Животные, устойчивые к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Животные, устойчивые к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА

[0001] Данное изобретение было выполнено при поддержке Правительства согласно договору номер (USDA/ARS) 58-1940-8-868, представленной Департаментом Сельского Хозяйства. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] В данной заявке содержится Перечень Последовательностей, озаглавленный «UMO 11053. WO SEQ_ST25», созданный 15 мая 2012, который включен в данный документ во всей полноте посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение, в общем плане, относится к генетически модифицированной свинье, у которой по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован и/или был инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Также предложены способы получения таких трансгенных свиней.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Репродуктивно-Респираторный Синдром Свиней (РРСС) является одной из наиболее экономически значимых болезней свиней. Впервые это заболевание было выявлено в США в 1987 (Keffaber 1989), а в Европе - в 1990 (Wensvoort et al. 1991). Молекулярный анализ прототипных вирусов РРСС (ВРРСС) VR-2332 и Lelystad (американский и европейский изоляты, соответственно) позволил предположить, что на двух континентах почти одновременно появились два дивергентных штамма, вероятно, по причине похожих изменений в работе со свиньями (Murtaugh et al. 1995; Nelsen et al. 1999). После возникновения этот вирус распространился во всем мире и ВРРСС Европейского генотипа был выявлен в американских стадах свиней (Ropp et al. 2004). РРСС характеризуется тяжелой и иногда смертельной дыхательной недостаточностью и репродуктивной недостаточностью, а также предрасполагает инфицированных свиней к бактериальным патогенам, а также иным вирусным патогенам (Benfield et al. 1992), и является ключевым элементом экономически значимого Комплекса Респираторных Заболеваний Свиней (КРЗС). Наиболее постоянными патологическими повреждениями, вызываемыми ВРРСС при острой инфекции, являются интерстициальная пневмония и легкий лимфоцитарный энцефалит (Plagemann 1996). После острой фазы ВРРСС-инфекции, обычно характеризующейся виремией и клиническим заболеванием, множество свиней полностью выздоравливают, хотя и являются носителями вируса с низкой нагрузкой в течение длительного периода времени. Эти свиньи-носители постоянно инфицированы ВРРСС и периодически или постоянно выделяют вирус, поэтому могут инфицировать интактных свиней при прямом или косвенном контакте. Хроническая инфекция ВРРСС была хорошо задокументирована в экспериментальных условиях (Albina et al. 1994; Allende et al. 2000; Benfield et al. 1998; Christopherhennings et al. 1995; Sur et al. 1996; Yoon et al. 1993). В частности, инфекционный вирус обнаруживался до 157 суток после инфекции (Wills et al. 1997). Основными клетками-мишенями и при острой, и при хронической инфекции являются макрофаги и моноциты (Molitor et al. 1997), хотя было установлено, что также поражаются пневмоциты и стволовые клетки эпителия яичек (Sur et al. 1996; Suretal. 1997).

[0005] Этиологическим агентом РРСС является оболочечный вирус, содержащий РНК положительной полярности, принадлежащий к семейству Arteriviridae отряда Nidovirales. Другие члены семейства Arteriviridae включают вирус подъема уровня лактатдегидрогеназы (LDV) мышей, вирус артериита лошадей (EAV) и вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV). Анализ данных о геномной последовательности выявил наличие большого разнообразия между штаммами ВРРСС, а также существование высококонсервативных доменов (Andreyev et al. 1997; Meng 2000; Meng et al. 1995). Организация генома ВРРСС аналогична с другими Артеривирусами, геномная РНК функционирует как информационная РНК для репликазных белков ORF1a (Plagemann 1996). ORF1a и 1b включают приблизительно 80% вирусного генома и кодируют РНК-зависимую РНК-полимеразу, а также полипротеины, которые подвергаются процессингу в неструктурные белки (Snijder, Meulenberg 1998). С помощью вируса Lelystad, было выявлено, что ORF 2-7 кодируют вирусные структурные белки. Белок, закодированный ORF 5 (GP5) и М (Van Breedam et al. 2010b) может играть роль в индуцировании апоптоза, вызываемого ВРРСС (Suarez et al. 1996; Sur et al. 1997) и, как предполагается, является белком прикрепления в близкородственном Вирусе подъема уровня лактатдегиддрогеназы. Малые оболочечные гликопротеины GP2a и GP4 ВРРСС взаимодействуют с CD163 (Das et al. 2010). Имеются данные, исходя из которых можно предположить, что связывание с SIGLEC1 (иммуноглобулиноподобный лектин 1, связывающий сиаловую кислоту) необходимо для проникновения в клетки и, фактически, для вирусной инфекции необходимо двойное связывание и с SIGLEC1, и с CD163 (Van Gorp et al. 2008).

