Молекулы нуклеиновой кислоты, которые воздействуют на субъединицу с вакуолярной атфазы и придают устойчивость к жесткокрылым насекомым-вредителям

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые воздействуют на субъединицу с вакуолярной атфазы и придают устойчивость к жесткокрылым насекомым-вредителям

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи заявки предварительной заявки США, серийный номер 61/428608, поданной 30 декабря 2010 года, на "МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОТОРЫЕ ВОЗДЕЙСТВУЮТ НА СУБЪЕДИНИЦУ С ВАКУОЛЯРНОЙ АТФАЗЫ И ПРИДАЮТ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЖЕСТКОКРЫЛЫМ НАСЕКОМЫМ-ВРЕДИТЕЛЯМ".

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к генетическим методам регулирования повреждения растений, вызванного жесткокрылыми насекомыми. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к идентификации целевых кодирующих и некодирующих последовательностей и к применению технологий рекомбинантных ДНК для посттранскрипционного подавления или ингибирования экспрессии целевых кодирующих и некодирующих последовательностей в клетках жесткокрылых насекомых для обеспечения защитного эффекта у растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Западный кукурузный жук (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, является одним из наиболее вредных видов кукурузных корневых червей в Северной Америке и имеет особенно важное значение в зерновых районах Среднего Запада США. Северный кукурузный жук (NCR), Diabrotica barberi Smith and Lawrence, является близкородственным видом, который обитает в тех же зонах, что и WCR. Существует несколько других родственных подвидов Diabrotica, которые являются серьезными вредителями в Северной Америке: мексиканский кукурузный корневой червь (MCR), D. virgifera zeae Krysan and Smith; южный кукурузный жук (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; и D. u. undecimpunctata Mannerheim. Министерство сельского хозяйства США в настоящее время оценивает, что кукурузные корневые черви являются причиной упущенной выручки в 1 миллиард долларов ежегодно, включая 800 миллионов долларов в год ущерба и 200 миллионов долларов издержек, связанных с обработкой.

Летом WCR и NCR сохраняются в почве в виде яиц. Насекомые пребывают в стадии яйца в течение зимы. Яйца продолговатой формы, белые, длиной меньше 0,004 дюйма (0,01016 см). Личинка выходит из яйца в конце мая или в начале июня, причем точное время выхода из яйца меняется каждый год в зависимости от температурных различий и местоположения. Вновь вылупившиеся личинки представляют собой белых червей длиной меньше 0,125 дюйма. После того, как личинка вылупляется, она начинает питаться корнями кукурузы. Кукурузные корневые черви проходят через три фазы развития личинки. После питания в течение нескольких недель, личинки линяют в стадию куколки. Они окукливаются в почве и затем появляются из почвы в виде взрослых особей в июле и августе. Взрослые особи личинок корневых червей имеют в длину 0,25 дюйма (0,63 см).

Личинки кукурузного корневого червя заканчивают свое развитие на кукурузе и на некоторых других видах злаковых. Личинки, выращенные на желтом щетиннике, появляются позже и имеют меньший размер головной капсулы у взрослых особей, чем личинки, выращенные на кукурузе. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Взрослые особи WCR питаются кукурузными рыльцами, пыльцой и зернышками на незащищенных верхушках початков. Если взрослые особи WCR появляются раньше появления генеративных тканей кукурузы, они могут питаться тканью листьев, тем самым замедляя рост растения, и иногда уничтожают растение-хозяин. Однако взрослые особи быстро переходят на предпочитаемые ими кукурузные рыльца и пыльцу, когда они становятся доступны. Взрослые особи NCR также питаются генеративными тканями растения кукурузы, но, напротив, редко питаются листьями кукурузы.

Большинство повреждений кукурузы, наносимых корневыми червями, связано с питанием личинок. Вновь вылупившиеся корневые черви вначале питаются тонкими корневыми волосками кукурузы и делают ходы в кончиках корня. По мере того, как личинки становятся больше, они питаются и делают ходы в главных корнях. Когда корневые черви присутствуют в большом количестве, питание личинок часто приводит к сокращению корней по всей длине до основания стебля. Тяжелое повреждение корней ухудшает их способность транспортировать воду и питательные вещества в растение, снижает рост растения и приводит в результате к снижению зерновой продукции, при этом зачастую существенно уменьшая общую урожайность. Тяжелое повреждение корней также часто приводит к полеганию растений кукурузы, что усложняет сбор урожая и также снижает урожайность. Кроме того, питание взрослых особей генеративными тканями растения кукурузы может приводить к удалению столбиков на верхушке початков кукурузы. Если такое "срезание столбиков" является достаточно сильным во время сбрасывания пыльцы, то опыление может быть нарушено.

