Штамм вируса гриппа а/япония/гк/6:2/2014 (h2n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин

Штамм вируса гриппа а/япония/гк/6:2/2014 (h2n2) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин, моновалентных или в составе 3-компонентной в целях иммунизации населения против потенциально пандемических вирусов гриппа А подтипов Н2. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А.

Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека в случае непосредственного инфицирования различными подтипами вируса птичьего или свиного происхождения и еще большую - при реассортации с вирусами человека.

Потенциально пандемическим подтипом вируса гриппа является A/H2N2. Вирус типа A/H2N2, названный азиатским гриппом, появился в 1957 году в Юго-Восточной Азии, стремительно распространился по миру и стал причиной второй пандемии XX века. Проведенные серологические исследования позволяют считать, что пандемия 1889-1892 гг. также была вызвана вирусом гриппа A/H2N2 [A.S. Monto and С. Sellwood, 2012]. Смертность в период пандемии азиатского гриппа составила по разным источникам от 1 до 4 млн человек. Вирусы гриппа подтипа A/H2N2 около 50 лет не циркулировали в популяции и большинство людей не имеют к ним иммунитета. Вместе с тем вирус A/H2N2 продолжает циркулировать в птичьих популяциях, и не исключена вероятность заноса его в человеческую популяцию. Исследование 22 вирусов подтипа A/H2N2, изолированных от диких и домашних птиц, показало, что все они имеют низкий уровень генетической и антигенной изменчивости. Большая часть изолятов проявила антигенное сходство с пандемическим вирусом А/Сингапур/1/57(H2N2), что предполагает возможность использования вирусов, выделенных в период пандемии 1957 года для разработки вакцин [J.C. Jones, 2014]. Кроме того, проанализирована возможность передачи млекопитающим (хорькам) птичьих вирусов подтипа Н2 (A/H2N2 и A/H2N3). Генетический анализ гемагглютинина, полученного из носовых смывов хорьков, показал наличие мутаций в первой субъединице гемагглютинина (НА1), включая рецептор-специфичные адаптивные мутации Gln226Leu, определяющие человеческий тип рецепторов α-2-6, что показывает возможность адаптации Н2 вирусов к млекопитающим и их потенциальную опасность для человека [Pappas С, 2015].

Необходимость разработки противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Роспотребнадзора РФ [Приказ №40 от 28.12.2004]. В «Глобальном плане ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом» до начала пандемии национальным органам рекомендуется испытывать и лицензировать пандемические вакцины, а также поддерживать развитие производства и обмена прототипами сезонных и пандемических вакцин, для возможного целевого их применения. В связи с этим актуальными являются исследования по подготовке вакцинных препаратов против вирусов гриппа подтипов A/H2N2, а также испытания этих вакцинных препаратов на животных моделях.

В настоящее время работы по созданию вакцин против пандемических вирусов гриппа ведутся во всем мире, ряд вакцин прошли или проходят испытания на приматах и людях. Это в основном живые аттенуированные вакцины, полученные на основе штаммов, циркулировавших в человеческой популяции с 1957 по 1968 гг. (против A/H2N2 вируса) или на основе современных штаммов животного происхождения [Broadbent A.J., 2015, Isakova-Sivak I., 2015, Grace L., 2014] (Табл. 2).

В качестве донора внутренних генов для получения реассортанта на основе вируса A/H2N2 мы использовали разработанный в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35(Н3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой (ЖГВ), так и для инактивированной (ИГВ) гриппозных вакцин.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, было получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H2N2 и донора внутренних генов A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) методом классической генетической реассортации, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.

Получение штамма вируса гриппа RA-36 (А/Япония/ГК/6:2/2014 (H2N2)

Штамм вируса гриппа RA-36 (А/Япония/ГК/6:2/2014 (H2N2) получен методом классической генетической реассортации штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и эпидемического вируса A/Japan/305/1957 (H2N2). При получении штамма было проведено 8 пассажей в 10-12 дневных развивающихся куриных эмбрионах.

Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 6:2. Состав генома: 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа.