[0006] Многие характеристики патогенеза (особенно на молекулярном уровне) и эпизоотиологии ВРРСС плохо установлены, поэтому попытки его контроля затруднительны. Чтобы лучше его изучить, были разработаны инфекционные клоны ВРРСС (Nielsen et al. 2003). В настоящее время производители часто вакцинируют свиней против ВРРСС вакцинами с модифицированными живыми ослабленными штаммами или с убитыми вирусами. Однако доступные в настоящее время вакцины часто не обеспечивают удовлетворительной защиты, зачастую по причине вариабельности вируса и недостаточной стимуляции иммунной системы. Защитный иммунный ответ возможен, поскольку было показано, что предшествующее воздействие может обеспечить полную защиту при нагрузке свиней гомологичным штаммом ВРРСС (Lager et al. 1999). Однако при нагрузке гетерологическими штаммами защитный иммунитет не был ни разу достоверно продемонстрирован. Помимо неудовлетворительной эффективности имеющихся вакцин против ВРРСС, имеются убедительные свидетельства в пользу того, что используемая модифицированная живая вакцина может персистировать в отдельных стадах свиней и накапливать мутации (Mengeling et al. 1999), как это было показано с вирулентными полевыми изолятами после экспериментального инфицирования свиней (Rowland et al. 1999). Помимо этого, было показано, что вирус из вакцины выделяется со спермой вакцинированных хряков (Christopherhermings et al. 1997). Вместо вакцинации, некоторые авторы выступают в пользу стратегии «проверки и удаления» в племенных стадах (Dee, Molitor 1998). Успешность применения этой стратегии зависит от удаления всех свиней и с острой, и с хронической инфекцией ВРРСС с последующим строгим контролем для профилактики повторного внедрения вируса. Сложность и большая часть издержек, связанных с этой стратегией, заключаются в том, что о патогенезе хронической ВРРСС-инфекции мало известно и поэтому нет надежных способов для идентификации хронически инфицированных свиней.

[0007] Предполагаемый клеточный рецептор ВРРСС, который был идентифицирован при помощи моноклональных антител, очищен и секвенирован (Vanderheijden et al. 2003; Wissink et al. 2003), получил наименование SIGLEC1. Эта молекула обладает сходством с сиалоадгезинами и, как было показано, опосредует проникновение ВРРСС в невосприимчивые клетки, однако рекомбинантная клеточная линия, экспрессирующая этот рецептор, не смогла поддержать продуктивную репликацию ВРРСС (Vanderheijden et al. 2003). Существенно, что молекулы сиаловой кислоты, присутствующие на поверхности ВРРСС, как было показано, необходимы для инфицирования альвеолярных макрофагов. Следом за связыванием вируса с этим рецептором, происходит проникновение ВРРСС по механизму опосредованного рецептором эндоцитоза (Nauwynck et al. 1999). Ключевая роль сиалоадгезина при проникновении ВРРСС была установлена в экспериментах, в которых был продемонстрирован вирусный захват клетками РК15 (клеточная линия, не позволяющая репликацию ВРРСС), трансфицированными свиным сиалоадгезином, но не нетрансфицированными контрольными клетками РК15 (Vanderheijden et al. 2003). Дальнейшие исследования этой группой показали, что взаимодействия между сиаловой кислотой на поверхности вириона ВРРСС и молекулой сиалоадгезина были необходимы для инфицирования ВРРСС альвеолярных макрофагов (Delputte, Nauwynck 2004). Обратная стратегия, а именно, удаление сиаловой кислоты с поверхности ВРРСС или предварительное инкубирование со специфическими для сиаловой кислоты лектинами также привело к блокированию инфекции (Delputte et al. 2004; Delputte, Nauwynck 2004; Van Breedam et al. 2010b). Независимо от специфических исследований проникновения ВРРСС, использовался сайт-направленный мутагенез, чтобы идентифицировать шесть ключевых аминокислотных остатков, необходимых для связывания сиаловой кислоты с мышиным сиалоадгезином (Vinson et al. 1996), который на 69% идентичен свиному сиалоадгезину. Заслуживает внимания то, что шесть аминокислот, идентифицированных в мышином сиалоадгезине, сохранены и в свиной молекуле.

