиров сахарозы по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность изопропилмалат синтазы не была модулирована, и где внешний вид указанного растения, по существу, такой же, как у контрольного растения.

В другом аспекте здесь предусмотрен растительный материал, включающий биомассу, семена или листья, содержащие клетки или ткани из этого растения.

В другом аспекте здесь предусмотрено табачное изделие, содержащее часть растения или растительного материала в соответствии в настоящим изобретением.

В другом аспекте здесь предусмотрен способ производства композиции сложных эфиров сахарозы, включающий стадии: (i) получения, по меньшей мере, части мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, растительного материала или табачного изделия в соответствии с настоящим изобретением; (ii) выделения из них (например, одного или нескольких) сложных эфиров сахарозы; и (iii) необязательно, очистки выделенных сложных эфиров сахарозы.

Также предусмотрена композиция сложных эфиров сахарозы, полученная или получаемая указанным способом.

Соответственно, один или несколько сложных эфиров сахарозы имеют структуру, такую как показано на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил или водород, предпочтительно ацетил; один или несколько из R1, R2 и R4 содержат, по меньшей мере, одну ацильную цепь с 6 атомами углерода, предпочтительно бета-метилвалерил; и R5 представляет собой ацетил или водород, предпочтительно водород.

Соответственно, один или несколько сложных эфиров сахарозы выбирают из группы, состоящей из сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = пропионил или его изомер, R4 = гесканоил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил (С2С14:0); сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = валерил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = гексаноил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил (С2С15:0); сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой валерил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С16:0); или сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой пропионил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер, и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С16:0); сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С17:0); или сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой гексаноил, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С18:0), или их комбинацию.

Соответственно, один или несколько сложных эфиров сахарозы выбирают из группы, состоящей из сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = валерил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = гексаноил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил (С2С15:0); сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой валерил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С16:0); или сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой пропионил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер, и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С16:0); сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С17:0); или сложного эфира сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой гексаноил, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу (С2С18:0), или их комбинацию.

В еще одном аспекте здесь предусмотрен способ модулирования аромата табака или табачного изделия, включающий: (i) добавление к табаку или табачному изделию части растения, предпочтительно листьев, из мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, или растительного материала, как описано здесь, предпочтительно, где указанный мутант, не встречающееся в природе или трансгенное растение или растительный материал принадлежат к роду Nicotinia; или (ii) добавление к табаку или табачному изделию композиции, включающей содержащие бета-метилвалерил сложные эфиры сахарозы, полученной или получаемой способом, описанным здесь.

В еще одном аспекте здесь предусмотрен способ получения бета-метилвалериановой кислоты, включающий стадии: (i) получения, по меньшей мере, части мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, растительного материала или табачного изделия; (ii) гидролиза материала, полученного на стадии (i), или его экстракта; и (iii) необязательного выделения или очистки бета-метилвалериановой кислоты. Соответственно, растение представляет собой растение табака - например, из рода Nicotiana или вида Nicotiana tabacum.

Соответственно, внешний вид растения, по существу, такой же, как у контрольного растения. Соответственно, внешний вид растения, по существу, такой же, как у контрольного растения спустя три месяца после высадки в поле или спустя 36 дней после укорачивания верхушки, преимущественно, такой, что высота стебля мутантов, не встречающихся в природе или трансгенных растений, по существу, такая же, как высота стебля контрольного растения спустя три месяца после высадки в поле или спустя 36 дней после укорачивания верхушки, и/или содержание хлорофилла в мутанте, не встречающимся в природе или в трансгенном растении, по существу, такое же, как содержание хлорофилла в контрольных растениях спустя три месяца после высадки в поле или спустя 36 дней после укорачивания верхушки. В других вариантах воплощения любая одна или несколько из таких характеристик как степень зрелости, число листьев на растение, высота стебля, угол вставки листа, размер листа (ширина и длина), расстояние между междоузлиями, отношение пластинка/жилки и окраска листьев у мутанта, не встречающегося в природе или трансгенного растения, по существу, такая же, как у контрольных растений спустя три месяца после высадки в поле или спустя 36 дней после укорачивании верхушки.

Еще один аспект относится к биомассе, семенам или листьям, содержащим клетки и ткани из растения (растений), описанных здесь, представляющим собой табачное изделие, содержащее часть растений или биомассы, семян или листьев.

Также в еще одном аспекте данного описания предусмотрен табачный материал, определенный или определяемый описанным здесь способом.

Устойчивость растения к вредителям может быть изменена.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения приведены ниже.

Предусмотрен химерный ген, содержащий выделенный полинуклеотид, который функционально связан с одним или несколькими регуляторными последовательностями.

