Химерные антигенные рецепторы к cd22

Химерные антигенные рецепторы к cd22

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

По данной заявке на патент испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №61/549516, поданной 20 октября 2011 года, которая включена в этот документ в полном объеме посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

В этот документ включен посредством ссылки в полном объеме машиночитаемый перечень нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, поданный одновременно с данным документом и идентифицированный следующим образом: один ASCII (текстовый) файл размером 69127 байт под названием "711021_ST25.txt" от 18 октября 2012 года.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак представляет проблему для здоровья населения. Несмотря на достижения в способах лечения, таких как химиотерапия, прогноз для многих раковых заболеваний, в том числе гематологических злокачественных опухолей, может оказаться неблагоприятным. Например, установлено, что в 2000 году в Соединенных Штатах Америки ожидалось более 45000 смертельных случаев вследствие неходжкинской лимфомы и лейкемии (Greenlee et al., CA Cancer J. Clin., 50: 7-33 (2000)). Соответственно, существует востребованность в дополнительных способах лечения рака, особенно гематологических злокачественных опухолей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий: а) антигенсвязывающий домен HA22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки или b) антигенсвязывающий домен BL22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий i) CD28 и/или ii) CD137.

В последующих вариантах осуществления изобретения предложены родственные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части и фармацевтические композиции, относящиеся к химерным антигенным рецепторам (CARs) изобретения.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения предложены способы обнаружения наличия рака у млекопитающего и способы лечения или профилактики рака у млекопитающего.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг. 1 представлен график, показывающий лизис (в %) лейкозных клеток-мишеней, меченых ⁵¹Cr, посредством эффекторных T-клеток человека, трансдуцированны одним из следующих CARs: HA22 второго поколения, вариант 1 (■; закрашенный квадрат, SEQ ID NO: 15), HA22 третьего поколения (□; незакрашенный квадрат, SEQ ID NO: 16), BL22 второго поколения, вариант 1 (●; закрашенный круг, SEQ ID NO: 19), BL22 третьего поколения (○; незакрашенный круг, SEQ ID NO: 20), HA22-SH второго поколения, вариант 1 (▲; закрашенный треугольник, SEQ ID NO: 17), HA22-SH третьего поколения (∆; незакрашенный треугольник, SEQ ID NO: 18), мнимая трансдукция (нетрансдуцированный, X) или CD19-специфичный CAR (*) при различных соотношениях эффектора и мишени (Э:М). Соотношение Э:М показано по оси абсцисс, а лизис мишеней (в %) - по оси ординат. Фигура иллюстрирует прямой анализ клеточной линии SEM и является типичной для литического профиля, наблюдаемого и для других исследованных клеточных линий.

Фиг. 2A-2B представляют графики, показывающих лизис (в процентах) линий лейкозных клеток-мишеней KOPN8 (A) или NALM6 (B) посредством клеток-эффекторов, трансдуцированных одной из трех различных конструкций CAR к CD22 второго поколения, вариант 1: HA22-CH2CH3 (■; квадраты, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3, (▲; треугольник, SEQ ID NO: 19) или HA22-SH (последовательность короткого константного домена иммуноглобулина; X, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М. CAR к CD19 (♦; ромб) включен в качестве контроля. По оси ординат указан лизис клеток-мишеней в процентах. На оси абсцисс указаны соотношения Э:М, которые нормализованы в соответствии с трансдукцией (в процентах) каждой отдельной конструкции CAR, как описано в Примере 4. Линии проведены с использованием функции подбора логарифмической кривой в программе Excel (Microsoft).

Фиг. 3A-3B представляют графики, показывающих лизис (в процентах) линий лейкозных клеток-мишеней REH (A) или SEM (B) посредством клеток-эффекторов, трансдуцированных одной из трех различных конструкций CAR к CD22 второго поколения, вариант 1: HA22-CH2CH3 (■; квадраты, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3 (▲; треугольник, SEQ ID NO: 19) или HA22-SH (последовательность короткого константного домена иммуноглобулина, X, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М. CAR к CD19 (♦; ромб) включен в качестве контроля. По оси ординат указан лизис клеток-мишеней в процентах. На оси абсцисс указаны соотношения Э:М, которые нормализованы в соответствии с трансдукцией (в процентах) каждой отдельной конструкции CAR, как описано в Примере 4. Линии проведены с использованием функции подбора логарифмической кривой в программе Excel (Microsoft).