[0008] SIGLEC1 является трансмембранным рецептором семейства иммуноглобулиноподобных лектинов, связывающихся с сиаловой кислотой. Вначале он был описан как рецептор мышиных макрофагов, связывающий овечьи эритроциты (Crocker and Gordon 1986). Он экспрессируется макрофагами в гемопоэтической и лимфоидной тканях. SIGLEC-гены состоят из N-терминального домена из V-набора, содержащего сайт связывания сиаловой кислоты, последующего переменного количества доменов из С2-набора, трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста. В отличие от других SIGLEC, SIGLEC1 не имеет тирозинового мотива в цитоплазматическом хвосте (Oetke et al. 2006). Сайт связывания сиаловой кислоты был картирован в N-терминальном иммуноглобулиноподобном домене V-набора (Nath et al. 1995). Остаток R116, судя по всему, является одной из аминокислот, необходимых для связывания с сиаловой кислотой (Crocker et al. 1999; Delputte et al. 2007). Таким образом, интактный N-терминальный домен необходим и достаточен для связывания ВРРСС с SIGLEC1 (Van Breedam et al. 2010a). Сообщалось о SIGLEC 1-нокаутных мышах, которые были жизнеспособны, фертильны и без аномалий развития (Oetke et al. 2006). Однако у этих мышей наблюдались небольшие изменения популяций В- и Т-клеток и понижение уровня иммуноглобулина М.

[0009] Процесс инфекции ВРРСС начинается с первичного связывания с гепарансульфатом на поверхности альвеолярного макрофага. Затем происходит прочное связывание с сиалоадгезином (SIGLEC1, также обозначается CD169 или SN). Затем вирус интернализуется по клатрин-опосредованному эндоцитозу. Затем другая молекула - CD163, способствует обнажению вируса в эндосоме (Van Breedam et al. 2010a). Геном вируса высвобождается и происходит инфицирование клетки.

[0010] В CD163 имеется 17 экзонов, белок состоит из внеклеточной области с 9 цистеин-богатыми (SRCR) доменами фагоцитарных рецепторов, трансмембранного сегмента и короткого цитоплазматического хвоста. При различном сплайсинге одного гена получается несколько разных вариантов (Ritter et al. 1999а; Ritter et al. 1999b). В значительной степени это варьирование обусловлено длиной цитоплазматического хвоста.

[0011] CD163 выполняет ряд важных функций, включая действие в качестве фагоцитарного рецептора к гаптоглобину-гемоглобину. Элиминация свободного гемоглобина из крови является важной функцией CD163, поскольку группа гема может быть очень токсичной (Kristiansen et al. 2001). CD163 имеет цитоплазматический хвост, облегчающий эндоцитоз. Мутация этого хвоста приводит к снижению захвата комплекса гептоглобин-гемоглобин (Nielsen et al. 2006). Другие функции С163 включают адгезию эритробластов (SRCR2), работу в качестве рецептора TWEAK (SRCR 1-4 и 6-9), бактериального рецептора (SRCR5), рецептора вируса африканских свиней (Sanchez-Torres et al. 2003), а также возможную роль в качестве иммуномодулятора (обсуждалось в (Van Gorp et al. 2010a)).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] В одном аспекте, настоящее изобретение представляет собой генетически модифицированную свинью, у которой по меньшей мере инактивирован один аллель гена SIGLEC1 и/или инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).