Предусмотрена полинуклеотидная конструкция изопропилмалат синтазы, содержащая, состоящая или состоящая преимущественно из, по меньшей мере, 15-30 нуклеотидов, 30-50 нуклеотидов 50-100 нуклеотидов, 100-150 нуклеотидов, 150-200 нуклеотидов, 200-300 нуклеотидов, 300-400 нуклеотидов, 400-500 нуклеотидов, 500-600 нуклеотидов, 600-700 нуклеотидов, 700-1000 нуклеотидов, 1000-1300 нуклеотидов, 1300-1500 нуклеотидов или 1500-1900 нуклеотидов.

Предусмотрен продукт, который включает или в котором использованы растительный материал, биомасса, семена или листья в соответствии с настоящим изобретением.

Предусмотрена клетка или клеточная линия, содержащая выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидную конструкцию, двухцепочечную РНК, конъюгат или вектор экспрессии и тому подобное в соответствии с настоящим изобретением.

Предусмотрен способ модулирования экспрессии изопропилмалат синтазы или активности белка, кодируемого таким образом в клетке, где указанный способ включает введение химерного гена, полинуклеотидной конструкции, двухцепочечной РНК, конъюгата или вектора экспрессии, описанных здесь.

Способ обнаружения, выделения, амплификации или анализа полинуклеотида изопропилмалат синтазы, где способ включает стадии получения образца, содержащего полинуклеотид, и гибридизации указанного полинуклеотида с молекулой полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 10 последовательных нуклеотидов из выделенной нуклеотидной последовательности в соответствии с настоящим изобретением.

Применение агента, который модулирует экспрессию изопропилмалат синтазы или активность белка, кодируемого таким образом, для модулирования содержания сложных эфиров сахарозы, по меньшей мере, в части растения - например, в листьях.

В одном варианте воплощения агент является нуклеиновой кислотой изопропилмалат синтазы, химерным геном изопропилмалат синтазы, полинуклеотидной конструкцией, содержащей полинуклеотид изопропилмалат синтазы, антисмысловой РНК, двухцепочечной РНК, кДНК, конъюгатом, содержащим полинуклеотид изопропилмалат синтазы и, по меньшей мере, один не нуклеотидный фрагмент или не полинуклеотидный фрагмент, ковалентно присоединенный к нему, рибозимом, мутагеном, белком с цинковым пальцем, низкомолекулярным соединением или мегануклеазой, или является их производными.

В другом варианте воплощения полинуклеотидный фрагмент (фрагменты) кодируют антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим, РНК, которая влияет на сплайсосома-опосредованный транс-сплайсинг, интерферирующую РНК (РНКи), гидовую РНК (guide RNA) или другую не транслируемую РНК и тому подобное. В другом варианте воплощения полинуклеотидный фрагмент (фрагменты) кодирует РНКи.

Еще один аспект относится к способу получения табачного продукта, включающего стадии: (а) получения семян от трансгенного, мутантного или не встречающегося в природе растения, описанного здесь; (b) посадки и выращивания семян; (с) сбора урожая растения; и (d) производства табачного продукта из собранного урожая растения.

Вышеупомянутые варианты воплощения раскрыты в качестве вариантов воплощения каждого из аспектов, описанных выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 иллюстрирует подсчитанное количество изомеров сложных эфиров сахарозы, измеренное в экссудатах из листьев. Измерение проводили в ацетон/метанольных смывах с зеленых дисков листа сорта табака bmvse Hicks Broadleaf (HBL) и сорта табака BMVSE Red Russian (RR). Количество оценивали с добавлением октаацетата сахарозы в качестве внешнего стандарта. n=4 для каждого сорта. С2С12:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = пропионил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = ацетил, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил. С2С13:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = бутирил, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = пропионил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = пропионил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил. С2С14:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = пропионил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложного эфира сахарозы, такого, как показано на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил. С2С15:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = валерил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахароз, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = гексаноил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; С2С16:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, который имею общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой валерил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу; или где сложный эфир сахарозы имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой пропионил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу. С2С17:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы такой, как показан на Фигуре 5, где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу. С2С18:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы такой, как показан на Фигуре 5, где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой гексаноил, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу.

На Фигуре 2 показаны основные изомеры сложных эфиров сахарозы, упорядоченные по молекулярной массе и их встречаемости в сортах табака, продуцирующих или не продуцирующих сложные эфиры сахарозы, содержащие бета-метилвалериановые эфиры. Не делается различия между 2- и 3-метилбутириловыми или 3- и 4 метилвалериановыми эфирами, перечисленными как С5 и С6, соответственно. Следующая номенклатура используется для определения состава ацильных групп. Например, обозначение С2С4С4С5 относится к числу атомов углерода в ацильных группах в R3, R1, R2 и R4, соответственно. С2 может быть ацетилом; С3 может быть пропионилом или его изомером; С4 может быть бутирилом или изобутирилом; С5 может быть валерилом (пентаноилом), или его изомером, или 2-метил-бутирилом, или изовалерилом, или изопентеноилом, или пентеноилом; С6 может быть гексаноилом, или его изомером, или 2-метилвалерилом, или бета-метилвалерилом, или 4-метилвалерилом. В R5 (не показано) может присутствовать ацетил или водород, в данном случае соответственно водород.