На Фиг. 4 представлена диаграмма, отражающая лизис (в процентах) линий клеток-мишеней K562 (темно-серые), REH (черные), SEM (белые) или NALM6 (светло-серые) посредством эффекторных T-клеток, трансдуцированных ретровирусным вектором, экспрессирующим одну из различных конструкций CAR: НА 2-го (SEQ ID NO: 15); НА 3-го (SEQ ID NO: 16); HASH 2-го (SEQ ID NO: 17) или HASH 3-го поколения (SEQ ID NO: 18). Ось абсцисс описывает каждую подвергшуюся испытанию популяцию трансфицированных клеток. Мнимая трансдукция: T-клетки, активированные и культивированные как другие группы, но не подвергнутые обработке ретровирусным супернатантом (с/н), содержащим вектор CAR (нетрансдуцированные). CAR к CD19 использован в качестве контроля.

На Фиг. 5A и 5B изображены графики, отображающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (ромбы), SEM (квадраты), NALM6 (треугольники), KOPN8 (X), Daudi (круги), Raji (|) или контрольной линии CD22-отрицательных клеток-мишеней K562 (*) посредством эффекторных нетрансдуцированных T-клеток (A, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17) (B, "HASH 28z") при различных соотношениях Э:М.

На Фиг. 6A и 6B представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (A), SEM (B), NALM-6 (С) или KOPN-8 (D) посредством эффекторных нетрансдуцированных Т-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR второго поколения, вариант 1 (круги, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) или BL22 CAR второго поколения, вариант 1 (квадраты, BL22 28z, SEQ ID NO: 19) при различных соотношениях Э:М.

На Фиг. 6E и 6H представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (E), SEM (F), NALM-6 (G) или KOPN-8 (H) посредством эффекторных нетрансдуцированных T-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR третьего поколения (круги, HA22 28BBz, SEQ ID NO: 16) или BL22 CAR третьего поколения (квадраты, BL22 28BBz, SEQ ID NO: 20) при различных соотношениях Э:М.

На Фиг. 6I-6L представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (I), SEM (J), NALM-6 (K) или KOPN-8 (L) посредством эффекторных нетрансдуцированных Т-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR второго поколения, вариант 1, с CH2CH3 доменом (круги, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) или без CH2CH3 домена (квадраты, HASH22 28z, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М.

На Фиг. 7A представлен график, показывающий биолюминисцентные сигналы (фотоны/с/см²/ср), генерированные реакцией люциферазы (трансфицированной в лейкозные клетки, которые были введены мышам) с люциферином, который был введен мышам, измеряемые в течение 30 дней. Мышей обрабатывали контрольными T-клетками («мнимая трансдукция», нетрансдуцированные, ▼) или T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17, закрашенные квадраты), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18, ▲) или HA22SH-CAR второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32, незакрашенные квадраты). Более высокие значения, выраженные в фотонах/с/см²/ср, указывают на более высокую опухолевую массу.

На Фиг. 7B представлен график, показывающий выживаемость в процентах мышей, обработанных контрольными T-клетками («мнимая трансдукция», нетрансдуцированные, круги) или T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17, квадраты), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18, ∆) или HA22SH второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32, ∇), измеряемую в течение 30 дней. (Мнимая трансдукция в сравнении с HA22SH 28z, p=0,001; мнимая трансдукция в сравнении с HA22SH 28BBz, Р=0,004; мнимая трансдукция в сравнении с HA22SHBBz, р=0,001; HA22SH 28Z в сравнении с HA22SH 28 BBz, p=0,03, HA22SH 28z в сравнении с HA22SH BBz, не существенно).

На Фиг. 8A-8D представлены диаграммы, показывающие единицы лизиса, рассчитанные как описано в Примере 4 для эффекторных клеток, трансдуцированных одним из рецепторов HA22 28z (SEQ ID NO: 15), HA22 28BBz (SEQ ID NO: 16), BL22 28z (SEQ ID NO: 19), BL22 28BBz (SEQ ID NO: 20), HASH22 28z (SEQ ID NO: 17) или HASH22 28BBz (SEQ ID NO: 18) при совместном культивировании с клетками-мишенями REH (A), SEM (B), NALM-6 (C) или KOPN-8 (D).

На Фиг. 9A-9C представлены диаграммы, показывающие количество интерферона (IFN)-γ (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих CARs: рецептор к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1 (HA22SH-28Z), HASH22 второго поколения, вариант 2 (HA22SH-BBZ) или HASH22 третьего поколения (HA22SH-28BBZ) при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).