[0013] Другой аспект настоящего изобретения представлен генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, полученного по способу, включающему энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере, один инактивированный аллель гена SIGLEC1; и активацию ооцита для получения эмбриона.

[0014] Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированной свинье, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному к связыванию и/или обнажению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), полученного по способу, включающему энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере, один инактивированный аллель гена CD163; и активацию ооцита для получения эмбриона.

[0015] В другом аспекте, настоящее изобретение является генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, полученного по способу, включающему спаривание самца генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с самкой генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1.

[0016] Другой аспект настоящего изобретения заключается в получении генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, полученного по способу, включающему спаривание самца генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере, один аллель гена CD163, с самкой генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена CD163.

[0017] Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированной свинье, полученной по любому из трех способов, у которой инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Первый такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Этот способ дополнительно включает спаривание друг с другом генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением Р2-потомства, и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163.

[0018] Второй такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, с получением F1-потомства, спаривание F1-потомства, чтобы получить Р2-потомство и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.

[0019] Третий такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.

[0020] Настоящее изобретение также относится к потомству любых описанных выше генетически модифицированных свиней, у которых: (1) по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован; (2) по меньшей мере, один аллель гена CD163 был инактивирован; (3) по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; или (4) оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы. В таком потомстве, у которого один или оба аллеля гена CD163 были инактивированы, инактивация приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).

[0021] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован. Способ включает энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена SIGLEC1; и активацию ооцита для получения эмбриона.

[0022] В еще одном аспекте, настоящее изобретение является способом получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Этот способ включает энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена CD 163; и активацию ооцита для получения эмбриона.

[0023] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой по меньшей мере оба аллеля гена SIGLEC1 были инактивированы. Способ включает спаривание самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1.

[0024] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному к связыванию и/или обнажению ВРРСС. Этот способ включает спаривание самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD 163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена CD163.

[0025] В еще одном аспекте, настоящее изобретение является способом получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Способ дополнительно включает спаривание друг с другом генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением Р2-потомства, и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1 и оба аллеля гена CD163.

[0026] Настоящее изобретение также относится к другому способу получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Этот способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, с получением F1-потомства, спаривание F1-потомства, чтобы получить Р2-потомство и скрининг F2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена СD163 инактивированы.

[0027] Настоящее изобретение также направлено на еще один способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC 1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.

[0028] В других аспектах, настоящее изобретение относится к потомству генетически модифицированной свиньи, полученному по любому из способов выше, у которого инактивированы один или оба аллеля гена SIGLEC1 и/или инактивированы один или оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD 163приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).

[0029] Другие цели и характеристики будут частично понятны и частично отмечены ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0030] На Фигуре 1 показано строение гена сиалоадгезина и схема нацеленного вектора. Фигуры 1А и 1В являются схематическими диаграммами, показывающими, что гены человеческого (Фиг. 1А) и мышиного (Фиг. 1В) сиалоадгезина состоят из 21 экзона и простираются приблизительно на 20 кб. На Фигуре 1С представлен мутационный анализ экзона 2 (ДНК-последовательность экзона 2 показана на Фигуре 1С под SEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательность, кодируемая экзоном 2, показана на Фигуре 1С под SEQ ID NO: 8). Мутационный анализ выявил 6 аминокислот, придающих связывание сиалоадгезина с лигандом (выделены обведенным/жирным текстом). На Фигуре 1D представлена схема нацеленного вектора, используемого для замены части экзона 1 и экзонов 2 и 3 SIGLEC1 на стоп-кодоны. В вектор также включена неомициновая кассета селекции (neo), управляемая промотором ФГК.

[0031] На Фигуре 2 показаны схема нацеленного вектора, строение гена сиалоадгезина и строение измененного гена сиалоадгезина.