Попытки контроля злаковых корневых червей могут быть предприняты с помощью чередования культур, химических инсектицидов, биопестицидов (например, спорообразующая грамположительная бактерия, Bacillus thuringiensis) или с помощью их комбинации. Существенным недостатком чередования культур является наложение нежелательных ограничений на использование сельскохозяйственных угодий. Кроме того, кладка яиц некоторых видов корневых червей может происходить на полях, занятых соей, что снижает эффективность метода чередования культур, применяемого на практике с помощью кукурузы и сои. Химические инсектициды являются наиболее обнадеживающей стратегией по достижению контроля над злаковыми корневыми червями. Применение химических инсектицидов, однако, не является совершенной стратегией борьбы со злаковыми корневыми червями; в США ежегодный ущерб от злакового корневого червя составляет свыше миллиарда долларов, при суммировании расходов на химические инсектициды и стоимости ущерба, наносимого корневыми червями, который может иметь место, несмотря на применение инсектицидов. Высокие популяции личинок, сильные дожди и неправильное применение инсектицида (инсектицидов) могут приводить к недостаточному уничтожению злаковых корневых червей. Кроме того, постоянное применение инсектицидов приводит к отбору устойчивых к инсектицидам штаммов корневых червей, а также к возникновению серьезных экологических проблем, связанных с токсичностью многих инсектицидов в отношении видов, не являющихся мишенями.

РНК-интерференция (RNAi) представляет собой процесс с использованием эндогенных клеточных путей, при котором молекула интерферирующей РНК (iRNA) (например, молекула дцРНК), которая специфична всей последовательности гена-мишени или какой-либо его части соответствующего размера, вызывает деградацию мРНК, кодирующей ген-мишень. В последние годы RNAi применяют для осуществления “нокдауна” генов у некоторых видов и в экспериментальных системах; например, у C. elegans, растений, эмбрионов насекомых и у клеток в клеточной культуре. Смотрите, например, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

RNAi осуществляется за счет разрушения мРНК эндогенным путем, включающим в себя белковый комплекс DICER. DICER расщепляет длинные молекулы дцРНК на короткие фрагменты длиной приблизительно 20 нуклеотидов, называемые малыми интерферирующими РНК (миРНК). Молекула миРНК расплетается с образованием двух одноцепочечных РНК: “сопровождающая” цепь и ведущая цепь. “Сопровождающая” цепь разрушается, и ведущая цепь встраивается в РНК-индуцируемый сайленсинг-комплекс (RISC). Молекулы ингибиторной микрорибонуклеиновой кислоты (микроРНК) аналогичным образом могут включаться в RISC. Посттранскрипционное молчание генов происходит, когда ведущая цепь специфически связывается с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и индуцирует расщепление с помощью белков Argonaute, каталитического компонента комплекса RISC. Известно, что данный процесс происходит повсюду в организме, несмотря на исходно ограниченные концентрации миРНК и/или микроРНК у некоторых эукариот, таких как растения, нематоды и некоторые насекомые.

Расщепляются и разрушаются только транскрипты, комплементарные миРНК и/или микроРНК, и поэтому нокдаун экспрессии мРНК специфичен по отношению к последовательности. В растениях существует несколько функциональных групп генов DICER. Эффект сайленсинга генов RNAi сохраняется в течение дней и, в экспериментальных условиях, может приводить к уменьшению представленности целевого транскрипта на 90% или больше, с последующим снижением уровней соответствующего белка.