На Фиг. 9D-9F представлены диаграммы, показывающие количество интерлейкина (IL)-2 (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих CARs: рецептором к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1, HASH22 второго поколения, вариант 2, или HASH22 третьего поколения при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).

На Фиг. 9G-9I представлены диаграммы, показывающие количество фактора некроза опухоли (TNF)-α (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих рецепторов CARs: рецептором к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1, HASH22 второго поколения, вариант 2, или HASH22 третьего поколения при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В варианте осуществления изобретения предложены химерные антигенные рецепторы (CARs), содержащие: a) антигенсвязывающий домен HA22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки или b) антигенсвязывающий домен BL22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий i) CD28 и/или ii) CD137.

Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственно сконструированный гибридный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающие домены антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), связанные с сигнальными доменами T-клетки. К характеристикам CARs относится их способность изменять направление специфичности и реакционной способности T-клеток в сторону выбранной мишени не рестриктированным по главному комплексу гистосовместимости образом, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. Не рестриктированное по главному комплексу гистосовместимости распознавание антигена придает T-клеткам, экспрессирующим CARs, способность распознавать антиген независимо от процессирования антигена, обходя тем самым основной механизм ускользания опухоли. Более того, при экспрессии в T-клетках CARs преимущественно не димеризуются с эндогенными альфа- и бета-цепями рецептора T-клетки (TCR).

Используемые в данном документе выражения «обладают антигенной специфичностью» и «вызывают антиген-специфическую реакцию» означают, что CAR может специфически связываться с антигеном и иммунологически распознавать его, так что связывание CAR с антигеном вызывает иммунный ответ.

CARs изобретения обладают антигенной специфичностью к CD22. CD22 представляет собой линиеспецифический B-клеточный антиген, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig). CD22 экспрессируется в 60-70% B-клеточных лимфом и лейкозов (например, при хроническом B-клеточном лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе, остром лимфоцитарном лейкозе (ALL) и лимфоме Беркитта) и не присутствует на клеточной поверхности на ранних стадиях развития В-клеток или на стволовых клетках. Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol., 11: 267-297 (1991); Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005).

Вне связи с какой-либо конкретной теорией или механизмом полагают, что, вызывая антиген-специфическую реакцию на CD22, изобретенные CARs обеспечивают одну или несколько из следующих возможностей: выбор в качестве мишени и разрушение CD22-экспрессирующих раковых клеток, сокращение или уничтожение раковых клеток, облегчение инфильтрации иммунных клеток в область(и) локализации опухоли и усиление/продление противораковых реакций. Поскольку CD22 не экспрессируется на ранних стадиях развития В-клеток или на стволовых клетках, предполагают, что изобретенные CARs преимущественно предотвращают главным образом выбор в качестве мишени/разрушение стволовых клеток и/или B-клеток на ранних стадиях развития.

В данном изобретении предложен CAR, содержащий антигенсвязывающий домен иммунотоксинов HA22 или BL22. Иммунотоксины BL22 и HA22 представляют собой терапевтические вещества, которые содержат scFV, специфичный к CD22, слитый с микробным токсином. Иммунотоксин связывается с поверхностью раковых клеток и убивает раковые клетки. BL22 содержит стабилизированный дисульфидом одноцепочечный вариабельный фрагмент (dsFv) антитела к CD22-RFB4, слитый с процессированной формой экзотоксина A массой 38 кДа, вырабатываемого Pseudomonas (Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005)). HA22 (CAT8015, moxetumomab pasudotox) представляет собой мутировавший вариант BL22 с повышенной аффинностью (Но et al., J. Biol. Chem., 280 (1): 607-17 (2005)).

Антигенсвязывающие домены HA22 и BL22 специфически связываются с CD22. Подходящие последовательности антигенсвязывающих доменов HA22 и BL22 раскрыты, например, в патентах США №7541034, 7355012 и 7982011, которые таким образом включены в данный документ в полном объеме путем ссылки. В связи с этим в предпочтительном варианте осуществления изобретения предложены CARs, содержащие антигенсвязывающий домен, который содержит, состоит из или состоит по существу из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антигенсвязывающего домена HA22 или BL22.

Каждый из антигенсвязывающих доменов HA22 и BL22 содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. Вариабельная область легкой цепи HA22 или BL22 может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 соответственно. Вариабельная область тяжелой цепи HA22 или BL22 может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 3 или 4 соответственно. Вследствие этого в варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 или 4.

В варианте осуществления изобретения вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть соединены линкером. Линкер может содержать любую подходящую аминокислотную последовательность. В варианте осуществления изобретения линкер может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 37.