[0032] На Фигуре 3 представлена фотография геля, показывающая ПЦР-скрининг для идентификации гена сиалоадгезина.

[0033] На Фигуре 4 представлена фотография геля, показывающая ПЦР-скрининг для идентификации равных количеств аллелей сиалоадгезина дикого типа и целевого типа.

[0034] На Фигуре 5 представлена структурная организация CD163 дикого типа (слева), содержащего 9 внеклеточных SRCR-доменов, 2 богатых пролином, серином и треонином (PST) домена, трансмембранную область и внутриклеточный цитоплазматический хвост. Генетически модифицированный CD163 представлен справа. Структурная организация домена остается такой же, за исключением того, что SRCR-домен 5 был заменен на SRCR-домен 8 из лиганда CD163 (CD163L).

[0035] На Фигуре 6 представлен вектор нацеливания CD163, в котором плечи вектора являются участками ДНК с последовательностью, идентичной природному CD163 или дикого типа, что позволяет отжиг вектора с CD163, уже присутствующим в клетках. Модифицированная ДНК, которая находится между двумя плечами CD163 затем может быть внедрена в клетки ДНК посредством гомологической рекомбинации.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0036] «Нокаутная свинья» представляет собой генетически модифицированную свинью, у которой было изменено функционирование одного или обоих аллелей гена, к примеру, путем частичной или полной делеции гена. Если один аллель гена нокаутирован, то свинья гетерозиготна по нокаутированному гену; если нокаутированы оба аллеля, то свинья гомозиготна по нокаутированному гену.

[0037] Термин «донорская клетка» обозначает клетку, от которой происходит ядро или материал хроматина, используемые для ядерной передачи. Как описано в других местах данного документа, ядерная передача может включать перенос ядра или хроматина, выделенных из донорской клетки, или перенос всей донорской клетки, включая ядро или материал хроматина.

[0038] Термин «генная модификация» обозначает одно или более изменений генной последовательности (включая кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, такие как последовательности интронов, промоторов и 5' и 3'-нетранслируемые последовательности), которые изменяют экспрессию или активность гена. Такие модификации включают, к примеру, инсерции (например, гетерологических последовательностей, таких как селектируемые маркеры и/или сигналы останова), делеции, мутации сдвига рамки считывания, бессмысленные мутации, миссенс-мутации, точечные мутации или их комбинации.

[0039] Термин «реципиентная клетка» обозначает клетку, в которую вводится донорская клетка, ядро донорской клетки или хроматин донорской клетки. Реципиентные клетки перед ядерной передачей энуклеируются подходящим способом. Примеры реципиентных клеток включают ооциты, зиготы и клетки двухклеточных эмбрионов.

[0040] «Малые интерферирующие РНК» (миРНК) обозначают двухнитевые молекулы РНК, обладающие способностью специфически влиять на экспрессию белка. миРНК обычно имеют от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. Длина молекулы миРНК основывается на длине антисмысловой цепи молекулы миРНК.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

[0041] Настоящее изобретение направлено на генетически модифицированных свиней, резистентных к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Инфекционная способность ВРРСС зависит от трех специфических медиаторов проникновения: (1) первоначальное связывание с гепарансульфатом, (2) связывание/интернализация сиалоадгезином (SIGLEC1), и (3) интернализация/обнажение вируса, оказываемые CD163. Таким образом, предотвращение взаимодействия между ВРРСС и SIGLEC1 и/или ВРРСС и CD163 приводит к невозможности ВРРСС инфицировать хозяина. В связи с этим, настоящее изобретение направлено на генетически модифицированную свинью, у которой по меньшей мере инактивирован один аллель гена SIGLEC1 и/или у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Эти свиньи также могут называться нокаутными по SIGLEC 1 и/или CD163 свиньями.