Патент США 7612194 и патентные публикации США № US 2007/0050860, № US 2010/0192265 и № US 2011/0154545 раскрывают библиотеку из 9112 маркеров экспрессируемых последовательностей tag (EST), выделенных из куколки D. v. virgifera LeConte. В патенте США 7612194 и в патентной публикации США № US 2007/0050860 предложено функционально связать указанные последовательности с промотором молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна одной из нескольких определенных частичных последовательностей H⁺-АТФазы вакуолярного типа D. v. virgifera (V-ATPase), раскрытых в указанных публикациях для экспрессии антисмысловой РНК в клетках растений. Патентная публикация США № US 2010/0192265 предлагает функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна определенной частичной последовательности гена D. v. virgifera с неизвестной и нераскрытой функцией (указано, что частичная последовательность на 58% идентична продукту гена C56C10.3 в C. elegans) для экспрессии антисмысловой РНК в клетках растений. Патентная публикация США № US 2011/0154545 предлагает функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна двум определенным частичным последовательностям генов бета-субъединицы коатомера D. v. virgifera для экспрессии антисмысловой РНК в клетках растений. Кроме того, в патенте США 7943819 раскрыта библиотека из 906 маркерных экспрессируемых tag-последовательностей (EST), выделенных из личинки, куколки и рассеченных насекомых D. v. virgifera LeConte, и предложено функциональное связывание промотора с молекулой нуклеиновой кислоты, которая комплементарна определенной частичной последовательности гена белка 4b мультивезикулярного тельца D. v. virgifera для экспрессии двухцепочечной РНК в клетках растений.

В патенте США 7612194 и в патентных публикациях США № US 2007/0050860, № US 2010/0192265 и № US 2011/0154545 не предоставляется дополнительного указания по применению какой-либо определенной последовательности из более чем девяти тысяч предоставленных последовательностей, перечисленных в них, для РНК-интерференции, за исключением нескольких отдельных частичных последовательностей V-ATPase и отдельных частичных последовательностей генов с неизвестной функцией. Кроме того, патент США 7612194 и патентные публикации США № US 2007/0050860 и № US 2010/0192265, и № US 2011/0154545 не содержат указаний относительно других последовательностей из более чем девяти тысяч предоставленных последовательностей, которые являлись бы летальными или хотя бы полезными в других отношениях, при их использовании в качестве дцРНК или миРНК в видах злакового корневого червя. В патенте США 7943819 не представлены рекомендации по применению какой-либо конкретной последовательности из более чем девяти тысяч последовательностей, перечисленных в нем, для РНК-интерференции, кроме отдельной частичной последовательности гена хроматин-модифицирующего белка 4b. Кроме того, в патенте США 7943819 не представлены рекомендации относительно того, какие другие последовательности из более чем девяти тысяч предоставленных последовательностей являлись бы летальными, или хотя бы полезными в других отношениях, при их использовании в качестве дцРНК или миРНК в видах злакового корневого червя.

Подавляющее большинство последовательностей, комплементарных ДНК злаковых корневых червей (таких как указанные выше), не являются летальными для видов злаковых корневых червей при их использовании в виде дцРНК или миРНК. Например, Baum et al. (2007) описывают эффекты ингибирования нескольких генов-мишеней WCR с помощью RNAi. Авторы сообщали, что 8 из 26 целевых генов, которые они тестировали, не вызывали существенной гибели жесткокрылых насекомых-вредителей в эксперименте с применением очень высокой концентрации iRNA (например, дцРНК) свыше 520 нг/см².

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты (например, гены-мишени, ДНК, дцРНК, миРНК, микроРНК и hpРНК) и способы их применения для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями, включая, например, D. v. virgifera LeConte (западный кукурузный жук, "WCR"); D. barberi Smith and Lawrence (северный кукурузный жук, "NCR"); D. u. howardi Barber (южный кукурузный жук, "SCR"); D. v. zeae Krysan and Smith (мексиканский кукурузный жук, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; и D. u. undecimpunctata Mannerheim. В конкретных примерах раскрыты показательные молекулы нуклеиновой кислоты, которые могут быть гомологичны по меньшей мере части одной или более нативных последовательностей нуклеиновой кислоты жесткокрылых насекомых-вредителей.

В указанных и в других примерах нативная последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ген-мишень, продукт которого может быть, например и без ограничения: вовлечен в метаболический процесс; вовлечен в репродуктивный процесс; или вовлечен в развитие личинки. В некоторых примерах посттрансляционное ингибирование экспрессии целевого гена молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей гомологичную последовательность, может быть летальным для жесткокрылых насекомых или может приводить к снижению роста и/или размножения. В конкретных примерах по меньшей мере один ген, выбранный из перечня, включающего D_vir_c47185_Caf1 180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_vatpaseH; и Contig_01_Rho1_l-191_CDC42, может быть выбран в качестве целевого гена для посттранскрипционного сайленсинга. В конкретных примерах целевой ген, используемый для посттрансляционного ингибирования, представляет собой ген, кодирующий субъединицу С вакуолярнойАТФазы, содержащий нуклеотидную последовательность, обозначаемую как D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO: 2), или гомологичную ей последовательность. Таким образом, в описании раскрываются выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO: 2), комплементарную ей последовательность и определенные новые фрагменты любой из обеих последовательностей.