В варианте осуществления антигенсвязывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. При этом антигенсвязывающие домены HA22 или BL22, каждый из которых содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, содержит, состоит из или состоит по существу из последовательности SEQ ID NO: 5 или 6 соответственно.

В варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность может быть расположена при амино-конце вариабельной области легкой цепи. Лидерная последовательность может содержать любую подходящую лидерную последовательность. В варианте осуществления лидерная последовательность представляет собой последовательность рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (GM-CSF). При этом антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность, содержащую, состоящую из или состоящую по существу из последовательности SEQ ID NO: 7. В варианте осуществления изобретения, когда лидерная последовательность может способствовать экспрессии CAR на поверхности клетки, присутствие лидерной последовательности в экспрессированном CAR не является необходимым для функционирования CAR. В варианте осуществления изобретения при экспрессии CAR на клеточной поверхности лидерная последовательность может отщепляться от CAR. Соответственно, в варианте осуществления изобретения CAR не содержит лидерную последовательность.

В варианте осуществления CAR содержит иммуноглобулиновый домен. Предпочтительно иммуноглобулиновый домен представляет собой последовательность человеческого иммуноглобулина. В варианте осуществления иммуноглобулиновый домен содержит последовательность (CH2CH3) доменов CH2 и CH3 иммуноглобулина G (IgG1). При этом CAR содержит иммуноглобулиновый домен, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 8. В варианте осуществления изобретения иммуноглобулиновый домен может содержать короткую последовательность константного домена иммуноглобулина. При этом CAR содержит иммуноглобулиновый домен, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 9 или 36. Вне связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что домен CH2CH3 продолжает связывающий мотив scFv далеко от мембраны CAR-экспрессирующих клеток и может более точно воспроизводить размер и доменную структуру нативного TCR.

В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен. В варианте осуществления изобретения трансмембранный домен содержит i) CD8 и/или ii) CD28. В предпочтительном варианте осуществления CD8 и CD28 являются человеческими доменами. CD8 или CD28 может включать не весь домен CD8 или CD28 соответственно. При этом CAR содержит а) трансмембранный домен CD8, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 10 или 33 и/или b) трансмембранный домен CD28, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 11.

В варианте осуществления изобретения CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий один или несколько доменов из i) CD28, ii) CD137 и iii) CD3 дзета (ζ). В предпочтительном варианте осуществления один или несколько доменов из CD28, CD137 и CD3 дзета являются человеческими. CD28 представляет собой T-клеточный маркер, имеющий важное значение в T-клеточной костимуляции. CD137, известный также под названием 4-1BB, передает мощный костимуляторный сигнал T-клеткам, способствуя дифференциации и увеличению длительной выживаемости T-лимфоцитов. CD3ζ связывается с TCR с образованием сигнала и содержит иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM). Один или несколько доменов из CD28, CD137 и CD3 дзета может включать не полный домен CD28, CD137 или CD3 дзета соответственно. При этом внутриклеточный сигнальный домен T-клетки содержит одну или несколько последовательностей из аминокислотной последовательности CD28, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 12, аминокислотной последовательности CD137, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 13 или 34, и/или аминокислотной последовательности CD3 дзета, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 14 или 35.

В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD28 и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 14. Предпочтительно CAR содержит a) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 8, 11, 12 и 14; b) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 8, 11, 12 и 14; или c) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 9, 11, 12 и 14.

В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8 и внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий CD28, CD137 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 10, 12, 13 и 14. Предпочтительно CAR содержит a) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 8, 10, 12, 13 и 14; b) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 13 и 14; или c) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 9, 10, 12, 13 и 14.

В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8 и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 33-35. Предпочтительно CAR содержит каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3 и 33-36.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения предложены CARs, содержащие, состоящие из или состоящие по существу из любых аминокислотных последовательностей, приведенных в Таблице 1.

В объем изобретения включены функциональные части изобретенных CARs, описанных в данном документе. Термин «функциональная часть» применительно к CAR относится к любой части или фрагменту CAR настоящего изобретения, которая(ый) сохраняет биологическую активность CAR, из которого она/он происходит (исходный CAR). Функциональные части охватывают, например, те части CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени или обнаруживать, лечить или предотвращать болезнь в похожей степени, в той же степени или в большей степени, чем исходный CAR. Что касается исходного CAR, функциональная часть может включать, например, приблизительно 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% или более исходного CAR.