[0042] Изобретение включает свиней, у которых только один аллель целевого гена (SIGLEC 1 и/или CD163) был инактивирован, а другой остался неизменным. Эти животные, называемые в данном документе «гетерозиготными» или «гемизиготными» животными могут использоваться в подходах к разведению для получения гомозиготных мутантов. Также в изобретение включены гомозиготные мутантные свиньи, у которых инактивированы оба аллеля целевого гена по одному или разным способам. Соответственно, настоящее изобретение включает генетически модифицированных свиней, у которых: (1) один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован; (2) один аллель гена CD163 был инактивирован; (3) оба аллеля гена SIGLEC1 были инактивированы; (4) оба аллеля гена CD163 были инактивированы; (5) оба аллеля гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; (6) один аллель гена SIGLEC 1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы; (7) один аллель гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; или (8) оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы. В каждом из этих случаев и в общем контексте настоящей заявки, инактивация аллеля(ей) CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).

[0043] Нацеливание на ген с целью получения животных по изобретению может привести к инактивации гена посредством разрушения, удаления, изменения или перемещения последовательностей целевого гена. Способы инактивации гена хорошо известны в данной области техники. К примеру, целевой ген может быть инактивирован внедрением гетерологической последовательности (такой как селектируемый маркер и/или стоп-кодон) в целевой ген, делецией части гена или всего гена, изменением гена (например, мутацией рамки считывания, бессмысленной мутацией, миссенс-мутацией, точечной мутацией, заменой части гена или всего гена на другую нуклеиновокислотную последовательность) или комбинацией любого из вышеперечисленного.

[0044] Внедренные последовательности могут заменить ранее существующие последовательности в гене или могут быть добавлены к таким последовательностям, в зависимости от схемы целевой конструкции. Схема целевых конструкций может быть изменена, в зависимости от того, необходимо ли полностью нокаутировать функцию гена или поддерживать сниженный уровень функционирования. В случае SIGLEC1, желателен полный нокаут функции. В качестве примера и, не ограничиваясь описанным, ген SIGLEC1 может быть нокаутирован делецией части экзона 1 и всех экзонов 2 и 3, к примеру, заменой части экзона 1 и всех экзонов 2 и 3 на неомицин-селектируемую кассету. В некоторых воплощениях модифицирование может также включать добавление LoxP-сайтов с любой стороны последовательности мутируемого гена SIGLEC1. В некоторых случаях нацеленная конструкция может содержать оба loxP-сайта, фланкирующие внедряемую последовательность и CRE-рекомбиназу. В других случаях может использоваться двухвекторная система, в которой нацеленная конструкция включает loxP-сайты, фланкирующие внедряемую последовательность, а второй вектор включает трансген, кодирующий CRE-рекомбиназу. Трансген для CRE-рекомбиназы может располагаться под влияние тканеспецифического промотора, так чтобы его экспрессия отображала ген SIGLEC1, который нефункционален в конкретных клеточных линиях. Аналогичным образом, антибиотик-селектируемая кассета может быть фланкирована loxP-сайтами так, чтобы она могла быть удалена на более позднем этапе при помощи Cre-рекомбиназы.

[0045] В случае CD163, желательно инактивировать только его функцию ВРРСС-связывания и/или его обнажения, оставляя другие функции CD163 минимально затронутыми или незатронутыми. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что полностью нокаутные по CD163 особи могут быть нежизнеспособными или серьезно скомпрометированными по причине роли, которую играет CD163 в связывании и интернализации комплексов гемоглобин-гаптоглобин. Соответственно, CD163 может быть деактивирован разрушением пятого N-терминального фагоцитарного богатого цистеином (SRCR) домена CD163, для которого было показано, что он играет роль в ВРРСС-инфекции (Van Gorp et al., 2010), оставляя остальные домены незатронутыми. SRCR домен 5 может быть генетически модифицирован, например, внедрением точечных мутаций, которые изменяют структуру этого домена или обменом этого домена на другой. К примеру, SRCR домен 5 может быть замещен на SRCR домен 8 из CD163 лиганда (CD163L), поскольку этот «обмен» домена, как было показано, снижает относительную инфекционность ВРРСС до 0% в культивированных клетках (Van Gorp et al 2010).