Также раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности в составе продукта целевого гена (например, продукта гена, выбранного из группы, состоящей из D_vir_c47185_Caf1 180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH; и Contig_01_Rho1_1-191_CDC42). В конкретных примерах молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого геном субъединицы С вакуолярной АТФазы, содержащим нуклеотидную последовательность, обозначаемую здесь как D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO: 2), или гомологичную ей последовательность. Кроме того, раскрываются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, которая представляет собой обратную комплементарную последовательность для нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, который по меньшей мере на 85% идентичен аминокислотной последовательности в составе продукта целевого гена.

Также раскрываются последовательности кДНК, которые можно использовать для получения молекул иРНК (например, дцРНК, миРНК, микроРНК и hpРНК), которые комплементарны всему целевому гену или его части у жесткокрылых насекомых, например: D_vir_c47185_Caf1 180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH; и/или Contig_01_Rho1_1-191_CDC42. В конкретных вариантах осуществления дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК могут быть получены in vitro или in vivo с помощью генетически модифицированного организма, например, растения или бактерии. В конкретных примерах раскрываются молекулы кДНК, которые можно использовать для получения молекул иРНК, которые комплементарны D_vir_c1229_VatpaseC или его определенным новым фрагментам.

Также раскрываются средство для ингибирования экспрессии важного гена жесткокрылого насекомого и средство для обеспечения устойчивости растения к жесткокрылым насекомым. Средство для ингибирования экспрессии важного гена жесткокрылого насекомого представляет собой одно- или двухцепочечную молекулу РНК, состоящую из любой из SEQ ID NO: 7, 8, 10, 11, 49, 50, 86, 87, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 127, 128, 129, 130, 131 или из комплементарной им последовательности. Средство для обеспечения устойчивости растения к жесткокрылым насекомым представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для ингибирования экспрессии важного гена у жесткокрылого насекомого, функционально связанного с промотором, где молекула ДНК способна интегрироваться в геном растения кукурузы.

Раскрываются способы контроля популяции жесткокрылого насекомого, включающие предоставление жесткокрылому насекомому молекулы iRNA (например, дцРНК, миРНК, микроРНК и hpРНК), которые действует после поглощения жесткокрылым насекомым с ингибированием биологической функции у жесткокрылого насекомого, где молекула iRNA содержит всю нуклеотидную последовательность или ее часть, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 4; нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica (например, WCR), содержащей всю последовательность или часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4; последовательности, комплементарной нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica, содержащей всю последовательность или часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4; нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, содержащую всю последовательность или часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4; и последовательности, комплементарной нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, содержащую всю последовательность или часть любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.

В конкретных примерах раскрываются способы контроля популяции жесткокрылого насекомого, включающие предоставление жесткокрылому насекомому молекулы iRNA (например, дцРНК, миРНК, микроРНК и hpРНК), которая действует после поглощения жесткокрылым насекомым с ингибированием биологической функции у жесткокрылого насекомого, где молекула iRNA содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: всей последовательности или части SEQ ID NO: 1; последовательности, комплементарной всей последовательности или части SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 4; всей последовательности или части SEQ ID NO: 5; всей последовательности или части последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 5; всей последовательности или части SEQ ID NO: 6; всей последовательности или части последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 112; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113; последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 113; всей последовательности или части нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica (например, WCR), содержащей SEQ ID NO: 1; всей последовательности или части последовательности, комплементарной нативной кодирующей последовательности организма Diabrotica, содержащей SEQ ID NO: 1; всей последовательности или части нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, содержащую SEQ ID NO: 1; и всей последовательности или части последовательности, комплементарной нативной некодирующей последовательности организма Diabrotica, которая транскрибируется в нативную молекулу РНК, содержащую SEQ ID NO: 1.