Фигура 3 иллюстрирует путь синтеза аминокислот с разветвленной цепью и образование ацильных цепей, этерифицирующих сахарозу. Заключенные в рамку стадии представляют основные стадии пути синтеза разветвленной аминокислотной цепи, где углеродные цепи удлиняются на один атом углерода в цикле конденсации изомеризации и декарбоксилирования. 1: ацетолактат синтаза [2.2.1.6]; 2: изомероредуктаза ацетогидроксикислот [1.1.1.86]; 3: дегидратаза 3,4-дигидроксикислоты [4.2.1.9]; 4: аминотрансфераза аминокислот с разветвленными цепями [2.6.1.42]; 5: дегидрогеназный комплекс кетокислот с разветвленными цепями (BCKD) ([1.2.4.4] [2.3.1.168] [1.8.1.4]); 6: синтаза изопропилмалата [2.3.3.13]; 7: изомераза изопропилмалата [4.2.1.33]; 8: дегидрогеназа изопропилмалата [1.1.1.85]; 9: деаминаза треонина [4.3.1.19]. С4: эфир изобутановой кислоты; iC5: эфир 3-метил-бутановой кислоты (изовалериановый эфир); aiC5: эфир 2-метил-бутановой кислоты (антеизо-валериановый эфир); iC6: 4-метил-валериановый эфир (эфир изокаприловой кислоты); aiC6: 3-метил-валериановый эфир (эфир антеизо-каприловой кислоты), β-метилвалериановый эфир, BMV). Карбоновые кислоты представлены в нейтральной форме, хотя названия отражают также растворимые формы. Стадии, предположительно катализируемые IPMS2, обведены кружком.

На Фигуре 4 приведена оценка содержания тетраэфиров сахарозы в экссудате с поверхности листа трансформированного растения. Листья собирали с одномесячных регенерирующих растений, полученных в результате независимых трансформаций. Внутренний стандарт (октаацетат сахарозы) добавляли в количестве 2,5 нг/мг сырой массы. Площадь сигнала, записанного для иона, специфичного для каждого сложного эфира сахарозы, измеряли и отображали как отношение к площади сигнала внутреннего стандарта. Отношение к площади сигнала от внутреннего стандарта позволяет нормализовать сигналы на сырую массу листа. Представленная здесь номенклатура сложных эфиров сахарозы описана на Фигуре 2. А: состав экссудатов из листьев исходного сорта K326 (сорт дымовой сушки, n=3) и трансформантов, экспрессирующих SEQ ID NO:1 под контролем специфичного промотора трихомы; В: состав экссудатов из листьев исходного сорта K326 и трансформантов, экспрессирующих SEQ ID NO:1 под контролем вирусного промотора; С: состав экссудатов из листьев исходного сорта Basma (восточный, n=4) и трансформантов, экспрессирующих конструкцию РНКи SEQ ID NO:9 под контролем специфичного промотора трихомы; и D: состав экссудатов из листьев исходного сорта Basma и трансформантов, экспрессирующих конструкцию РНКи SEQ ID NO:9 под контролем вирусного промотора. С2С14:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = пропионил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил. С2С15:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = пропионил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = валерил или его изомер, R2 = валерил или его изомер, R4 = валерил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; или сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 = ацетил, R1 = бутирил, R2 = гексаноил или его изомер, R4 = гексаноил или его изомер и R5 представляет собой водород или ацетил; С2С16:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, который имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой валерил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу; или где сложный эфир сахарозы имеет общую структуру, показанную на Фигуре 5, и где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой пропионил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил или его изомер, R4 представляет собой гексаноил или его изомер и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу. С2С17:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой валерил или его изомер, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу. С2С18:0 включает (насыщенный) сложный эфир сахарозы, такой, как показан на Фигуре 5, где R3 представляет собой ацетил, R1 представляет собой гексаноил, R2 представляет собой гексаноил, R4 представляет собой гексаноил и R5 представляет собой атом водорода или ацетильную группу.

Фигура 5 иллюстрирует структуру остова сложного эфира сахарозы. R1 - R5 представляют собой либо атом водорода, либо ацильную группу, присоединенную эфирной связью.