[0046] По другим подходам, кодирующие последовательности целевого гена не изменяются или изменяются минимально, а взамен нацеливание производится на последовательности, влияющие на экспрессию целевого гена, такие как промоторные последовательности. В любом случае, инсерция селектируемого маркера часто желательна для облегчения идентификации клеток, в которых произошло нацеливание. При необходимости, такие маркеры или иные внедренные последовательности могут быть позднее удалены, например, при помощи Cre-Lox или аналогичных систем.

[0047] При модифицировании целевого гена используются нуклеиновокислотные конструкции с участками гомологии с целевым геном (например, SIGLEC1 или CD163) или с фланкирующими областями целевого гена, так чтобы интегрирование конструкций в геном изменяло экспрессию гена, изменением последовательности гена и/или изменением уровней экспрессии гена. Таким образом, для изменения гена нацеленная конструкция обычно разрабатывается так, чтобы она включала три основные области: (i) первую область, которая гомологична целевому локусу, на который производится нацеливание (например, ген SIGLEC1 или CD163, либо их фланкирующая последовательность), (ii) вторую область, представляющую собой гетерологическую полиуклеотидную последовательность (например, кодирующую селектируемый маркер, такой как белок резистентности к антибиотику), которая специфически замещает часть локуса нацеливания или внедрена в локус нацеливания и (iii) третью область, которая, подобно первой области, гомологична локусу нацеливания, но обычно не смежна с первой областью конструкции. Гомологическая рекомбинация между нацеленной конструкцией и локусом нацеливания дикого типа приводит к делеции любых локусных последовательностей между двумя областями гомологии, отраженными в нацеленном векторе и замещению этой последовательности на гетерологическую последовательность (например, гетерологической последовательности, кодирующей селектируемый маркер) или внедрению ее внутрь той последовательности. Типичные конструкция и вектор для выполнения такого нацеленного модифицирования описаны в Примере 1; тем не менее, известны другие векторы, которые могут применяться по таким подходам, и которые с легкостью могут быть адаптированы для использования по изобретению.

[0048] Чтобы облегчить гомологическую рекомбинацию, первая и третья области нацеленных векторов (см. выше) включают последовательности, которые проявляют значительную идентичность последовательности с генами, на которые они нацелены (или фланкирующими областями). К примеру, первая и третья области нацеленных векторов могут иметь последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 80% по меньшей мере приблизительно на 90% по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 98% по меньшей мере приблизительно на 99% или приблизительно на 100% идентичны целевым генам или фланкирующим областям. Идентичность последовательности обычно измеряют при помощи BLAST® (Средство поиска основного локального выравнивания) или BLAST®2 с параметрами по умолчанию, указанными там (см. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250, 1999). Таким образом, последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 80% по меньшей мере приблизительно на 90% по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 98%) по меньшей мере приблизительно на 99% или даже приблизительно на 100%) идентичны последовательностью локусам целевых генов могут использоваться по изобретению для облегчения гомологической рекомбинации.

[0049] Общий размер двух гомологических областей (т.е., первой и третьей областей, описанных выше) может составлять, к примеру, от приблизительно 2 килобаз (кб) до приблизительно 25 кб (например, от приблизительно 4 кб до приблизительно 20 кб, от приблизительно 5 кб до приблизительно 15 кб, или от приблизительно 6 кб до приблизительно 10 кб). Размер области, заменяющей часть целевого локуса или внедряемой в целевой локус (вторую область, описанную выше), может составлять, к примеру, от приблизительно 0,5 килобаз (кб) до приблизительно 5 кб (например, от приблизительно 1 кб до приблизительно 4 кб или от приблизительно 3 кб до приблизительно 4 кб).

[0050] Могут применяться различные способы доставки нацеленной конструкции. Для доставки нацеленной конструкции могут использоваться способы клеточной трансфекции, включая кальций-фосфатную, липофекцию, электропорацию и инъекцию ядра. Если ген является транскрипционно активным в используемом типе клетки, то может применяться стратегия беспромоторного селектируемого маркера, так, чтобы устойчивость к антибиотику формировалась только