В описании также раскрываются способы, в которых дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК могут быть предоставлены жесткокрылому насекомому в тесте кормления, или в генетически модифицированных растительных клетках, экспрессирующих дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК. В указанных и в других примерах дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК могут потребляться личинками жесткокрылых насекомых. Потребление дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК изобретения может затем приводить к RNAi у личинок, которая, в свою очередь, может вызывать сайленсинг гена, необходимого для выживаемости жесткокрылого насекомого, и приводит в конечном итоге к гибели личинок. Таким образом, раскрываются способы, в которых молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие типичную последовательность (последовательности), полезную для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, предоставляются жесткокрылому насекомому. В конкретных примерах жесткокрылое насекомое, контролируемое путем применения молекул нуклеиновой кислоты изобретения, может представлять собой WCR или NCR.

Упомянутые выше и другие особенности будут более понятны благодаря приведенному ниже подробному описанию некоторых вариантов осуществления, которое следует далее со ссылкой на прилагаемые фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой изображение стратегии, применяемой для создания специфических матриц для получения дцРНК.

Фиг.2 представляет собой график изменчивости при ингибировании роста жесткокрылых насекомых, обработанных показательными молекулами нуклеиновой кислоты.

Фиг.3 представляет собой график изменчивости, отражающий смертность жесткокрылых насекомых, обработанных показательными молекулами нуклеиновой кислоты.

Фиг.4 представляет собой другой график изменчивости при ингибировании роста жесткокрылых насекомых, обработанных показательными молекулами нуклеиновой кислоты.

Фиг.5 представляет собой описание в виде картинки некоторых нуклеотидных последовательностей, которые могут быть представлены в определенных молекулах нуклеиновой кислоты изобретения. Если указано, то "(последовательность)", обозначает участок изображенной нуклеотидной последовательности, характеризующийся любой длиной и определенной последовательностью, например и без ограничения, непрерывный сегмент любой из SEQ ID NO: 1-4. Участки изображенных нуклеотидных последовательностей, выделенные курсивом, являются произвольными.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в прилагаемом списке последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных аббревиатур нуклеотидных оснований, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но комплементарная цепь и обратная комплементарная цепь понятны, поскольку они включены посредством ссылки на представленную цепь. В прилагаемом списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет типичную последовательность кДНК Diabrotica, обозначаемую в некоторых местах как D_vir_c47185_Caf1 180 или Caf1-180.

SEQ ED NO: 2 представляет типичную последовательность кДНК Diabrotica, обозначаемую в некоторых местах как D_vir_c1229_VatpaseC или VatpaseC.

SEQ ID NO: 3 представляет типичную последовательность кДНК Diabrotica, обозначаемую в некоторых местах как D_vir_c1319_VatpaseH или VatpaseH.

SEQ ID NO: 4 представляет типичную последовательность кДНК, обозначаемую в некоторых местах как Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 или Rho1.

SEQ ID NO: 5-8 представляют типичные некодирующие фрагменты субъединицы C кДНК вакуолярной АТФазы Diabrotica.

SEQ ID NO: 9-11 представляют типичные некодирующие фрагменты субъединицы H кДНК вакуолярной АТФазы Diabrotica.

SEQ ID NO: 12 представляет последовательность промотора фага T7.

SEQ ID NO: 13-38 представляют праймеры, используемые для амплификации частей кодирующих областей показательных целевых генов с помощью ПЦР.

SEQ ID NO: 39-48 представляют праймеры, используемые для амплификации областей генов Caf1-180 и VatpaseC для синтеза шпилечной РНК.

SEQ ID NO: 49 представляет последовательность ДНК Caf1-180, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 1 вектора экспрессии, которая содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 50 представляет последовательность ДНК VatpaseC, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 для версии 1 вектора экспрессии, которая содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 51 представляет последовательность области 1 ДНК аннексина.

SEQ ID NO: 52 представляет последовательность области 2 ДНК аннексина.

SEQ ID NO: 53 представляет последовательность области 1 ДНК бета-спектрина 2.

SEQ ID NO: 54 представляет последовательность области 2 ДНК бета-спектрина 2.

SEQ ID NO: 55 представляет последовательность области 1 ДНК mtRP-L4.

SEQ ID NO: 56 представляет последовательность области 2 ДНК mtRP-L4.

SEQ ID NO: 57 представляет последовательность ДНК, кодирующую YFP.

SEQ ID NO: 58-85 представляют праймеры, используемые для амплификации областей генов аннексина, бета-спектрина 2, mtRP-L4 и YFP для синтеза дцРНК.

SEQ ID NO: 86 представляет показательный амплифицированный фрагмент 260 п.н. кДНК D_vir_c47185_Caf1-180, который применяли в качестве матрицы при синтезе молекулы дцРНК.