Подтверждение состава генома было выполнено с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Japan/305/1957 (обозначены на фиг. 1 как НК и Jp) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции MhlI, MhlI, BslFI, Acc36I, BssECI, и Sse9I соответственно. Рестрикционный анализ ДНК-копий сегментов РНК (фиг. 1) показал, что реассортант RA-36 имеет состав генома 6:2.

Антигенное соответствие гемагглютинина родительскому штамму дикого типа у реассортанта RA-36 была подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (табл. 2).

Показано, что вакцинный кандидат RA-36 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.

Полногеномное секвенирование подтвердило наличие у реассортанта RA-36 всего комплекса мутаций генов, унаследованных от штамма-донора и кодирующих негликозилированные белки (табл. 2).

Выявленные нуклеотидные и аминокислотные замены в генах, кодирующих поверхностные белки, представлены в таблицах 3 и 4.

Примечание: Жирным шрифтом выделены мутации, приводящие к замене аминокислоты, * - замена встречается в других вариантах последовательностей дикого вируса, имеющихся в базе данных.

Примечание: * - замена встречается в других вариантах последовательностей дикого вируса, имеющихся в базе данных.

Характеристика полученного штамма

Пример 1. Репродуктивные свойства штамма RA-36 (А/Япония/ГК/6:2/2014(Н2N2).

Штамм вируса гриппа RA-36 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 ''Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа''. Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением, начиная с 10^-4 до 10^-10, заражали по 4 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°С. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Аналогичным образом определяли инфекционную активность в культуре клеток MDCK.

Штамм вируса гриппа А/Япония/ГК/6:2/2014(Н2К2) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ и в культуре клеток MDCK. Гемагглютинирующая активность реассортанта RA-36 - 1:1024. Инфекционная активность в РКЭ - 8,75 lgЭИД50/0,2 мл.

Репродуктивные свойства штамма вируса гриппа RA-36 в куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK представлены в таблице 5.

Пример 2. Заявляемый вакцинный штамм RA-36 безвреден для мышей и морских свинок.

Тестирование штамма вируса гриппа RA-36 на безвредность (аномальную токсичность) для лабораторных животных проводили на двух видах животных: линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (5 шт.), и морских свинках обоего пола, массой 250-350 г (3 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.

В течение периода наблюдения (7 суток) все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной. Ни у одной морской свинки не развился некроз или абсцесс в месте введения.

Пример 3. Вакцинный штамм RA-36 иммуногеннен для мышей.

На основе реассортантных штаммов были подготовлены вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантного вируса разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД50/мл. Препарат ИГВ получали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Инактивацию проводили 0,02% формалином. Содержание НА в вакцинном препарате оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Препарат ИГВ содержал 15 мкг HA на дозу (0,5 мл). В качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия - 500 мкг на дозу.

Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Данные по содержанию антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ реассортантных штаммов, демонстрируют достоверное (p<0,05) повышение уровня антигемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител по сравнению с контрольными животными.

Иммуногенность штамма вируса гриппа RA-36 (А/Япония/ГК/6:2(Н2N2)

После иммунизации ЖГВ и ИГВ на основе реассортантного штамма RA-36 (А/Япония/ГК/6:2(Н2N2) в сыворотках крови были выявлены антигемагглютинирующие (фиг. 2) и вируснейтрализующие (фиг. 3) антитела в титрах, достаточных для формирования защитного иммунитета.

В сыворотках мышей выявлялись антигемагглютинирующие и нейтрализующие антитела как к штамму, на основе которого были получены вакцины, так и к гетерологичному штамму того же подтипа, что позволяет предполагать широкий спектр действия вакцин в рамках подтипа вируса гриппа A/H2N2.

Пример 4. Вакцинный штамм RA-36 обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности.

Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации к человеку - ts-, са-фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, также наследуют ts-, са-фенотип, и приобретают более высокую инфекционную, гемагглютинирующую и репродуктивную активность, по отношению к данному родительскому вирусу.

Полученный реассортант наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, са- фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 7).

При 5-кратном пассировании при температуре 32°С в системе РКЭ степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.

Штамм А/Япония/ГК/6:2/2014 (H2N2), Influenzavirus А, подтип H2N2, депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2834, для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа А/H2N2.