Функциональная часть может содержать дополнительные аминокислоты на амино- или карбоксильном конце этой части или на обоих концах, причем эти дополнительные аминокислоты не обнаруживаются в аминокислотной последовательности исходного CAR. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали выполнению биологической функции функциональной части, например, распознаванию клеток-мишеней, диагностике рака, лечению или предотвращению рака и т.д. Более предпочтительно, чтобы дополнительные аминокислоты повышали биологическую активность по сравнению с биологической активностью исходного CAR.

В объем изобретения включены функциональные варианты изобретенных CARs, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин «функциональный вариант» относится к CAR, полипептиду или белку, последовательность которого по существу или в значительной степени идентична или сходна с последовательностью исходного CAR, при этом функциональный вариант сохраняет биологическую активность CAR, из которого он происходит. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, описанного в данном документе (исходного CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в похожей степени, в той же степени или в большей степени, чем исходный CAR. Что касается исходного CAR, функциональный вариант может, например, быть по своей аминокислотной последовательности идентичен исходному CAR по меньшей мере примерно на 30%, примерно на 50%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 85%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98%, примерно на 99% или более.

Функциональный вариант может, например, содержать аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой. В качестве альтернативы или дополнения, функциональные варианты могут содержать аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной неконсервативной аминокислотной заменой. В этом случае предпочтительно, чтобы неконсервативная аминокислотная замена не мешала или не ингибировала биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может усиливать биологическую активность функционального варианта, так что биологическая активность функционального варианта выше, чем у исходного CAR.

Аминокислотные замены изобретенных CARs являются предпочтительно консервативными заменами аминокислот. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области техники и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота с определенными физическими и/или химическими свойствами заменена на другую аминокислоту, которая имеет такие же или похожие химические или физические свойства. Например, консервативной аминокислотной заменой может являться кислая/отрицательно заряженная полярная аминокислота, замещенная на другую кислую/отрицательно заряженную полярную аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислота с неполярной боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val и т.д.), основная/положительно заряженная полярная аминокислота, замещенная на другую основную/положительно заряженную аминокислоту (например, Lys, His, Arg и т.д.), незаряженная аминокислота с полярной боковой цепью, замещенная на другую незаряженную аминокислоту с полярной боковой цепью (например, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr и т.д.), аминокислота с бета-разветвленной боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с бета-разветвленной боковой цепью (например, Ile, Thr и Val), аминокислота с ароматической боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с ароматической боковой цепью (например, His, Phe, Trp и Tyr) и т.д.

CAR по существу может состоять из заданной аминокислотной последовательности или последовательностей, описанных в данном документе, так что другие компоненты, например, другие аминокислоты, существенно не изменяют биологическую активность функционального варианта.

CARs в вариантах осуществления настоящего изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты) могут иметь любую длину, т.е. могут содержать любое количество аминокислот при условии, что CARs (или их функциональные части или функциональные варианты) сохраняют свою биологическую активность, например, способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать поврежденные клетки у млекопитающих или лечить либо предотвращать заболевания у млекопитающих и т.д. Например, CAR может быть длиной примерно от 50 до примерно 5000 аминокислот, например, 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более аминокислот.

CARs в вариантах осуществления изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты изобретения) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или нескольких природных аминокислот. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области техники и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-н-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин, β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)-карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутилглицин.

CARs в вариантах осуществления изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты) могут быть подвергнуты гликозилированию, амидированию, карбоксилированию, фосфорилированию, этерификации, N-ацилированию, циклизации, например, посредством дисульфидного мостика, или превращены в соль присоединения кислоты и/или необязательно могут быть димеризованы или полимеризованы, либо конъюгированы.

CARs в вариантах осуществления изобретения (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть получены способами, известными в данной области техники. CARs могут быть получены любым подходящим способом получения полипептидов или белков. Подходящие способы синтеза новых полипептидов и белков описаны в ссылках, таких как Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, под ред. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, под ред. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; и патент США №5449752. Также полипептиды и белки могут быть получены в результате рекомбинации с использованием нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, по стандартным рекомбинантным методикам. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3 изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Кроме того, некоторые CARs изобретения (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть очищены и/или выделены из источника, такого как растение, бактерия, насекомое, млекопитающее, например, крыса, человек и т.д. Способы выделения и очистки хорошо известны в данной области техники. Альтернативно, описанные в данном документе CARs (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть синтезированы на коммерческой основе компаниями, такими как Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) и Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). В связи с этим изобретенные CARs могут быть синтетическими, рекомбинантными, выделенными и/или очищенными.