SEQ ID NO: 87-90 представляют типичные некодирующие фрагменты кДНК Rho1 Diabrotica.

SEQ ID NO: 91 представляет типичную последовательность ДНК Caf1-180, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), включающую дополнительный сайт клонирования, фланкирующий интрон, для версии 1 вектора экспрессии, которая содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 92 представляет типичную последовательность ДНК Caf1-180, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 2 вектора экспрессии, которая не содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 93 представляет типичную последовательность ДНК VatpaseC, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), содержащую дополнительный сайт клонирования, фланкирующий интрон, для версии 1 вектора экспрессии hpРНК, которая содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 94 представляет типичную последовательность ДНК VatpaseC, образующую РНК в виде “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 2 вектора экспрессии hpРНК, которая не содержит консенсусную последовательность кукурузы.

SEQ ID NO: 95 представляет типичный сегмент смысловой цепи ДНК Caf1-180, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 96 представляет типичный сегмент антисмысловой цепи ДНК Caf1-180 для версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 97 представляет типичную последовательность ДНК Caf1-180, образующую РНК в виде “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 98 представляет типичный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseC, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 99 представляет типичный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseC версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 100 представляет типичную последовательность ДНК VatpaseC, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 3 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 101 представляет типичный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseC, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) для версии 4 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 102 представляет типичный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseC для версии 4 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 103 представляет типичную последовательность ДНК VatpaseC, образующую РНК в виде “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), для версии 4 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 104 представляет типичный сегмент смысловой цепи ДНК VatpaseH, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 105 представляет типичный сегмент антисмысловой цепи ДНК VatpaseH для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 106 представляет типичную последовательность ДНК VatpaseH, образующую РНК в виде “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 107 представляет типичный сегмент смысловой цепи ДНК Rho1, содержащей интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 108 представляет типичный сегмент антисмысловой цепи ДНК Rho1 для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 109 представляет типичную последовательность ДНК, образующую РНК в форме “шпильки”, содержащую интрон ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), для версии 1 вектора экспрессии.

SEQ ID NO: 110 представляет типичный сегмент ДНК Caf-180, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 111 представляет типичный сегмент области 1 ДНК VatpaseC, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 112 представляет типичный сегмент области 1 ДНК VatpaseC (короткий), используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК, применяемой в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 113 представляет типичный сегмент ДНК области 2 VatpaseC, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК, в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 114 представляет типичный сегмент ДНК области 1 VatpaseH, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 115 представляет типичный сегмент области 2 ДНК VatpaseH, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 116 представляет типичный сегмент ДНК Rho1, используемый для получения матрицы при синтезе дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 117 представляет типичную смысловую цепь РНК VatpaseC ("VatpaseC5’-15"), применяемую в качестве дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 118 представляет дополнительную типичную смысловую цепь РНК VatpaseC ("VatpaseC5’-25"), применяемую в качестве дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 119 представляет дополнительную типичную смысловую цепь РНК VatpaseC ("VatpaseC3’-15"), применяемую в качестве дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 120 представляет дополнительную типичную смысловую цепь РНК VatpaseC ("VatpaseC3’-25"), применяемую в качестве дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 121-126 представляют праймеры, используемые для амплификации частей гена VatpaseC Diabrotica в качестве матриц для синтеза дцРНК.

SEQ ID NO: 127 представляет типичную смысловую цепь VatpaseC ("VatpaseC5’-50"), применяемую в качестве матрицы дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 128 представляет типичную смысловую цепь VatpaseC ("VatpaseC5’-100"), применяемую в качестве матрицы дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 129 представляет типичную смысловую цепь VatpaseC ("VatpaseC-174"), применяемую в качестве матрицы дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 130 представляет типичную смысловую цепь VatpaseC ("VatpaseC3’-50"), применяемую в качестве матрицы дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 131 представляет типичную смысловую цепь VatpaseC ("VatpaseC3’-100"), применяемую в качестве дцРНК в биологических тестах с рационами кормления.

SEQ ID NO: 132-135 представляют праймеры, применяемые в молекулярных анализах трансгенной кукурузы.

SEQ ED NO: 136 представляет интрон ST-LS1, который может быть полезен в некоторых вариантах осуществления для формирования шпилечной РНК.