Фигура 6 иллюстрирует ацильные цепи, этерифицированные в сложные эфиры сахарозы. R' представляет молекулу сахарозы. 1. ацетил, 2. бутирил, 3. пропионил, 4. изобутирил, 5. валерил (пентаноил), 6. 2-метил-бутирил, 7. изовалерил, 8. изопентеноил, 9. пентеноил, 10. гексаноил или его изомер 11. 2-метилвалерил, 12. бета-метилвалерил, 13. 4-метилвалерил. Также рассматриваются их изомеры и производные. Таким образом, в качестве примера, изомером может быть изомер пропионила - например, изобутирил. В качестве еще одного примера, изомером может изомер валерила (пентаноила) - например, 2-метил-бутирил или изовалерил; или изомер валерила (пентаноила) с двойной связью - например, изопентеноил или пентеноил. В качестве еще одного примера, изомером может быть изомер гексаноила - например, 2-метилвалерил, бета-метилвалерил или 4-метилвалерил. Изомер может содержать или может не содержать одну или несколько двойных связей.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Технические термины и выражения, использованные в рамках данной заявки, как правило, имеют значение, обычно применяемое для них в данной области биологии растений и молекулярной биологии. Все следующие определения терминов приводятся для полноты содержания заявки. Слово "содержащий" не исключает другие элементы или стадии, и формы единственного числа не исключают множественного. Одна стадия может соответствовать функциям нескольких признаков, перечисленных в формуле изобретения. Термины "примерно", "в основном" и "приблизительно", в данном контексте, обозначающие величину или диапазон, относятся к величине или диапазону в пределах 20%, в пределах 10% или в пределах 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от заданного количества или диапазона.

Термин "выделенный" относится к любому объекту полученному из его природной среды, при этом термин не означает какую-либо степень очистки.

"Вектор" относится к переносчику нуклеиновой кислоты, который содержит комбинацию компонентов нуклеиновой кислоты, обеспечивающих транспорт нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты и конъюгатов нуклеиновой кислоты и тому подобное. Подходящие векторы включают эписомальные векторы, способные к экстра-хромосомальной репликации, например, кольцевые, двухцепочечные плазмиды нуклеиновых кислот; линеаризованные двухцепочечные плазмиды нуклеиновых кислот; и другие векторы любого происхождения.

"Вектор экспрессии" представляет собой переносчик нуклеиновой кислоты, который содержит комбинацию компонентов нуклеиновой кислоты, обеспечивающих экспрессию нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты и конъюгатов нуклеиновой кислоты и тому подобное. Подходящие векторы экспрессии включают эписомы, способные к экстра-хромосомной репликации, например, кольцевые, двухцепочечные плазмиды нуклеиновых кислот; линеаризованные двухцепочечные плазмиды нуклеиновых кислот; и другие функционально эквивалентные векторы экспрессии любого происхождения. Вектор экспрессии содержит, по меньшей мере, промотор, расположенный до нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты или конъюгата нуклеиновой кислоты и функционально связанный с ними, как определено ниже.

Термин "конструкция" относится к фрагменту двухцепочечной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащему один или несколько полинуклеотидов. Конструкция содержит "матричную цепь", спаренную с комплементарной "смысловой или кодирующей цепью". Данная конструкция может быть вставлена в вектор в двух возможных ориентациях, либо в той же (или смысловой) ориентации или в обратной (или анти-смысловой) ориентации по отношению к ориентации промотора, расположенного в векторе, таком как вектор экспрессии. Пример конструкции приведен в SEQ ID NO:9.

"Промотор" относится к элементу/последовательности нуклеиновой кислоты, обычно расположенному до фрагмента двухцепочечной нуклеиновой кислоты и функционально связанному с ним. Промоторы могут быть целиком получены из областей, прилегающих к представляющему интерес нативному гену, или могут быть составлены из различных элементов, полученных из различных нативных промоторов или синтетических сегментов нуклеиновой кислоты. Пример промотора приведен в SEQ ID NO:8.

Термин "гомология, идентичность или сходство" относится к степени сходства последовательностей двух полипептидов или двух молекул нуклеиновых кислот, сравниваемых по выравниванию последовательностей. Степень гомологии двух отдельных сравниваемых последовательностей нуклеиновых кислот представляет собой функцию числа идентичных, или совпадающих, нукпеотидов в сравниваемых позициях. Процент идентичности можно определить путем визуального просмотра и математического расчета. Альтернативно, процент идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот можно определить путем сравнения информации о последовательностях с использованием компьютерной программы, такой как ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA или Smith-Waterman.

Термин "растение" относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития, и к его потомству. В одном варианте воплощения растение представляет собой растение табака, которое относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana. Предпочтительные виды, сорта, гибриды и разновидности растения табака описаны здесь.

"Растительная клетка" относится к структурной и физиологической единице растения. Растительная клетка может представлять собой протопласт без клеточной стенки, выделенную одиночную клетку или культивируемую клетку, или может быть частью более организованной структуры, такой как, например, растительная ткань, орган растения или целое растение, но не ограничиваясь ими.

Термин "раст