В варианте осуществления изобретения дополнительно предложены антитело или его антигенсвязывающая часть, которая специфически связывается с эпитопом CARs изобретения. Антитело может представлять собой любой вид иммуноглобулина, который известен в данной области техники. Например, антитело может быть любого изотипа, например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и т.д. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антителом может быть природное антитело, например, антитело, очищенное и/или выделенное из млекопитающего, например, мыши, кролика, козы, лошади, цыпленка, хомяка, человека и т.д. В качестве альтернативы антителом может быть генно-инженерное антитело, например, гуманизированное антитело или химерное антитело. Антитело может находиться в мономерной или полимерной форме. Также антитело может обладать любым уровнем аффинности или авидности по отношению к функциональной части изобретенного CAR.

Способы испытания антител на предмет способности связываться с какой-либо функциональной частью изобретенного CAR известны в данной области техники и включают любой способ анализа связывания антитела с антигеном, например, радиоиммуноанализ (RIA), ELISA, вестерн-блоттинг, иммунная преципитация и анализы методом конкурентного ингибирования (см., например, Janeway et al. ниже и публикацию заявки на патент США №2002/0197266 A1).

Подходящие способы получения антител известны в данной области техники. Например, стандартные гибридомные способы описаны, например, в Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) и C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5 изд., Garland Publishing, New York, NY (2001). В качестве альтернативы, в данной области техники известны и другие способы, например, гибридомные способы с использованием вируса Эпштейна-Барра (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984) и Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)) и экспрессирующие векторные системы бактериофагов (см., например, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Кроме того, способы получения антител у животных, не относящихся к человеческому роду, описаны, например, в патентах США №5545806, 5569825, 5714352 и в публикации заявки на патент США №2002/0197266 A1.

Более того, для создания антитела может быть использован фаговый дисплей. При этом фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены антител, могут быть созданы с использованием стандартных методов молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше). Выбирают бактериофаги, кодирующие вариабельную область с желаемой специфичностью, для специфического связывания с желаемым антигеном, и полное или неполное антитело реконструируют с включением выбранного вариабельного домена. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие реконструированное антитело, вводят в подходящую клеточную линию, например, в миеломную клетку, используемую для получения гибридомы, так что антитела, обладающие свойствами моноклональных антител, секретируются клеткой (см., например, Janeway et al., см. выше, Huse et al., см. выше и патент США №6265150).

Антитела могут продуцироваться трансгенными мышами, которые трансгенны по специфическим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такие способы известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США №5545806, 5569825 и Janeway et al., см. выше.

Способы создания гуманизированных антител хорошо известны в данной области техники и подробно описаны в, например, Janeway et al., см. выше, патентах США №5225539, 5585089, 5693761, Европейском патенте №0239400 B1 и патенте Великобритании №2188638. Гуманизированные антитела также могут быть созданы с использованием технологии изменения поверхности антитела, описанной в патенте США №5639641 и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

В варианте осуществления изобретения также предложены антигенсвязывающие части любых антител, описанных в данном документе. Антигенсвязывающей частью может быть любая часть, у которой имеется по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например, Fab, F(ab')₂, dsFv, sFv, диатела и триатела.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент (sFv) антитела, который представляет собой процессированный Fab-фрагмент, включающий вариабельный (V) домен тяжелой цепи антитела, связанный с V-доменом легкой цепи антитела через синтетический пептид, может быть создан с помощью общепринятых технологических методик рекомбинантной ДНК (см., например, Janeway et al., см. выше). Аналогично, дисульфид-стабилизированные вариабельные фрагменты (dsFv) могут быть получены по технологии рекомбинантной ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Однако фрагменты антител изобретения не ограничиваются этими примерами фрагментов антител.

Также антитело или его антигенсвязывающая часть может быть модифицирована, чтобы включать детектируемую метку, такую, например, как радиоизотоп, флуорофор (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).

В варианте осуществления изобретения дополнительно предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из CARs, описанных в данном документе (включая их функциональные части и функциональные варианты). Нуклеиновые кислоты изобретения могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любые лидерные последовательности, антигенсвязывающие домены, иммуноглобулиновые домены, трансмембранные домены и/или внутриклеточные сигнальные домены Т-клетки, описанные в данном документе.

В варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен BL22 или HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи) и CH2CH3. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 21 или 22 соответственно. В другом варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи) и короткую последовательность константного домена иммуноглобулина. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 23 или 38.

Нуклеиновые кислоты изобретения могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из трансмембранных доменов и/или внутриклеточных сигнальных доменов T-клетки, описанных в данном документе. В варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота мож