SEQ ID NO: 137-138 представляют типичные некодирующие фрагменты кДНК Rho1 Diabrotica.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор некоторых вариантов осуществления

В описании раскрываются способы и композиции для генетического контроля поражений, вызванных жесткокрылыми насекомыми. Также предоставляются способы идентификации одного или более генов, необходимых для жизненного цикла жесткокрылого насекомого, для использования в качестве целевого гена для RNAi-опосредованного контроля популяции жесткокрылого насекомого. Векторы на основе плазмидной ДНК, кодирующие молекулы дцРНК, могут быть сконструированы для подавления одного или более целевых генов, необходимых для роста, выживания, развития и/или репродукции. В некоторых вариантах осуществления предоставляются способы посттранскрипционного подавления экспрессии или ингибирования кодирующей или некодирующей последовательности целевого гена у жесткокрылого насекомого. В указанных и других вариантах осуществления жесткокрылое насекомое может потреблять одну или более молекул дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК, транскрибированные из всей или части молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна кодирующей или некодирующей последовательности целевого гена, что обеспечивает защитный эффект для растений.

Таким образом, некоторые варианты осуществления включают специфичное к последовательности ингибирование экспрессии продуктов целевого гена, с использованием дцРНК, миРНК, микроРНК и/или hpРНК, которые комплементарны кодирующей и/или некодирующей последовательностям целевого гена (генов), для достижения по меньшей мере частичного контроля над распространением жесткокрылого насекомого. Раскрывается набор выделенных и очищенных молекул нуклеиновой кислоты, содержащих нуклеотидную последовательность, например, как отражено в одной из SEQ ID NO: 1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 и 127-131. В некоторых вариантах осуществления стабильная молекула дцРНК (например, SEQ ID NO: 117-120) может экспрессироваться из указанных последовательностей, их фрагментов или гена, содержащих одну из указанных последовательностей, для посттранскрипционного сайленсинга или ингибирования целевого гена. В определенных вариантах осуществления выделенные и очищенные молекулы нуклеиновой кислоты включают SEQ ID NO: 2 и/или всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO: 5 и 6.

Некоторые варианты осуществления включают рекомбинантную клетку-хозяин (например, растительную клетку), содержащую в своем геноме по меньшей мере одну последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую по меньшей мере одну молекулу iRNA (например, дцРНК). В конкретных вариантах осуществления молекула (молекулы) дцРНК может экспрессироваться при потреблении жесткокрылым насекомым, для посттранскрипционного сайленсинга или ингибирования экспрессии целевого гена у жесткокрылого насекомого. Последовательность рекомбинантной ДНК может включать, например, любую из SEQ ID NO: 1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 и 127-131, фрагменты любой из SEQ ID NO: 1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 и 127-131, или частичную последовательность гена, содержащую одну из последовательностей SEQ ID NO: 1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 и 127-131, или их комплементарные последовательности.

Конкретные варианты осуществления включают рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую в своем геноме последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую по меньшей мере одну молекулу (молекулы) iRNA (например, дцРНК), содержащую SEQ ID NO: 2 и/или всю последовательность или часть любой из SEQ ID NO: 5 и 6. При потреблении жесткокрылым насекомым молекула (молекулы) iRNA может отключать или ингибировать экспрессию целевого гена субъединицы С вакуолярной АТФазы, содержащего SEQ ID NO: 2, 5-8, 112 и 113, у жесткокрылого насекомого, и тем самым вызывать прекращение роста, развития, размножения и/или питания жесткокрылого насекомого.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая в своем геноме по меньшей мере одну последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующую по меньшей мере одну молекулу дцРНК, может представлять собой трансформированную растительную клетку. Некоторые варианты осуществления включают трансгенные растения, содержащие такую трансформированную растительную клетку. Помимо таких трансгенных растений, предоставляются растения-потомки трансгенного растения любого поколения, трансгенные семена и продукты трансгенного растения, каждый из которых содержит последовательность (последовательности) рекомбинантной ДНК. В конкретных вариантах осуществления молекула дцРНК изобретения может экспрессироваться в трансгенной растительной клетке. Таким образом, в указанных и в других вариантах осуществления молекула дцРНК изобретения может быть выделена из клетки трансгенного растения. В конкретных вариантах осуществления трансгенное растение представляет собой растение, выбранное из группы, включающей кукурузу (Zea mays), сою (Glycine max) и растения семейства Poaceae.

Некоторые варианты осуществления включают способ модулирования экспрессии целевого гена в клетке жесткокрылого насекомого. В указанных и других вариантах осуществления может предоставляться молекула нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеинов